Name: Radial Mobilità e citotossico Funzione retrovirale Replica vettoriale trasdotte, non aderente Alloresponsive Linfociti T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Impara a monitorare la migrazione radiale di linfociti T effettori non aderenti su monostrati di cellule tumorali usando un manifold di sedimentazione cellulare. Questo metodo consente di studiare la mobilità immunitaria in vitro.

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Supportato in parte dal NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Concessione Numero UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, e Joan S. Holmes Memorial Fund Research. MJH e GCO ricevuti sostenuto dalla Joan S. Holmes Memorial Postdoctoral Fellowship presso la UCLA. Il dispositivo CSM è stato ottenuto da creativi metodi scientifici: www.creative-sci.com. Il vettore lentivirale è stato ricevuto dal UCLA Vector core, che è supportato da CURE / P30 DK041301.

1. Far scorrere Preparazione <ol><li> Inserire sedimentazione cellulare slide collettore in sacchetti di sterilizzazione e sigillare con nastro autoclave. Affrontare il lato rivestito di teflon della slitta della carta lato del sacchetto per evitare depositi di plastica sui pozzetti. </li><li> Sacchetti autoclave per 15 min a 121 ° C. </li><li> Rimuovere il vetrino dalla busta di sterilizzazione in un armadio biosicurezza e posto in un 150 x 15 mm piastra di Petri sterile sterile. Fino a quattro diapositive può andare bene per ogni piatto. Inserire un piatto 35 x 10 mm Petri accanto alle diapositive. Aggiungere 2-3 ml di H 2 O sterile per fornire umidificazione. </li><li> Vetrini pre-cappotto con poli-D-lisina a 100 mcg / ml usando un volume sufficiente per coprire bene l&#39;intero. Dopo un ora a RT, aspirare la soluzione e risciacquare la superficie del pozzetto due volte pipettando 1x PBS sulla superficie dei pozzetti. </li><li> Facoltativamente, aggiungere fibronectina o altri componenti ECM per garantire maggiore aderenza del tumore delle cellule. Aggiungi fibronectina a 5 mg / ml in un volume sufficiente that pozzetti non sarà asciutto entro un breve periodo di tempo a temperatura ambiente. <ol><li> Dopo 1 ora, aspirare la soluzione rimanente e lavare due volte pipettando su e giù con 1x PBS. </li></ol></li><li> Mantenere PBS sui pozzetti fino tumore è pronta per la placcatura. Utilizzare scorre lo stesso giorno. </li><li> Raccolto un pallone confluente del aderenti tipo cellula tumorale desiderato. Contare cellule vitali utilizzando Trypan Blue dye esclusione di microscopia ottica e risospendere a 5 x 10 6 cellule / ml in crescita esempio medio per adeguatamente-buffered, mezzo essenziale minimo di Dulbecco (DMEM) con siero fetale bovino 10% (FBS), L- glutamina e piruvato di sodio. </li><li> Se si desidera l&#39;imaging fluorescente della popolazione di cellule aderenti, etichettare la popolazione di cellule aderenti con un colorante fluorescente vitale o un colorante proliferazione cellulare seguendo i protocolli forniti dal produttore. </li><li> Uniformemente pipetta 10 ml di terreno completo in ogni pozzetto della cura slitta prendere per evitare di creare bolle in wells, in quanto questi può prevenire uniforme adesione delle cellule tumorali. </li><li> Aggiungere 2,5-5,0 x 10 4 cellule (5-10 microlitri di sospensione cellulare) al mezzo in ogni pozzetto (Figura 1A). Regolare il numero ottimale a seconda del tipo di cellule tumorali e il numero di giorni di crescita desiderati. Cellule tumorali più grandi o cellule in rapida crescita potrebbero richiedere un minor numero di cellule inizialmente. Portare il volume ben fino a 40 microlitri aggiungendo medio e pipetta su e giù per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule. </li><li> Dopo tutti i pozzetti sono teste di serie, permette alle cellule tumorali di aderire a RT, quindi posizionare il coperchio sulla piastra di Petri di 150 x 15 mm e con attenzione spostare il piatto per un 37 ° C / 5% di CO 2 incubatore umidificato per almeno 24 ore. </li><li> Cambiare il terreno di coltura quotidiano. Pipettare attentamente una porzione del mezzo esaurito dal monostrato e sostituirlo con terreno fresco completa. NOTA: A causa di evaporazione, più volume dovrà essere aggiunto che è stato tolto. Wells sarà pronto per il dosaggio quando ancora, conflconfluente strato di cellule è presente. Questo è in genere 1-3 giorni dopo la semina iniziale. </li><li> Lavare monostrato delicatamente una volta con PBS come descritto al punto 1.4 e sia passare al punto 2, se si desiderano monostrati, o al punto 1.13 sotto per estrarre proteine ​​ECM dal monostrato. </li><li> Fare un (v / v) 0,5% Triton-X in mezzo completo e aggiungere 30 microlitri di ogni bene. Lasciate monostrato digerire in cappuccio per 2 minuti, poi lavare due volte con terreno completo pipettando come descritto sopra. NOTA: Lo strato ECM può essere visibile al microscopio ottico (Figura 2). Utilizzare vetrini subito, o di tenere in terreno completo in umidificata CO 2 incubatore per 1-2 giorni. Evitare che i pozzetti si asciughino. </li></ol> 2. La sedimentazione di cellule T non aderenti su diapositive <ol><li> Se si desidera l&#39;imaging a fluorescenza della popolazione di cellule non-aderenti, etichettare le popolazioni di cellule non-aderenti con un colorante fluorescente vitale, come CFSE, Tracker Red Cell CMPTX, o eFluor670 seguendo i protocolli forniti dal produttore di almeno 1 ora prima del test. In alternativa, manipolare le cellule di esprimere proteine ​​fluorescenti codificate dai vettori virali. </li><li> Autoclavare collettore