Name: Un approccio per la valutazione optogenetic Formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Impara a valutare le connessioni sinaptiche tra neuroni derivati da iPSC e neuroni corticali primari utilizzando un sistema di co-coltura con stimolazione optogenetica. Questo metodo accelera la maturazione neuronale.

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Ringraziamo K. Deisseroth e S. Je per i costrutti lentivirali ChR2 e Synapsin1-tdTomato rispettivamente C. Chai per la condivisione di know-how e il protocollo sulla generazione iPSC, WY Leong per il supporto tecnico, i membri del laboratorio Goh per la condivisione di reagenti e competenze. Questo lavoro è stato sostenuto da Abbott Nutrition e il Centro Accademico di Eccellenza (ACE) premio di ricerca da GlaxoSmithKline (GSK) per ELG, dal National Research Foundation di Singapore sotto la sua Competitive Research Program (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) a ELG e GJA, e dalla Classe World Institute (WCI) Programma della Fondazione di Ricerca Nazionale di Corea (NRF), finanziato dal Ministero dell&#39;Istruzione, della Scienza e della Tecnologia di Corea (MEST) (NRF Concessione numero: WCI 2009-003) a GJA

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Optogenetics fornisce precisione spaziale e temporale per l&#39;attivazione di popolazioni di neuroni definiti 13. Nei nostri esperimenti, l&#39;intero campo dell&#39;obiettivo del microscopio è stato illuminato per 30 secondi per foto-stimolare solo neuroni corticali esprimono ChR2. Questo ci ha permesso di determinare se le connessioni sinaptiche sono formate tra le diverse popolazioni di neuroni all&#39;interno della co-coltura. I nostri risultati hanno rivelato che fotostimolazione aumenta la frequenza PSC in neuroni iPSC-derivati, il che dimostra che questi neuroni ricevono input sinaptico dei neuroni corticali presinaptici esprimono ChR2. Questo, a sua volta, ha stabilito che i neuroni iPSC-derivati ​​incorporati con successo nei circuiti con i neuroni corticali. Ci sono diversi passaggi critici per la generazione di questo sistema di co-coltura. È importante assicurare che le colture di astrociti topo NPC-derivati ​​sono sani, con morte cellulare minima, prima di procedere con la placcaturadi altri tipi di cellule. Neuroni corticali e NPC umani attaccano bene su astrociti sani e registrazioni elettrofisiologiche dipendono fortemente dalle condizioni di coltura. Gli altri passaggi fondamentali in questo protocollo sono l&#39;elettroporazione e la placcatura dei neuroni corticali in colture di astrociti. Come un gran numero di cellule muoiono dopo l&#39;elettroporazione, è importante assicurare che almeno 6 milioni di neuroni corticali sono elettroporate per la placcatura in colture astrociti in piastre da 24 pozzetti. Abbiamo osservato che quando sono state elettroporate meno di 6 milioni di cellule, il numero di neuroni che sopravvivono non formano una rete neuronale densa, che ha colpito registrazioni elettrofisiologiche. Il numero di neuroni corticali elettroporate dovrebbe essere coerente per ogni esperimento di co-coltura per consentire il confronto tra i diversi studi. Per tutte le iniziative che coinvolgono la digestione enzimatica, è fondamentale non lasciare le cellule in soluzione digerente troppo a lungo in quanto può portare alla morte cellulare. Questoapproccio può essere utilizzato per schermare la capacità di neuroni derivati ​​da fibroblasti specifici del paziente per formare contatti sinaptici con altri neuroni. I neuroni derivati ​​da fibroblasti di pazienti affetti da disturbo dello sviluppo neurologico Sindrome di Rett (RTT) presentano difetti di trasmissione sinaptica: neuroni RTT mostrano una significativa riduzione della frequenza PSC ed ampiezza