Un approccio per la valutazione optogenetic Formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di stabilire un sistema di co-coltura per valutare la capacità dei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane di formare connessioni funzionali mediante un approccio genico basato sulla stimolazione luminosa dei neuroni in coltura tramite channel RUSIN two o CR two. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto cellule progenitrici neurali primarie di topo, o NPC, e permettendo loro di differenziarsi in astrociti. Successivamente, neuroni corticali primari di ratto vengono trasfettati con CH R two e seminati sullo strato di astrociti, che funge da popolazione neuronale esistente.

Successivamente, le NPC umane derivate da colture di cellule staminali pluripotenti indotte o colture di IPSC vengono transdotte con il virus synapsin one 2D tomato e quindi posizionate sulla coltura di neuroni astrocitari e indotte a differenziarsi, formando successivamente connessioni sinaptiche. I risultati mostrano che i neuroni derivati da IPSC formano connessioni sinaptiche con neuroni corticali di ratto, come dimostrato da registrazioni elettrofisiologiche di correnti postsinaptiche nei neuroni derivati da IPSC in seguito a stimolazione foto-genetica dei neuroni corticali esprimenti CHR two. Il vantaggio principale di questo metodo rispetto ai metodi esistenti, come quelli che prevedono la cocoltura di soli astrociti con neuroni umani derivati da IPSC, è che il tempo di maturazione di questi neuroni umani è più breve.

Questo perché la presenza di neuroni primari può accelerare la maturazione di questi neuroni umani. A dimostrazione della procedura sarà presente Uni Chin, studentessa laureanda del mio laboratorio, e Y dell'Università di George Augustine. Dopo aver prelevato i cervelli di ratto embrionali e isolato il tessuto corticale secondo il protocollo indicato, trasferire il tessuto corticale in una piastra contenente la soluzione di digestione del tessuto corticale preriscaldata. Triturare il tessuto corticale nel modo più fine possibile prima di incubarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, trasferire il tessuto corticale in un tubo da centrifuga da 50 millilitri e dissociare il tessuto utilizzando una pipetta serologica fino a ottenere una soluzione omogenea priva di frammenti di tessuto.

Filtrare la soluzione tissutale attraverso un filtro cellulare da 70 micron per rimuovere eventuali aggregati di tessuto residui. Aliquotare tre millilitri di soluzione in provette da 15 millilitri. Centrifugare le provette.

Aggiungere 800 microlitri di BSA al 7,5% in un XPBS sul fondo di ogni tubo, formando uno strato sotto lo strato di tessuto; centrifugare a 200 G per cinque minuti. Rimuovere quindi il soprannatante aspirando dall'interfaccia tra i due strati. Evitare di disturbare il pellet di selp sul fondo del tubo.

Dopo aver utilizzato un millilitro di mezzo neuronale primario per risospendere ogni piastra cellulare, unirle tutte in un tubo da centrifuga da 15 millilitri. Quindi utilizzare un emocitometro per determinare la densità cellulare e centrifugare 6 milioni di neuroni corticali di ratto a 200 G per cinque minuti, rimuovendo il soprannatante.

Sono necessari almeno 6 milioni di neuroni corticali per l'elettroporazione. Per garantire la formazione di una rete neuronale da parte dei neuroni sopravvissuti, aggiungere 100 microlitri di soluzione per elettroporazione al pellet cellulare e risospendere delicatamente. Successivamente, combinare 100 microlitri della sospensione cellulare con sei microgrammi di plasmide CR due e trasferire il tutto in un vet certificato.

Selezionare e applicare il programma appropriato per l'elettroporazione seguendo le istruzioni del produttore. Dopo l'elettroporazione, aggiungere 500 microlitri di MEM al vet. Trasferire le cellule in 11,5 millilitri di mezzo per neuroni primari e risospendere delicatamente.

Quindi aggiungere 500 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente astrociti murini. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Dopo aver generato cellule staminali pluripotenti indotte o IPC, indurre e mantenere le cellule come coltura di cellule progenitrici neurali umane o NPC secondo il protocollo descritto nel testo.

In questo esempio, le NPC vengono marcate utilizzando il vettore lentivirale synapse in un TD tomato il giorno successivo all'aggiunta dei neuroni primari a una coltura di astrociti. Utilizzare un XPBS per lavare una volta le NPC umane, quindi aggiungere la soluzione di distacco cellulare e incubare per cinque minuti a 30 gradi Celsius. Assicurarsi che tutte le cellule si siano staccate.