sedimentazione delle cellule in un sacchetto autoclave descritta sopra 1.2. </li><li> Rimuovere la camera umidificata contenente vetrini rivestiti in teflon dal termostato e posto in cella di sicurezza biologica. </li><li> Lavare i pozzetti con PBS 1x pipettando su e giù, poi aggiungere 45 ml di terreno completo contenente% di siero di almeno 10. </li><li> Rimuovere il collettore dalla busta di sterilizzazione e far scorrere con attenzione in oltre pozzetti fino al &#39;gancio&#39; alla fine del collettore tocca la parte inferiore della slitta (Figura 1B). </li><li> Assicurarsi che il terreno di coltura è visibile in ciascuno dei canali. Se non si vede, togliere il collettore e aggiungere più medio corrispondente bene, quindi sostituire e controllare di nuovo. </li><li> Ripetere il passaggio 2.5 per ogni chanNel del collettore, o a molti pozzi lo desideri. </li><li> Contare le cellule non aderenti e risospendere a non meno di 1,0-2,0 x 10 5 / ml. Redigere 1 ml di cellule e lentamente li pipetta nel canale (Figura 1C). Fate questo per ogni bene desiderato. </li><li> Lasciare l&#39;intera cella apparecchiatura caricata, cioè, collettore e scorrevole, all&#39;interno della bio-cappuccio per 20-30 minuti per consentire alle cellule nel canale di stabilirsi. </li><li> Rimuovere il collettore toccando entrambe le estremità e delicatamente sollevandolo verso l&#39;alto dalla slitta in modo da non disturbare le cellule focally seminate nel centro dei pozzi (Figura 1D). </li><li> Controllare ciascun pozzetto per assicurare che le cellule non aderenti sono state seminate con successo al centro del pozzo rimanere all&#39;interno della circonferenza del canale collettore. Le cellule non aderenti saranno idealmente leggermente aderire al monostrato o ECM e tra loro, quindi spostando delicatamente il vetrino attorno non causerà la pelle cellulet per disperdere. Non jostle la diapositiva. </li></ol> 3. microscopia a fluorescenza <ol><li> Con adeguate attrezzature sperimentali, eseguire imaging dopo sedimentazione è confermato. Idealmente, utilizzare un microscopio che è dotato di una camera di CO 2 e umidità. Immagine a bassa potenza, cioè, 4X o 10X, per consentire più immagini da prendere di un&#39;area più grande in modo che la totalità del pozzo può essere visto. </li><li> Acquisire le immagini digitali utilizzando il software di acquisizione delle immagini. Eseguire campo chiaro e / o multi-canale di imaging di fluorescenza. </li><li> Se lo si desidera, impostare un time-lapse di registrare immagini in canali diversi su una determinata zona, o mantenere la diapositiva umidificata e in un / 5% di CO 2 incubatore 37 ° C e manualmente togliere all&#39;immagine nei momenti desiderati (Figura 1E e F, consigliato per i punti di tempo più lungo). </li></ol> 4. Analisi e display <ol><li> Utilizzando immagini software di editing, fondere luce e flimmagini fluorescenti in un livello in modo più tipi di cellule e marcatori possono essere visti nella stessa immagine. Trascinare i file di immagine per ogni singolo colore nel programma e, quando richiesto, selezionare l&#39;opzione &#39;Aggiungi Layer&#39; per creare un file immagine con più livelli. <ol><li> A maggiore ingrandimento, prendere, allineare e cucire insieme le immagini di tutto il bene digitale. Allineate file cercando in regioni conservate tra due immagini e sovrapponendo un&#39;immagine sopra l&#39;altra fino viene generato un quadro completo. </li></ol></li><li> Aggiungere bar micron alle immagini durante l&#39;acquisizione utilizzando il software di cattura per determinare la distanza singole celle sono migrati. </li><li> Per determinare la migrazione delle cellule in vari momenti, fare mappe fluorescenza intensità superficie con software di immagini, cioè, ImageJ, per quantificare l&#39;aggregazione delle cellule T fluorescente o diffusi nel corso del tempo. <ol><li> Per generare grafici di superficie, prendere un&#39;immagine stratificata generato nella fase 4.1 e sotto la finestra Livelli,deselezionare tutti i livelli tranne quelle corrispondenti al canale desiderato. Per esempio, se un grafico della superficie si desidera visualizzare espressione EMD, solo gli strati &quot;verdi&quot; corrispondenti al filtro utilizzato per questo marcatore dovrebbero essere visibili. </li><li> Appiattire l&#39;immagine e salvarla in un formato di file riconosciuti (ad esempio, .png) e caricare l&#39;immagine nel programma. Per generare la trama della superficie, modificare il tipo di immagine a 8-bit, modificare la luminosità / contrasto come necessario per ridurre il fondo, e selezionare l&#39;opzione &#39;Analizza / Surface Plot&#39;. Le immagini in figura 5 sono stati generati controllando il &#39;Ombra&#39;, &#39;Draw Axis&#39;, &#39;un poligono Per Line&#39;, e caselle di controllo &#39;liscio&#39;. </li><li> In alternativa, prendere misurazioni utilizzando il raggio o il diametro dal deposito cellulare focale al tempo zero e confrontarle con le cellule al punto più esterno in tempi diversi. Il diametro del Teflon pozzi è del 6,0 mm. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Le cellule tumorali in una sospensione di cellule singole sono stati pipettati nei pozzetti di una slitta Teflon mascherato. Le cellule potevano aderire e poi formate monostrati in un umidificata al 5% di CO 2, 37 ° C incubatore (Figura 1A). Monostrati affermati o proteine ​​ECM derivati ​​dal monostrato potrebbero essere raccolti per questi test (Figura 1B). T effettrici linfociti marcati con coloranti fluorescenti vitali o trasdotte con vettori codificanti per EMD sono stat...