rispetto a neuroni sani, presumibilmente a causa della minore connettività sinaptica 14. Il nostro sistema di co-coltura permette esame degli effetti dei farmaci sui neuroni che mostrano difetti di sviluppo. Questo può essere effettuato tramite l&#39;aggiunta di composti di interesse durante la semina di NPC umani malate nonché durante l&#39;esposizione continua a composti per tutto il tempo di differenziazione neuronale. Mentre questo sistema di co-coltura può anche essere utilizzato come modello per il test della droga, un limite di questo approccio è che il processo di studio degli effetti di ciascun composto candidato può essere lunga e noiosa comenon è un metodo di screening ad alto rendimento. Dopo il trattamento con i composti candidati, neuroni COPSI derivate devono essere patch individualmente per determinare gli effetti di ciascun composto in PSC. Inoltre, ci sono attualmente non sono molti fibroblasti disponibili e iPSCs di pazienti. Pertanto, sarà di interesse nel prossimo futuro di avere cellule più pazienti e anche di adattare questo protocollo per lo screening ad alta produttività. Ad esempio, etichettando neuroni COPSI-derivati ​​con un indicatore di attività, quali sensori geneticamente codificati di ioni o potenziale di membrana, sarebbe possibile aumentare la velocità di flusso sostanzialmente by-side passo della procedura elettrofisiologica richiede tempo. Come l&#39;intero processo di generazione di questo sistema di co-coltura, dalla riprogrammazione fibroblasti di eseguire registrazioni elettrofisiologiche, richiede più di 90 giorni, si raccomanda che sia le iPSCs o NPC umani essere ampliato, dopo la riprogrammazione e fasi di induzione neurale, rispettivamente,e crioconservati per ridurre il tempo necessario per futuri esperimenti. Nei nostri esperimenti, abbiamo espresso ChR2 in neuroni corticali sotto il promotore synapsin1. Perché questo promotore è pan-neuronale, siamo stati presumibilmente fotostimolante entrambi i neuroni corticali inibitorie ed eccitatorie. Se l&#39;obiettivo di esperimenti futuri è interrogare specificamente circuiti sia inibitori o eccitatori, potrebbero essere utilizzati promotori più specifici. In alternativa, i neuroni corticali potrebbero essere ottenuti da transgenici (o virus iniettato topi), dove l&#39;espressione ChR2 è specificamente mirato a sottopopolazioni geneticamente definiti di neuroni. Ad esempio, i tessuti corticali raccolta da un mouse che ha Cre ricombinasi espresse in interneuroni-parvalbumin contenente (interneuroni PV) che viene attraversato con un mouse con floxed ChR2 produrrà una situazione in cui gli unici neuroni corticali esprimenti ChR2 saranno interneuroni PV 15. L&#39;uso di tali ChR2 esprimono interneuroni nella nostra co-cuSistema lture consentirà determinare se una patch neurone iPSC-derivato è in grado di integrare in un circuito con interneuroni fotovoltaici. Sulla base di uno studio precedente 9, neuroni corticali sono maturi con dendriti sovrapposizione dopo 14 giorni in vitro. Così, se fotostimolazione non suscita una risposta da un neurone patch COPSI-derivata, esso dovrebbe indicare che il neurone non ha la capacità di effettuare connessioni sinaptiche con neuroni corticali. Un neurone iPSC-derivato è in grado di ricevere input sinaptico o da altri neuroni iPSC-derivati ​​o neuroni corticali. Se sono stati usati toppa tradizionale registrazioni clamp, non sarebbe possibile distinguere se l&#39;ingresso sinaptica proviene. Il vantaggio del nostro sistema è che le risposte post-sinaptici di ingresso presinaptica corticale possono essere selettivamente evocati e identificati. Le procedure descritte qui forniscono un approccio semplice per valutare la capacità dei neuroni COPSI derivate integrarein una rete neuronale definito.

