Radial Mobilità e citotossico Funzione retrovirale Replica vettoriale trasdotte, non aderente Alloresponsive Linfociti T

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di mostrare la migrazione dei linfociti T effettori non aderenti su un monostrato di cellule tumorali aderenti. Ciò si ottiene stabilendo prima un monostrato di cellule tumorali aderenti nei pozzetti di vetrini mascherati in teflon rivestiti di lisina poli D come effettore marcato in fluorescenza in seconda fase, i linfociti T vengono sedimentati al centro del monostrato utilizzando un collettore di sedimentazione cellulare. Successivamente, la microscopia ottica e la microscopia a fluorescenza vengono utilizzate per visualizzare la migrazione delle cellule non aderenti sul monostrato.

I risultati mostrano che la migrazione e le funzioni effettrici dei linfociti T non aderenti in co-coltura con un monostrato di cellule tumorali aderenti vengono mantenute dopo che i linfociti sono stati trasdotti con un vettore retrovirale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che la migrazione radiale dei linfociti T effettori non aderenti può essere misurata in coltura di carbone con cellule tumorali aderenti. Ciò ha implicazioni di vasta portata per i pazienti con tumori cerebrali primari o metastatici perché i linfociti T citotossici allogenici modificati per esprimere un gene attivatore pro-farmaco, come la citosina deaminasi, vengono testati come approccio multimodale per eliminare il tumore nel cervello.

In generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a stabilire monostrati di cellule tumorali aderenti a causa dell'eterogeneità della crescita delle cellule tumorali nelle caratteristiche di aderenza. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi per generare un monostrato tumorale uniforme e un'efficace sedimentazione di L-O-C-T-L non aderente richiedono una comprensione esperta delle caratteristiche di entrambi i tipi di cellule. Per cominciare, posizionare fino a quattro sterilizzati.

Vetrini rivestiti in teflon a 10 pozzetti in una piastra Petri sterile da 150 mm per 15 mm. Posizionare una capsula di Petri da 35 millimetri per 10 millimetri contenente due o tre millilitri di acqua sterile accanto ai vetrini per fornire umidità. Successivamente, preco i vetrini coprendo ciascun pozzetto con una soluzione di 100 microgrammi per millilitro di poli-D lisina o poli L-lisina.

Incubare i vetrini per un'ora a temperatura ambiente, quindi aspirare la soluzione e sciacquare la superficie del pozzetto due volte con PBS con i pozzetti del campione preparati. Raccogliere un pallone confluente di cellule tumorali aderenti. Contare il numero di cellule vitali mediante microscopia ottica, quindi sospendere le cellule a una concentrazione di cinque volte 10 per sei cellule per millilitro.

Nel terreno di crescita tamponato, aggiungere da cinque a 10 microlitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto, a seconda del tipo di cellula tumorale, portare il volume del pozzetto fino a 40 microlitri con terreno e pipettare su e giù lentamente per distribuire uniformemente le cellule. Dopo aver seminato i pozzetti, lasciare che le cellule tumorali si depositino a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi posizionare il coperchio sulla capsula di Petri e trasferirla con cura in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica, incubare per almeno 24 ore.

Cambiare quotidianamente il terreno di coltura sui pozzetti rimuovendo con cura una parte del terreno dal monostrato e sostituendolo con un volume maggiore di terreno fresco completo a cellule T. Le cellule saranno in genere confluenti entro uno o tre giorni per preparare le cellule per la sedimentazione sul monostrato di cellule tumorali. Raccogliere le cellule T non aderenti ed etichettarle con un colorante per la proliferazione cellulare secondo il protocollo del produttore almeno un'ora prima del test.

Posizionare quindi la camera umidificata contenente i vetrini delle cellule tumorali nella cabina di sicurezza biologica. Lavare i pozzetti con PBS mediante pipettaggio e quindi aggiungere 45 microlitri di terreno completo con il 10% di siero ai pozzetti. Far scorrere un collettore di sedimentazione cellulare sterilizzato sui pozzetti fino a quando il gancio all'estremità del collettore tocca il fondo del vetrino.

Assicurarsi che il fluido sia visibile nei canali del collettore. Quindi contare le cellule non aderenti e sospenderle una o due volte, da 10 alla quinta. Cellule per microlitro nel terreno.