Il test di migrazione cellulare monostrato Radial è stato originariamente sviluppato per misurare le proprietà infiltrative delle cellule tumorali aderenti 1-4 su vetrini rivestiti con matrice extracellulare (ECM) proteine ​​5-7 o con i componenti ECM individuali, come la fibronectina o laminina 1,2. La tecnica coinvolto seminare una sospensione di cellule singole cellule tumorali nel centro di pozzetti usando un collettore sedimentazione cellulare acciaio inossidabile (CSM). Dopo sedimentazione, le cellule tumorali sarebbero aderire al fondo del pozzo e la variazione del diametro della popolazione cellulare iniziale nel tempo usato per stabilire un tasso di motilità orizzontale. Il test di migrazione cellulare monostrato Radial ha fornito un vantaggio visivo rispetto ad altri metodi esistenti che impiegavano transwell piastre per saggio le capacità migratorie in vitro di cellule; questi test non sono favorevoli alla formazione immagine 8. Come pure, ha fornito anche una grande quantità di libertà nella scelta del timepoints in sede di valutazione della migrazione, senza alcun limite al numero di timepoints un ricercatore potrebbe scegliere di immagine dopo la sedimentazione. Poiché la capacità di migrare è una funzionalità importante per le cellule non aderenti, soprattutto nella zona di immunoterapia o dove possono essere utilizzate come veicoli di consegna per vettori virali, abbiamo adattato l&#39;uso del CSM per valutare la migrazione di cellule non aderenti tipi su monostrati di cellule tumorali, in aggiunta alle proteine ​​ECM. Il vantaggio di microscopicamente visualizzare la migrazione delle cellule non aderenti su monostrati di cellule tumorali vitali, il ECM complesso isolato dal tumore, o sui componenti ECM singoli rende questo test versatile. Saggi che utilizzano pozzi rivestiti con una singola proteina extracellulare non riflettono accuratamente il substrato tessuti ECM o tumore delle cellule sarebbero migrare attraverso in vivo. Qui, abbiamo usato alloreattivi linfociti T citotossici (alloCTL), sensibilizzati ai principali histocompcomplesso atibilità (MHC) proteine ​​utilizzando reazioni a senso unico di cellule tumorali linfocitaria mista (MLTR) o reazioni linfociti misti (MLR) 9, come il nostro tipo di cella non aderente rappresentante. Abbiamo testato le celle sia di origine umana e murina. Quando la migrazione è stata misurata su monostrati tumorali, le cellule tumorali sono state impiegate obiettivi parzialmente rilevanti, mostrando alcune delle stesse proteine ​​MHC presenti nella popolazione cellulare utilizzato per sensibilizzare gli effettori, o obiettivi pienamente rilevanti, con una serie completa di molecole MHC che la effettori erano stati sensibilizzati verso. In alcuni esperimenti, abbiamo usato CellTracker fluorescente Red CMPTX o proliferazione cellulare dye eFluor 670 di distinguere tra cellule effettrici e di destinazione. Abbiamo anche utilizzato la trasduzione con codifica vettori virali per proteine ​​fluorescenti come un ulteriore modo per visualizzare le cellule. Per alcuni test, abbiamo transdotte la alloCTL con vettori retrovirali replicanti (RRV) che codificano per Emerald Green (EMD) proteina fluorescente 10,11; per OTHERS, le cellule tumorali sono state trasdotte con vettori lentivirali codificanti per mStrawberry. Il alloCTL sono stati seminati attraverso un canale del collettore al centro di entrambi i monostrati di cellule tumorali o ECM raccolti da monostrati cellulari tumorali. Interazioni delle cellule aderenti e non aderenti sono state visualizzate mediante luce e / o mediante microscopia a fluorescenza nel tempo. Turbativa in monostrato cellula tumorale a bassa potenza, o tumore cellule con nuclei frammentati ad alta potenza sono indicatori di danno cellulare da lisi e apoptosi, rispettivamente. Abbiamo creato digitalmente mappe fluorescenti di intensità superficie che mostrano la migrazione di cellule fluorescenti T non aderenti sulle colture monostrato. Abbiamo notato anche la citotossicità generato per l&#39;aderente monostrato cellulare glioma dopo la formazione di cluster del sovrapposto alloCTL non aderente. Come pure, è stato osservato trasduzione orizzontale RRV-EMD dalla alloCTL al monostrato glioma.