Negli ultimi anni, la nostra comprensione del neurone e la funzione del circuito neuronale è stato rivoluzionato da diversi strumenti optogenetic che controllano l&#39;eccitabilità neuronale. Uno di questi strumenti è il canale cationico luce attivato, channelrhodopsin-2 (ChR2): i neuroni che esprimono ChR2 potenziali d&#39;azione il fuoco in risposta alla stimolazione luminosa 1-3. Perché i neuroni non sono normalmente sensibili alla luce, questa notevole capacità apre nuove strade per il controllo preciso temporale e spaziale delle attività delle popolazioni geneticamente definiti di neuroni 4 e ha notevolmente accelerato studi di funzione cerebrale. ChR2 è stata applicata a ricerca sulle cellule staminali per scopi diversi, dal monitoraggio dello sviluppo neuronale 5 a regolare l&#39;attività delle reti neurali 6. Qui abbiamo usato ChR2 per aumentare l&#39;utilità di un sistema di co-coltura neuronale. Sistemi di co-coltura consentono la valutazione delle interazioni tra diversi tipi di cellule.Co-colture di neuroni e glia, i principali tipi di cellule del sistema nervoso, sono comunemente usati per studiare segnalazione tra questi diversi tipi di cellule, come pure per valutare la significatività di questa segnalazione per le risposte fisiologiche, la propagazione del danno e per esaminare la meccanismi molecolari che sono potenzialmente coinvolti in questa segnalazione 7. Un precedente studio ha rivelato che iPSCs umani si differenziano molto rapidamente in neuroni in presenza di ratto coltura contenente neuroni corticali primarie, astrociti, oligodendrociti, microglia e 8. In questo protocollo, dimostriamo un metodo che utilizza ChR2 in un sistema di co-coltura di interrogare connessioni sinaptiche tra i neuroni corticali di ratto e neuroni derivati ​​da cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs). Descriviamo passi di sezionare e raccolto tessuti cerebrali 9, nonché per mantenere e differenziare le cellule progenitrici neurali topo (NPC) in astrociti e NPC umani INTo neuroni per creare il sistema di co-coltura. Per stabilire questo sistema di co-coltura, abbiamo utilizzato il metodo di riprogrammazione senza integrazione descritto da Okita et al. 10 per generare iPSCs umani. Questi iPSCs stati poi efficacemente differenziati in NPC in condizioni chimicamente definite utilizzando inibitori piccole molecole come descritto da Li et al. 11 In co-culture, le diverse popolazioni di neuroni possono essere identificate tramite il rilevamento di espressione ChR2 in neuroni corticali e tagging dei neuroni iPSC-derivati ​​tramite la proteina fluorescente, tandem dimero pomodoro (tdTomato). Combinando registrazioni elettrofisiologiche da neuroni COPSI-derivati ​​con fotostimolazione optogenetic dei neuroni corticali consente di valutare la capacità di questi due tipi di neuroni per formare circuiti con l&#39;altro. In particolare, fotostimolazione di ChR2 esprimono neuroni corticali evocare risposte sinaptiche nei neuroni iPSC-derivati ​​che si sono formati i circuiti sinapticicon la rete neurone corticale fotostimolata. Abbiamo dimostrato che l&#39;aumento delle correnti postsinaptiche sono infatti rilevati in neuroni iPSC-derivati ​​in tali condizioni. Questo protocollo permette di valutare circuiteria sinaptica sotto una varietà di condizioni sperimentali, inclusi ricapitolazione diversi modelli di malattie neurologiche utilizzando iPSCs derivati ​​da fibroblasti da pazienti con malattia.

<table><tbody><tr><td>Kit per la proliferazione di Neurocult (Mouse)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5702</td><td>Contiene il Terreno basale NSC e l'integratore per la proliferazione delle NSC</td></tr><tr><td>Epi5 Kit di riprogrammazione iPSC episomiale</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>12719F</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Medium neurobasale</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>MEM senza glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>11090081</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>integratore GlutaMAX</td><td>Invitrogen 35050061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Human LIF</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9484</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130103926</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td></td></tr><tr><td>Compound E</td><td>Merck Millipore</td><td>565790</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck Millipore</td><td>324856</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233FB025</td><td></td></tr><tr><td>Research