Radial Mobilità e citotossico Funzione retrovirale Replica vettoriale trasdotte, non aderente Alloresponsive Linfociti T

L'obiettivo generale del seguente esperimento è mostrare la migrazione dei linfociti T effettori non aderenti su un monocstrato di cellule tumorali aderenti. Questo risultato si ottiene innanzitutto stabilendo un monocstrato di cellule tumorali aderenti nelle pozzette di vetrini in teflon rivestiti con poli-D-lisina; successivamente, i linfociti T effettori marcati con fluorocromo vengono sedimentati al centro del monocstrato mediante un manifold per la sedimentazione cellulare. Infine, si utilizzano microscopia a luce e microscopia a fluorescenza per visualizzare la migrazione delle cellule non aderenti sul monocstrato.

I risultati mostrano che la migrazione e le funzioni effettrici dei linfociti T non aderenti in co-coltura con un monostrato di cellule tumorali aderenti vengono mantenute dopo che i linfociti sono stati trasdotti con un vettore retrovirale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che la migrazione radiale dei linfociti T effettrici non aderenti può essere misurata in co-coltura con cellule tumorali aderenti. Questo ha implicazioni di vasta portata per i pazienti con tumori cerebrali primitivi o metastatici, poiché linfociti T citotossici allogenici modificati per esprimere un gene attivatore di profarmaci, come la citosina deaminasi, sono in fase di sperimentazione come approccio multimodale per l'eliminazione del tumore cerebrale.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà nel formare monocapati di cellule tumorali aderenti a causa dell'eterogeneità della crescita cellulare tumorale riguardo alle caratteristiche di adesione. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi per generare un monocapato tumorale uniforme e una sedimentazione efficace delle L-O-C-T-L non aderenti richiedono una comprensione esperienziale delle caratteristiche di entrambi i tipi cellulari. Per iniziare, posizionare fino a quattro.

10 vetrini con 10 pozzetti rivestiti in teflon in una piastra Petri sterile da 150 millimetri per 15 millimetri. Posizionare una piastra Petri da 35 millimetri per 10 millimetri contenente due o tre millilitri di acqua sterile accanto ai vetrini per fornire umidità. Successivamente, prerivestire i vetrini coprendo ogni pozzetto con una soluzione di 100 microgrammi per millilitro di poli-D-lisina o poli-L-lisina.

Incubare i vetrini per un'ora a temperatura ambiente, quindi aspirare la soluzione e risciacquare due volte la superficie della piastra con PBS, utilizzando i pozzetti preparati con il campione. Raccogliere un flacone confluenziale di cellule tumorali aderenti. Contare il numero di cellule vitali mediante microscopia ottica, quindi sospendere le cellule a una concentrazione di cinque volte 10 alla sesta cellule per millilitro.

In un mezzo di crescita tamponato, aggiungere da cinque a dieci microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto, a seconda del tipo di cellula tumorale; portare il volume del pozzetto a 40 microlitri con il mezzo e pipettare lentamente su e giù per distribuire uniformemente le cellule. Dopo aver seminato i pozzetti, lasciare sedimentare le cellule tumorali a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi posizionare il coperchio sulla piastra di Petri e trasferirla con attenzione in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%, e incubare per almeno 24 ore.

Cambiare il mezzo di coltura nei pozzetti ogni giorno, rimuovendo con attenzione una parte del mezzo dal monostrato e sostituendolo con un volume maggiore di mezzo completo per linfociti T fresco. Le cellule di solito diventeranno confluenti nell'arco di uno a tre giorni, pronte per essere sedimentate sul monostrato di cellule tumorali. Raccogliere i linfociti T non aderenti ed etichettarli con un colorante per la proliferazione cellulare seguendo il protocollo del produttore almeno un'ora prima del saggio.

Successivamente, posizionare la camera umidificata contenente i vetrini con le cellule tumorali all'interno della cappa a sicurezza biologica. Lavare le pozzette con PBS mediante pipettaggio, quindi aggiungere 45 microlitri di mezzo completo con siero al 10% nelle pozzette. Far scivolare un manifold sterile per la sedimentazione cellulare sulle pozzette fino a quando il gancio all'estremità del manifold tocca il fondo del vetrino.

Assicurarsi che il mezzo sia visibile nei canali del manifold. Quindi, contare le cellule non aderenti e sospenderle a una-due volte 10 alla quinta cellule per microlitro nel mezzo.