<table><tbody><tr><td>Vetrini per microscopio mascherati in teflon Metodi</td><td>scientifici creativi</td><td>CSM002</td><td></td></tr><tr><td>Collettore di sedimentazione cellulare</td><td>Metodi scientifici creativi</td><td>CSM001</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri, 150 mm</td><td>Corning</td><td>430597</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri, 35 mm</td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Mediatech</td><td>21-040</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l puntali per pipette</td><td>VWR</td><td>89003-060</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata e deionizzata (sterile)</td><td>Mediatech</td><td>25-055</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Mediatech</td><td>25-054-CL</td><td></td></tr><tr><td>Celltracker Rosso CMPTX</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (opzionale)</td><td>Gibco</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>Terreni di coltura cellulare tumorale (es. DMEM)</td><td>Mediatech</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>AIM-V terreni senza siero</td><td>Invitrogen</td><td>12055-083</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td>invertito</tr><tr><td>SPOT</td><td>Strumenti</td><td></td><td></td>diagnostici avanzati</tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>BD</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>31/2 x 51/4 Buste per autoclave</td><td>Crosstex</td><td>SCXS2</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Mediatech</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Proliferazione cellulare eFluor 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

radial mobilità e citotossico funzione retrovirale replica vettoriale trasdotte, non aderente alloresponsive linfociti t