Quindi trasferirli in un tubo da 15 millilitri contenente il doppio della quantità di D-M-E-M-F 12 e centrifugare a 200 G per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante e utilizzare il mezzo di differenziamento neuronale per risospendere delicatamente il pellet in cellule singole. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule.

Successivamente, aspirare con attenzione il mezzo dalla piastra delle colture di neuroni corticali e astrociti. Le NPC umane a 5.000 cellule per centimetro quadrato per pozzetto in mezzo di differenziamento neuronale. Incubare a 37 gradi Celsius e 5%CO2, e sostituire il mezzo ogni due o tre giorni per almeno 28 giorni.

Per verificare se gli IPC umani si comportano come neuroni maturi, utilizzare un microscopio confocale dotato di un obiettivo a immersione in acqua da 60x per individuare le cellule differenziate da IPC umani. Visualizzando TD tomato. Tirare una pipetta di registrazione fino a raggiungere una resistenza compresa tra quattro e sei ohm e perfondere.

Le cellule a temperatura ambiente in una soluzione esterna continuamente saturata con 95%ossigeno, 5%anidride carbonica. Utilizzare una soluzione interna per riempire la micropipetta di registrazione, effettuare un'ampolla su una cellula positiva per TD tomato in modalità cellula intera e registrare la generazione di potenziali d'azione in risposta all'iniezione di corrente in regime di blocco della corrente. Per confermare che il potenziale d'azione delle cellule corticali che esprimono CHR due viene evocato in modo affidabile dalla stimolazione luminosa.

Per prima cosa, individuare le cellule corticali che esprimono CR due mediante la visualizzazione di GFP attraverso l'illuminazione con una lampada a arco di mercurio, utilizzando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 480 su 40 nanometri. Verificare che un potenziale d'azione venga generato in modo affidabile tramite la registrazione in modalità clamp di corrente in modalità cella intera. Per eseguire la stimolazione genica, effettuare il patch di una cellula positiva per TD tomato in modalità cella intera e impostare il clamp di tensione a meno 70 millivolt utilizzando la lampada a mercurio su tutto il campo e un filtro di eccitazione di 480 su 40.

Stimolare l'intero campo per 30 secondi. Registrare le correnti postsinaptiche o PSC di una cellula patchata indotte dalla stimolazione fotoptica di neuroni corticali presinaptici esprimenti CHR2. Impostare la soglia per l'ampiezza e l'area delle correnti a cinque picoampere qui e PICO rispettivamente, ispezionando manualmente questi eventi per scartare eventuali tracce non relative a PSC.

Come dimostrato in questo video, sono necessari diversi passaggi per generare la coltura co-coltivata di neuroni derivati da IPC, neuroni corticali primari e astrociti. Questa immagine mostra che al secondo giorno di differenziamento delle NPC murine in astrociti, è possibile osservare con facilità astrociti positivi per la proteina acida fibrillare gliale, o GFAP. Le NPC murine sono state lasciate differenziare per almeno una settimana prima di seminare i neuroni corticali, esprimenti CR due, sul monolayer di astrociti, e entrambi vengono identificati in questa co-coltura mediante colorazione immunofluorescente per GFAP e CHR due.

Dopo tre o quattro settimane di differenziazione delle NPC umane, neuroni positivi al TD tomato sono stati rilevati nelle colture come mostrato qui. Quando stimolati dalla luce, potenziali d'azione sono stati generati nei neuroni corticali che esprimono CHR due IPSC. I neuroni derivati sono inoltre eccitabili, mostrando un aumento dell'attività elettrica.

Potenziale di sparo man mano che l'ampiezza degli impulsi di corrente depolarizzante aumentava. In assenza di luce, i neuroni derivati da IPSC ricevevano input sinaptici spontanei. Queste correnti postsinaptiche entranti erano prevalentemente mediate da recettori AMPA.

La stimolazione luminosa dei neuroni corticali è stata mantenuta per tutta la durata del 32° lungo impulso di luce, mentre la frequenza dei PSC era aumentata. Quando i neuroni corticali esprimenti CHR2 sono stati stimolati con la luce, la loro ampiezza non è risultata alterata. Dopo questa procedura, possiamo utilizzare altri sistemi di co-coltura con diversi tipi cellulari specifici del paziente per rispondere ad ulteriori domande, come l'effetto di composti farmacologici candidati su malattie specifiche di interesse.