Distruggi delicatamente le cellule per eliminare eventuali ammassi cellulari che interferirebbero con la sedimentazione cellulare. Pipettare lentamente un microlitro della sospensione cellulare nel canale del collettore per ciascuna. Bene, quindi incubare l'apparato a temperatura ambiente per 20-30 minuti per consentire alle cellule nel canale di depositarsi sul monostrato.

Dopo che le celle si sono stabilizzate, sollevare delicatamente il collettore verso l'alto senza toccare il vetrino. Assicurarsi che i pellet della cella siano stati posizionati all'interno della circonferenza del canale del collettore. Utilizzando un microscopio, le cellule posizionate dovrebbero aderire leggermente al monostrato in modo che muovendo delicatamente il vetrino non si disperda il pellet.

Dopo aver confermato che le cellule si sono sedimentate, trasferire il vetrino su un microscopio invertito dotato di una camera di anidride carbonica e umidità. Utilizzare l'obiettivo quattro x per l'imaging in campo chiaro e fluorescente multicanale delle cellule. Acquisisci immagini di una determinata area in campo chiaro e canali fluorescenti, quindi aggiungi barre di micron con il software di acquisizione delle immagini.

Conservare il vetrino in un'incubatrice umidificata tra i punti temporali una volta acquisiti tutti i punti temporali. Trascina e rilascia i file immagine nel programma di modifica delle immagini e seleziona l'opzione Aggiungi livello per creare un file immagine con più livelli. Unisci la luce e le immagini fluorescenti in un unico livello.

Utilizzare il software di acquisizione per scattare foto di un'area di otto millimetri per otto millimetri. Il software deve essere impostato per unire automaticamente le immagini acquisite utilizzando il canale meglio rappresentato nell'intero pozzetto. Se vengono visualizzati solo i canali di fluorescenza, questo dovrebbe essere il canale per l'imaging delle cellule aderenti.

In alternativa, le immagini possono essere unite utilizzando un software di modifica delle immagini. Questa operazione viene eseguita allineando le regioni delle immagini conservate da un'immagine all'altra e sovrapponendo le immagini una sopra l'altra fino a generare un'immagine completa. Unisci le immagini utilizzando il software di immagine.

Utilizza le immagini combinate per creare mappe di fluorescenza dell'intensità superficiale con il software Image J per visualizzare l'aggregazione o la diffusione delle cellule T fluorescenti nel tempo. I linfociti T citotossici allo react umani noti come Allo CTL trasdotti, con un vettore retrovirale competente per la replicazione che codifica un gene di espressione proteica fluorescente verde smeraldo, erano posizionati al centro di un monostrato di cellule di glioma. Dopo quattro ore, tutto l'OCTL aveva formato aggregati visibili entro 24 ore.

Macchie vuote sono apparse nel monostrato cellulare aderente indicando la lisi delle cellule tumorali e un po' di CTL è migrato oltre il bordo anteriore. I CTL murini Allo-CTL marcati in fluorescenza erano posizionati al centro di un monostrato di cellule di glioma marcate in fluorescenza influenzale a un'ora Allo CTL strettamente associato alle cellule di glioma entro 48 ore, Allo CTL era migrato lontano dal centro dell'intensità superficiale del monostrato. Le mappe di fluorescenza sono state generate da queste immagini con il software di immagine J e mostrano una migrazione sostanziale lontano dal centro dopo 48 ore.

È importante cambiare quotidianamente il terreno di coltura per il monostrato di cellule tumorali per mantenere condizioni di coltura sane. Inoltre, una volta padroneggiata, la sedimentazione delle cellule non aderenti dovrebbe richiedere circa 20 minuti Dopo questa procedura. Altri metodi, come il tracciamento del percorso cellulare, possono essere utilizzati per rispondere a domande sulla velocità con cui i CTL allaomiali migrano attraverso il monostrato o sul tempo in cui sono in contatto con le cellule tumorali che svolgono le loro funzioni citotossiche.

Questo protocollo aiuterà i ricercatori nel campo dell'immunoterapia genica a esplorare la migrazione dei linfociti T geneticamente modificati in co-coltura con cellule tumorali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare le cellule non aderenti e aderenti per cocoltura e come utilizzare il collettore di sedimentazione cellulare per studiare la migrazione radiale orizzontale delle cellule non aderenti sul monostrato di cellule tumorali.