Grade FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30160.03</td><td>Per il mezzo di differenziazione degli astrociti</td></tr><tr><td>Definito FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>Per il mezzo del neurone primario</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td></td><td>Sigma G8270</td><td>Per il mezzo del neurone primario</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>eparina</td><td>EMD Millipore</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>papaina</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>per cervelli di raccolta</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteina</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>70 &; filtro cellulare m</td><td>BD Biosciences&nbsp; &nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; m unità filtrante</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fluka</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G7520</td><td>Per studi elettrofisiologici</td></tr><tr><td>K-gluconato</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>KANTO Chemical</td><td>3234400</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Per studi elettrofisiologici</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato World</td><td>precision instruments, Inc</td><td>1604323</td><td></td></tr><tr><td>provetta da centrifuga da 15 ml</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>352096</tr><tr><td>provetta da centrifuga da 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>piastre da 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>9761146</td><td></td></tr><tr><td>piastre da 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>Palloni T25</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>vetri di copertura da 12 mm</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111520</td><td></td></tr><tr><td>AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit& nbsp;</td><td>Lonza</td><td>VPG1003</td><td>Per l'elettroporazione dei neuroni corticali primari</td></tr><tr><td>Sistema di trasfezione al neon.</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>Per l'elettroporazione di fibroblasti umani</td></tr><tr><td>Mini Analisi&nbsp;</td><td>Synaptosoft</td><td>Mini Analysis v.6</td><td>Per la misurazione di PSC</td></tr><tr><td>Fibroblasti umani dermici normali</td><td>PromoCell</td><td>C12300</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE</td><td>Addgene</td><td>20945</td><td></td></tr><tr><td>Lampada ad arco corto</td><td>al mercurio OSRAM</td><td>HBO 103 W/2</td><td></td></tr></tbody></table>

un approccio per la valutazione optogenetic formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Qui descriviamo un protocollo per generare una co-coltura composta da 2 diverse popolazioni neuronali. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) vengono riprogrammate da fibroblasti umani utilizzando vettori episomiali. Colonie di iPSC possono essere osservate 30 giorni dopo l'inizio della riprogrammazione dei fibroblasti. Le colonie pluripotenti vengono raccolte manualmente e coltivate in mezzo di induzione neurale per consentire la differenziazione in cellule progenitrici neurali (NPC). Le iPSC si convertono rapidamente in cellule neuroepiteliali entro 1 settimana e mantengono la capacità di autorinnovarsi se mantenute ad un'alta densità di coltura. Le NPC primarie di topo sono differenziate in astrociti dall'esposizione a un terreno contenente siero per 7 giorni e formano un monostrato su cui vengono aggiunti i neuroni corticali di ratto embrionali del giorno 18 (E18) (trasfettati con canalrodopsina-2 (ChR2)). Le NPC umane marcate con la proteina fluorescente, il pomodoro tandem dimero (tdTomato), vengono quindi seminate sulla coltura di astrociti/neuroni corticali il giorno successivo e lasciate differenziare per 28-35 giorni. Dimostriamo che questo sistema forma connessioni sinaptiche tra i neuroni derivati da iPSC e i neuroni corticali, evidenti da un aumento della frequenza delle correnti sinaptiche in seguito alla fotostimolazione dei neuroni corticali. Questo sistema di co-coltura fornisce una nuova piattaforma per valutare la capacità dei neuroni derivati da iPSC di creare connessioni sinaptiche con altre popolazioni neuronali.