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

Riportiamo un romanzo adattamento del dosaggio migrazione cellulare Monolayer radiale, prima riferito a misurare la migrazione radiale delle cellule tumorali aderenti su proteine ​​della matrice extracellulare, per misurare la motilità, umane non aderente o effettrici murine cellule immunitarie fluorescenza marcata. Questa tecnica utilizza un collettore in acciaio inox e 10 ben scorrevole in Teflon per depositare focally cellule T non aderenti nei pozzetti preparati sia con monostrati confluenti di cellule tumorali o proteine ​​della matrice extracellulare. Luce e / o multicanale microscopia a fluorescenza viene utilizzato per monitorare il movimento e il comportamento delle cellule effettrici nel tempo. Coloranti fluorescenti e / o vettori virali che codificano per transgeni fluorescenti sono usati per etichettare in modo differenziato i tipi di cellule per l&#39;imaging. Questo metodo è distinto da simile tipo in vitro che traccia orizzontale o verticale migrazione / invasione utilizzando camere di diapositive, agar o transwell piatti. Il test permette di dati dettagliati di imaging a Be raccolti con differenti tipi cellulari caratterizzati da marcatori fluorescenti specifici; anche sottopopolazioni di cellule specifiche (ad esempio, trasdotte / nontransduced) possono essere monitorati. Superficie trame fluorescenza intensità vengono generati utilizzando i canali di fluorescenza specifici corrispondenti al tipo di cellula migrazione. Questo permette una migliore visualizzazione della mobilità non aderenti delle cellule immunitarie in momenti specifici. È possibile raccogliere prove di altre funzioni delle cellule effettrici, quali citotossicità o il trasferimento di vettori virali da effettore alle cellule bersaglio, pure. Così, il metodo permette ai ricercatori di documentare microscopicamente cellula-cellula interazioni di differenzialmente-marcato, non aderente con cellule aderenti di vario tipo. Tali informazioni possono essere particolarmente rilevanti nella valutazione di tipi di cellule immunitarie biologicamente manipolati o attivati, in cui la prova visiva della funzionalità si desideri con cellule bersaglio tumorale prima di utilizzarli per la terapia del cancro.

Vettori virali codificanti per proteine ​​fluorescenti possono essere utilizzati in aggiunta o al posto di, colorante fluorescente. Trasduzione virale deve essere eseguita prima del dosaggio motilità. Entrambi i tipi di cellule aderenti e non aderenti possono essere differenzialmente etichettati. Il protocollo per la trasduzione dipenderà dal tipo di vettore impiegato. Qui, trasdotte il alloCTL nelle figure 3, 5 e 6 con RRV-EMD almeno due giorni di anticipo del test utilizzando il proto...

Descriviamo un protocollo per monitorare la mobilità radiale delle cellule immunitarie non aderenti in vitro utilizzando un collettore/apparato di vetrini per sedimentazione cellulare. La migrazione cellulare viene tracciata su monostrati di cellule tumorali o su proteine della matrice extracellulare. L'esame al microscopio ottico e a fluorescenza consente di osservare la mobilità cellulare e la funzionalità citotossica.

Radial Mobilità e citotossico Funzione retrovirale Replica vettoriale trasdotte, non aderente Alloresponsive Linfociti T