Disperdere delicatamente le cellule per eliminare eventuali aggregati cellulari che potrebbero interferire con la sedimentazione. Pipettare lentamente un microlitro della sospensione cellulare nel canale del manifold per ciascun pozzetto, quindi incubare l'apparato a temperatura ambiente per 20-30 minuti, consentendo alle cellule presenti nel canale di depositarsi sul monolayer.

Dopo che le cellule si sono depositate, sollevare delicatamente il manifold in verticale senza toccare il vetrino. Assicurarsi che i pellet cellulari siano posizionati all'interno della circonferenza del canale del manifold. Utilizzando un microscopio, le cellule posizionate dovrebbero aderire leggermente al monostrato in modo che muovere delicatamente il vetrino non disperda il pellet.

Dopo aver confermato che le cellule si sono sedimentate, trasferire il vetrino su un microscopio invertito dotato di una camera per anidride carbonica e umidità. Utilizzare l'obiettivo 4x per l'immagine in campo chiaro e in fluorescenza multicanale delle cellule. Acquisire immagini di una determinata area in campo chiaro e nei canali fluorescenti, quindi aggiungere le barre micrometriche mediante il software di acquisizione delle immagini.

Conservare il vetrino in un incubatore umidificato tra i diversi tempi una volta acquisiti tutti i punti temporali. Trascinare e rilasciare i file delle immagini nel programma di editing delle immagini e selezionare l'opzione aggiungi livello per creare un file immagine con più livelli. Unire le immagini in luce visibile e quelle fluorescenti in un unico livello.

Utilizzare il software di acquisizione per scattare immagini di un'area di otto millimetri per otto millimetri. Il software deve essere impostato per unire automaticamente le immagini acquisite utilizzando il canale meglio rappresentato in tutta la pozzetta. Se vengono acquisite solo immagini nei canali di fluorescenza, questo deve essere il canale per l'acquisizione delle cellule aderenti.

In alternativa, le immagini possono essere unite utilizzando un software di elaborazione delle immagini. Questo processo avviene allineando le regioni delle immagini che si conservano da un'immagine all'altra e sovrapponendo le immagini una sull'altra fino a generare un'immagine completa. Unire le immagini insieme utilizzando il software di elaborazione delle immagini.

Utilizzare le immagini combinate per creare mappe di intensità fluorescente della superficie con il software Image J, al fine di visualizzare l'aggregazione o la diffusione dei linfociti T nel tempo. Linfociti T citotossici alloreattivi umani, noti come Allo CTL, trasdotti con un vettore retrovirale competente per la replicazione che codifica per un gene di espressione della proteina fluorescente verde smeraldo, sono stati posizionati al centro di un monostrato di cellule di glioma. Dopo quattro ore, gli Allo CTL avevano formato aggregati visibili entro 24 ore.

Apparvero chiazze vuote nel monostrato di cellule aderenti, indicando la lisi delle cellule tumorali e il fatto che alcuni CTL allo erano migrati oltre il bordo periferico. I CTL allo murini marcati con fluorescenza erano posizionati al centro di un monostrato di cellule di glioma marcate con fluorescenza dopo un'ora; dopo 48 ore, i CTL allo erano strettamente associati alle cellule di glioma e avevano migrato verso l'esterno rispetto al centro della superficie del monostrato. Le mappe di fluorescenza generate da queste immagini mediante il software ImageJ mostrano una migrazione significativa rispetto al centro dopo 48 ore.

È importante cambiare quotidianamente il mezzo di coltura per il monostrato di cellule tumorali, al fine di mantenere condizioni di coltura ottimali. Inoltre, una volta acquisita dimestichezza, la sedimentazione delle cellule non aderenti dovrebbe richiedere circa 20 minuti seguendo questa procedura. Altri metodi, come il tracciamento del percorso cellulare, possono essere utilizzati per rispondere a domande riguardo alla velocità con cui i CTL allo reagiscono attraversando il monostrato o il tempo durante il quale rimangono in contatto con le cellule tumorali svolgendo le loro funzioni citotossiche.

Questo protocollo aiuterà i ricercatori nel campo della terapia genica immunitaria a esplorare la migrazione di linfociti T modificati geneticamente in co-coltura con cellule tumorali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare cellule non aderenti e aderenti per la co-coltura e di come utilizzare il manifold per la sedimentazione cellulare per studiare la migrazione radiale orizzontale di cellule non aderenti su un monostrato di cellule tumorali.