Qui, un protocollo che descrive i diversi passaggi necessari per generare una co-coltura costituito astrociti, neuroni corticali e neuroni umani è illustrato. IPSCs umani sono stati ottenuti riprogrammando fibroblasti utilizzando vettori episomiale 10 e specificati in un lineage neurale con un cocktail di inibitori di piccole molecole, rendendo NPC 11 che sono stati mantenuti ad alta densità (Figura 1A). Diversi passi sono necessari per generare il co-coltura: differenziazione dei NPC topo in astrociti, placcatura di ratto neuroni corticali esprimono ChR2, e semina di NPC umani taggati con tdTomato (Figura 1B). Al giorno 2 di differenziazione, gliale fibrillare acida Protein (GFAP) + astrociti possano essere prontamente rilevate nelle nostre culture (Figura 1C). Mouse NPC è stato permesso di differenziare per almeno una settimana prima di placcatura neuroni corticali esprimono ChR2 sul monostrato astrociti (Figura 1D). Dopo 3a 4 settimane di differenziazione NPC umana, tdTomato + neuroni sono stati individuati nelle culture (Figura 1E). Questo sistema di co-coltura consente il rilevamento coerente di correnti provenienti da singoli neuroni postsinaptici COPSI-derivati ​​in risposta alla stimolazione luminosa (Figura 2A). Quando stimolata dalla luce, potenziali d&#39;azione sono stati generati in neuroni corticali esprimono ChR2 (Figura 2B). iPSC-derivati ​​neuroni sono eccitabili (Figura 2C), che mostra un aumento del potenziale d&#39;azione di tiro come l&#39;ampiezza di impulsi di corrente depolarizzante è stato aumentato (Figura 2D). Così, queste cellule mature presentano proprietà neuronali. In assenza di luce, i neuroni iPSC-derivati ​​hanno ricevuto ingressi sinaptici spontanei (Figura 2E). Queste correnti verso l&#39;interno postsinaptiche sono stati prevalentemente mediati dai recettori AMPA, perché le correnti attraverso i recettori GABA sarebbe andata e recettori NMDA non portano corrente unt il potenziale di -70 mV in possesso. Almeno alcuni di questi ingressi erano di neuroni corticali presinaptici esprimono ChR2, perché stimolazione luminosa aumenta notevolmente la frequenza di correnti postsinaptici (figura 2E). La durata di questo aumento di ingresso sinaptica è mostrato in Figura 2F: fotostimolazione dei neuroni corticali è stato sostenuto tra 30 sec luce flash lungo. Mentre la frequenza di PSC era elevato quando ChR2 esprimenti neuroni corticali stati fotostimolata (figura 2G), l&#39;ampiezza è stata influenzata (Figura 2H). In sintesi, questi risultati indicano che i neuroni iPSC-derivati ​​esposti maturi proprietà neuronali e potrebbero formare connessioni sinaptiche con neuroni corticali presinaptici. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> Figura 1: diagrammi schematici per la generazione di co-colturasistema. (A) Timeline per riprogrammare fibroblasti umani in iPSCs e induzione neurale di NPC. (B) Timeline per la differenziazione terminale di NPC umani in neuroni maturi sui neuroni e astrociti culture corticali. (C) del mouse NPC rapidamente differenziarsi in GFAP + astrociti dopo 2 giorni in vitro. (D) Dopo una settimana, neuroni corticali esprimono ChR2 stati placcati su GFAP + astrociti. (E) Alle 4 a 5 settimane dopo la differenziazione di NPC umani, registrazioni elettrofisiologiche sono stati eseguiti su tdTomato + neuroni. Barre di scala rappresentano 100 micron. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> Figura 2: analisi optogenetic della connettività sinaptica funzionale. (A) iPSC-derivato cellule taggati con tdTomato (rosso) sono stati co-coltura con neuroni corticali che esprime la luce attivatoCanale, ChR2 (verde). Le registrazioni da neuroni iPSC-derivati ​​rivelato correnti (PSC) risposte post-sinaptici, che potrebbero venire da entrambi i neuroni corticali o altri neuroni iPSC-derivati. (B) Illuminazione (barra blu) evoca una serie di potenziali d&#39;azione nei neuroni corticali esprimono ChR2. ( cellule C) iPSC-derivati ​​sono evocati da iniezione di corrente. (D) Firing vs attuale curva di cellule iPSC-derivate. (E) Fotostimolazione delle ChR2 esprimono neuroni corticali (barra blu) sono aumentate la frequenza di PSC in neuroni iPSC-derivati . corso (F) Tempo di aumento della frequenza PSC prodotto da fotostimolazione. Blu barra indica il tempo di fotostimolazione. (G, H) mentre la frequenza PSC è stato incrementato di fotostimolazione (G), l&#39;ampiezza PSC è stata influenzata (H). * Indica p &lt;0,05 rispetto al controllo con t-test di Student.

Viene descritto un protocollo per generare un sistema di co-coltura costituito da neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), neuroni corticali primari e astrociti. Questo sistema di co-coltura consente di rilevare la formazione di contatti sinaptici e circuiti tra nuovi neuroni derivati da iPSC e neuroni corticali preesistenti che esprimono la canalrodopsina-2.