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è mostrare la migrazione dei linfociti T effettori non aderenti su un monocstrato di cellule tumorali aderenti. Questo risultato si ottiene innanzitutto stabilendo un monocstrato di cellule tumorali aderenti nelle pozzette di vetrini in teflon rivestiti con poli-D-lisina; successivamente, i linfociti T effettori marcati con fluorocromo vengono sedimentati al centro del monocstrato mediante un manifold per la sedimentazione cellulare. Infine, si utilizzano microscopia a luce e microscopia a fluorescenza per visualizzare la migrazione delle cellule non aderenti sul monocstrato.I risultati mostrano che la migrazione e le funzioni effettrici dei linfociti T non aderenti in co-coltura con un monostrato di cellule tumorali aderenti vengono mantenute dopo che i linfociti sono stati trasdotti con un vettore retrovirale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che la migrazione radiale dei linfociti T effettrici non aderenti può essere misurata in co-coltura con cellule tumorali aderenti. Questo ha implicazioni di vasta portata per i pazienti con tumori cerebrali primitivi o metastatici, poiché linfociti T citotossici allogenici modificati per esprimere un gene attivatore di profarmaci, come la citosina deaminasi, sono in fase di sperimentazione come approccio multimodale per l'eliminazione del tumore cerebrale.Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà nel formare monocapati di cellule tumorali aderenti a causa dell'eterogeneità della crescita cellulare tumorale riguardo alle caratteristiche di adesione. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi per generare un monocapato tumorale uniforme e una sedimentazione efficace delle L-O-C-T-L non aderenti richiedono una comprensione esperienziale delle caratteristiche di entrambi i tipi cellulari. Per iniziare, posizionare fino a quattro.10 vetrini con 10 pozzetti rivestiti in teflon in una piastra Petri sterile da 150 millimetri per 15 millimetri. Posizionare una piastra Petri da 35 millimetri per 10 millimetri contenente due o tre millilitri di acqua sterile accanto ai vetrini per fornire umidità. Successivamente, prerivestire i vetrini coprendo ogni pozzetto con una soluzione di 100 microgrammi per millilitro di poli-D-lisina o poli-L-lisina.Incubare i vetrini per un'ora a temperatura ambiente, quindi aspirare la soluzione e risciacquare due volte la superficie della piastra con PBS, utilizzando i pozzetti preparati con il campione. Raccogliere un flacone confluenziale di cellule tumorali aderenti. Contare il numero di cellule vitali mediante microscopia ottica, quindi sospendere le cellule a una concentrazione di cinque volte 10 alla sesta cellule per millilitro.In un mezzo di crescita tamponato, aggiungere da cinque a dieci microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto, a seconda del tipo di cellula tumorale; portare il volume del pozzetto a 40 microlitri con il mezzo e pipettare lentamente su e giù per distribuire uniformemente le cellule. Dopo aver seminato i pozzetti, lasciare sedimentare le cellule tumorali a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi posizionare il coperchio sulla piastra di Petri e trasferirla con attenzione in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%, e incubare per almeno 24 ore.Cambiare il mezzo di coltura nei pozzetti ogni giorno, rimuovendo con attenzione una parte del mezzo dal monostrato e sostituendolo con un volume maggiore di mezzo completo per linfociti T fresco. Le cellule di solito diventeranno confluenti nell'arco di uno a tre giorni, pronte per essere sedimentate sul monostrato di cellule tumorali. Raccogliere i linfociti T non aderenti ed etichettarli con un colorante per la proliferazione cellulare seguendo il protocollo del produttore almeno un'ora prima del saggio.Successivamente, posizionare la camera umidificata contenente i vetrini con le cellule tumorali all'interno della cappa a sicurezza biologica. Lavare le pozzette con PBS mediante pipettaggio, quindi aggiungere 45 microlitri di mezzo completo con siero al 10% nelle pozzette. Far scivolare un manifold sterile per la sedimentazione cellulare sulle pozzette fino a quando il gancio all'estremità del manifold tocca il fondo del vetrino.Assicurarsi che il mezzo sia visibile nei canali del manifold. Quindi, contare le cellule non aderenti e sospenderle a una-due volte 10 alla quinta cellule per microlitro nel mezzo.Disperdere delicatamente le cellule per eliminare eventuali aggregati cellulari che potrebbero interferire con la sedimentazione. Pipettare lentamente un microlitro della sospensione cellulare nel canale del manifold per ciascun pozzetto, quindi incubare l'apparato a temperatura ambiente per 20-30 minuti, consentendo alle cellule presenti nel canale di depositarsi sul monolayer.Dopo che le cellule si sono depositate, sollevare delicatamente il manifold in verticale senza toccare il vetrino. Assicurarsi che i pellet cellulari siano posizionati all'interno della circonferenza del canale del manifold. Utilizzando un microscopio, le cellule posizionate dovrebbero aderire leggermente al monostrato in modo che muovere delicatamente il vetrino non disperda il pellet.Dopo aver confermato che le cellule si sono sedimentate, trasferire il vetrino su un microscopio invertito dotato di una camera per anidride carbonica e umidità. Utilizzare l'obiettivo 4x per l'immagine in campo chiaro e in fluorescenza multicanale delle cellule. Acquisire immagini di una determinata area in campo chiaro e nei canali fluorescenti, quindi aggiungere le barre micrometriche mediante il software di acquisizione delle immagini.Conservare il vetrino in un incubatore umidificato tra i diversi tempi una volta acquisiti tutti i punti temporali. Trascinare e rilasciare i file delle immagini nel programma di editing delle immagini e selezionare l'opzione aggiungi livello per creare un file immagine con più livelli. Unire le immagini in luce visibile e quelle fluorescenti in un unico livello.Utilizzare il software di acquisizione per scattare immagini di un'area di otto millimetri per otto millimetri. Il software deve essere impostato per unire automaticamente le immagini acquisite utilizzando il canale meglio rappresentato in tutta la pozzetta. Se vengono acquisite solo immagini nei canali di fluorescenza, questo deve essere il canale per l'acquisizione delle cellule aderenti.In alternativa, le immagini possono essere unite utilizzando un software di elaborazione delle immagini. Questo processo avviene allineando le regioni delle immagini che si conservano da un'immagine all'altra e sovrapponendo le immagini una sull'altra fino a generare un'immagine completa. Unire le immagini insieme utilizzando il software di elaborazione delle immagini.Utilizzare le immagini combinate per creare mappe di intensità fluorescente della superficie con il software Image J, al fine di visualizzare l'aggregazione o la diffusione dei linfociti T nel tempo. Linfociti T citotossici alloreattivi umani, noti come Allo CTL, trasdotti con un vettore retrovirale competente per la replicazione che codifica per un gene di espressione della proteina fluorescente verde smeraldo, sono stati posizionati al centro di un monostrato di cellule di glioma. Dopo quattro ore, gli Allo CTL avevano formato aggregati visibili entro 24 ore.Apparvero chiazze vuote nel monostrato di cellule aderenti, indicando la lisi delle cellule tumorali e il fatto che alcuni CTL allo erano migrati oltre il bordo periferico. I CTL allo murini marcati con fluorescenza erano posizionati al centro di un monostrato di cellule di glioma marcate con fluorescenza dopo un'ora; dopo 48 ore, i CTL allo erano strettamente associati alle cellule di glioma e avevano migrato verso l'esterno rispetto al centro della superficie del monostrato. Le mappe di fluorescenza generate da queste immagini mediante il software ImageJ mostrano una migrazione significativa rispetto al centro dopo 48 ore.È importante cambiare quotidianamente il mezzo di coltura per il monostrato di cellule tumorali, al fine di mantenere condizioni di coltura ottimali. Inoltre, una volta acquisita dimestichezza, la sedimentazione delle cellule non aderenti dovrebbe richiedere circa 20 minuti seguendo questa procedura. Altri metodi, come il tracciamento del percorso cellulare, possono essere utilizzati per rispondere a domande riguardo alla velocità con cui i CTL allo reagiscono attraversando il monostrato o il tempo durante il quale rimangono in contatto con le cellule tumorali svolgendo le loro funzioni citotossiche.Questo protocollo aiuterà i ricercatori nel campo della terapia genica immunitaria a esplorare la migrazione di linfociti T modificati geneticamente in co-coltura con cellule tumorali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare cellule non aderenti e aderenti per la co-coltura e di come utilizzare il manifold per la sedimentazione cellulare per studiare la migrazione radiale orizzontale di cellule non aderenti su un monostrato di cellule tumorali.

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Impara a monitorare la migrazione radiale di linfociti T effettori non aderenti su monostrati di cellule tumorali usando un manifold di sedimentazione cellulare. Questo metodo consente di studiare la mobilità immunitaria in vitro.

Radial Mobilità e citotossico Funzione retrovirale Replica vettoriale trasdotte, non aderente Alloresponsive Linfociti T

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