Un approccio per la valutazione optogenetic Formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di stabilire un sistema di co-coltura per valutare la capacità dei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane di formare connessioni funzionali mediante un approccio genico basato sulla stimolazione luminosa dei neuroni in coltura tramite channel RUSIN two o CR two. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto cellule progenitrici neurali primarie di topo, o NPC, e permettendo loro di differenziarsi in astrociti. Successivamente, neuroni corticali primari di ratto vengono trasfettati con CH R two e seminati sullo strato di astrociti, che funge da popolazione neuronale esistente.Successivamente, le NPC umane derivate da colture di cellule staminali pluripotenti indotte o colture di IPSC vengono transdotte con il virus synapsin one 2D tomato e quindi posizionate sulla coltura di neuroni astrocitari e indotte a differenziarsi, formando successivamente connessioni sinaptiche. I risultati mostrano che i neuroni derivati da IPSC formano connessioni sinaptiche con neuroni corticali di ratto, come dimostrato da registrazioni elettrofisiologiche di correnti postsinaptiche nei neuroni derivati da IPSC in seguito a stimolazione foto-genetica dei neuroni corticali esprimenti CHR two. Il vantaggio principale di questo metodo rispetto ai metodi esistenti, come quelli che prevedono la cocoltura di soli astrociti con neuroni umani derivati da IPSC, è che il tempo di maturazione di questi neuroni umani è più breve.Questo perché la presenza di neuroni primari può accelerare la maturazione di questi neuroni umani. A dimostrazione della procedura sarà presente Uni Chin, studentessa laureanda del mio laboratorio, e Y dell'Università di George Augustine. Dopo aver prelevato i cervelli di ratto embrionali e isolato il tessuto corticale secondo il protocollo indicato, trasferire il tessuto corticale in una piastra contenente la soluzione di digestione del tessuto corticale preriscaldata. Triturare il tessuto corticale nel modo più fine possibile prima di incubarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, trasferire il tessuto corticale in un tubo da centrifuga da 50 millilitri e dissociare il tessuto utilizzando una pipetta serologica fino a ottenere una soluzione omogenea priva di frammenti di tessuto.Filtrare la soluzione tissutale attraverso un filtro cellulare da 70 micron per rimuovere eventuali aggregati di tessuto residui. Aliquotare tre millilitri di soluzione in provette da 15 millilitri. Centrifugare le provette.Aggiungere 800 microlitri di BSA al 7,5% in un XPBS sul fondo di ogni tubo, formando uno strato sotto lo strato di tessuto; centrifugare a 200 G per cinque minuti. Rimuovere quindi il soprannatante aspirando dall'interfaccia tra i due strati. Evitare di disturbare il pellet di selp sul fondo del tubo.Dopo aver utilizzato un millilitro di mezzo neuronale primario per risospendere ogni piastra cellulare, unirle tutte in un tubo da centrifuga da 15 millilitri. Quindi utilizzare un emocitometro per determinare la densità cellulare e centrifugare 6 milioni di neuroni corticali di ratto a 200 G per cinque minuti, rimuovendo il soprannatante.Sono necessari almeno 6 milioni di neuroni corticali per l'elettroporazione. Per garantire la formazione di una rete neuronale da parte dei neuroni sopravvissuti, aggiungere 100 microlitri di soluzione per elettroporazione al pellet cellulare e risospendere delicatamente. Successivamente, combinare 100 microlitri della sospensione cellulare con sei microgrammi di plasmide CR due e trasferire il tutto in un vet certificato.Selezionare e applicare il programma appropriato per l'elettroporazione seguendo le istruzioni del produttore. Dopo l'elettroporazione, aggiungere 500 microlitri di MEM al vet. Trasferire le cellule in 11,5 millilitri di mezzo per neuroni primari e risospendere delicatamente.Quindi aggiungere 500 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente astrociti murini. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Dopo aver generato cellule staminali pluripotenti indotte o IPC, indurre e mantenere le cellule come coltura di cellule progenitrici neurali umane o NPC secondo il protocollo descritto nel testo.In questo esempio, le NPC vengono marcate utilizzando il vettore lentivirale synapse in un TD tomato il giorno successivo all'aggiunta dei neuroni primari a una coltura di astrociti. Utilizzare un XPBS per lavare una volta le NPC umane, quindi aggiungere la soluzione di distacco cellulare e incubare per cinque minuti a 30 gradi Celsius. Assicurarsi che tutte le cellule si siano staccate.Quindi trasferirli in un tubo da 15 millilitri contenente il doppio della quantità di D-M-E-M-F 12 e centrifugare a 200 G per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante e utilizzare il mezzo di differenziamento neuronale per risospendere delicatamente il pellet in cellule singole. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule.Successivamente, aspirare con attenzione il mezzo dalla piastra delle colture di neuroni corticali e astrociti. Le NPC umane a 5.000 cellule per centimetro quadrato per pozzetto in mezzo di differenziamento neuronale. Incubare a 37 gradi Celsius e 5%CO2, e sostituire il mezzo ogni due o tre giorni per almeno 28 giorni.Per verificare se gli IPC umani si comportano come neuroni maturi, utilizzare un microscopio confocale dotato di un obiettivo a immersione in acqua da 60x per individuare le cellule differenziate da IPC umani. Visualizzando TD tomato. Tirare una pipetta di registrazione fino a raggiungere una resistenza compresa tra quattro e sei ohm e perfondere.Le cellule a temperatura ambiente in una soluzione esterna continuamente saturata con 95%ossigeno, 5%anidride carbonica. Utilizzare una soluzione interna per riempire la micropipetta di registrazione, effettuare un'ampolla su una cellula positiva per TD tomato in modalità cellula intera e registrare la generazione di potenziali d'azione in risposta all'iniezione di corrente in regime di blocco della corrente. Per confermare che il potenziale d'azione delle cellule corticali che esprimono CHR due viene evocato in modo affidabile dalla stimolazione luminosa.Per prima cosa, individuare le cellule corticali che esprimono CR due mediante la visualizzazione di GFP attraverso l'illuminazione con una lampada a arco di mercurio, utilizzando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 480 su 40 nanometri. Verificare che un potenziale d'azione venga generato in modo affidabile tramite la registrazione in modalità clamp di corrente in modalità cella intera. Per eseguire la stimolazione genica, effettuare il patch di una cellula positiva per TD tomato in modalità cella intera e impostare il clamp di tensione a meno 70 millivolt utilizzando la lampada a mercurio su tutto il campo e un filtro di eccitazione di 480 su 40.Stimolare l'intero campo per 30 secondi. Registrare le correnti postsinaptiche o PSC di una cellula patchata indotte dalla stimolazione fotoptica di neuroni corticali presinaptici esprimenti CHR2. Impostare la soglia per l'ampiezza e l'area delle correnti a cinque picoampere qui e PICO rispettivamente, ispezionando manualmente questi eventi per scartare eventuali tracce non relative a PSC.Come dimostrato in questo video, sono necessari diversi passaggi per generare la coltura co-coltivata di neuroni derivati da IPC, neuroni corticali primari e astrociti. Questa immagine mostra che al secondo giorno di differenziamento delle NPC murine in astrociti, è possibile osservare con facilità astrociti positivi per la proteina acida fibrillare gliale, o GFAP. Le NPC murine sono state lasciate differenziare per almeno una settimana prima di seminare i neuroni corticali, esprimenti CR due, sul monolayer di astrociti, e entrambi vengono identificati in questa co-coltura mediante colorazione immunofluorescente per GFAP e CHR due.Dopo tre o quattro settimane di differenziazione delle NPC umane, neuroni positivi al TD tomato sono stati rilevati nelle colture come mostrato qui. Quando stimolati dalla luce, potenziali d'azione sono stati generati nei neuroni corticali che esprimono CHR due IPSC. I neuroni derivati sono inoltre eccitabili, mostrando un aumento dell'attività elettrica.Potenziale di sparo man mano che l'ampiezza degli impulsi di corrente depolarizzante aumentava. In assenza di luce, i neuroni derivati da IPSC ricevevano input sinaptici spontanei. Queste correnti postsinaptiche entranti erano prevalentemente mediate da recettori AMPA.La stimolazione luminosa dei neuroni corticali è stata mantenuta per tutta la durata del 32° lungo impulso di luce, mentre la frequenza dei PSC era aumentata. Quando i neuroni corticali esprimenti CHR2 sono stati stimolati con la luce, la loro ampiezza non è risultata alterata. Dopo questa procedura, possiamo utilizzare altri sistemi di co-coltura con diversi tipi cellulari specifici del paziente per rispondere ad ulteriori domande, come l'effetto di composti farmacologici candidati su malattie specifiche di interesse.

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