Registrazione Light-evocato Risposte postsinaptica nei neuroni in Dark-adattati, i preparativi della retina del mouse Slice Utilizzando tecniche di patch clamp

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di ottenere registrazioni della risposta alla luce da neuroni retinici adattati al buio. Ciò si ottiene raccogliendo prima un occhio di topo. Il secondo passo consiste nell'isolare la retina e tagliarla per le preparazioni a fette.

Successivamente, la preparazione retinica viene montata e visualizzata su un microscopio per trovare una cellula bersaglio per le registrazioni del patch clamp. Dopo aver stabilito una configurazione di patch clamp per l'intera cella, viene applicato uno stimolo luminoso nelle vicinanze della cella. Infine, come la risposta elettrofisiologica simultanea può essere osservata attraverso il software di acquisizione.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'imaging KRC, è che la sensibilità di registrazione è elevata e che le cellule di registrazione possono essere identificate morfologicamente. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché lavorare nell'oscurità totale può essere difficile e disorientante per coloro che non sono abituati a farlo. Per iniziare una gamma, gli strumenti di dissezione e le pipette di trasferimento vicino al microscopio da dissezione.

L'area di lavoro sarà ben organizzata in modo che ogni strumento sia facilmente accessibile al buio. Quando è pronto, Dawn un visore a infrarossi per condurre la procedura al buio. Dopo l'eutanasia nucleare rapidamente gli occhi e metterli in una capsula di soluzione fredda per dissezione, conservata in una scatola scura funzionante al microscopio.

Trasferisci un occhio in un piatto con una soluzione di dissezione fredda. Continuamente gorgogliato con ossigeno. Per rimuovere la cornea e il cristallino, tenere il nervo ottico all'altra estremità del bulbo oculare per evitare che si muova e praticare un'incisione sulla parte superiore della cornea con un bisturi microchirurgico.

Estendere il taglio utilizzando un paio di forbici chirurgiche e rimuovere la cornea, lasciando un po' di sclera che la circonda. Quindi, afferra la lente con una pinza fine ed estraila lentamente. Una volta realizzata la conchiglia oculare, versare delicatamente la soluzione di dissezione ossigenata fredda nella conchiglia oculare con una piccola pipetta di trasferimento.

Lavora rapidamente per mantenere la forma della retina e usa una leggera pressione per identificare i lati dorsale e ventrale della retina. Utilizzare visori a infrarossi per identificare la linea che attraversa la conchiglia oculare retinica, passando vicino alla testa del nervo ottico. Questa linea passa principalmente attraverso il lato ventrale del nervo ottico e il lato, compreso il nervo ottico, è il lato dorsale.

A seconda dell'esperimento, fai un taglio sul lato ventrale o dorsale. Questo segna il lato non necessario ed è un utile indicatore per andare avanti. Quindi, rimuovere delicatamente il vitreo con una pinza extra fine senza toccare la retina.

Il vitreo è attaccato principalmente al fondo e al bordo esterno della conchiglia oculare. Poiché il vitreo potrebbe essere attaccato saldamente alla conchiglia oculare, procedere delicatamente per rimuovere il distacco della retina. Continuare a tirare fino a quando non si avverte più tensione.

Una volta isolata la retina, afferra la sclera e staccala delicatamente. Usando la parte posteriore della pinza, taglia la retina e getta la metà non necessaria nello stesso piatto di plastica. Taglia la retina rimanente in due pezzi per ogni pezzo.

Taglia i bordi per creare una lastra retinica e rifila i bordi pieghevoli. Quindi, utilizzare una grande pipetta di trasferimento per trasferire una lastra retinica su una lastra di vetro. Aspirare la soluzione in eccesso con una piccola pipetta e utilizzare un pezzo di carta da filtro per appiattire la lastra.

Posizionare delicatamente un pezzo della membrana filtrante sopra il fazzoletto utilizzando una piccola pipetta di trasferimento. Mettere una goccia di soluzione sezionante sulla membrana del filtro. Attendere circa 15 secondi mentre la soluzione si diffonde e aderisce il tessuto retinico alla membrana del filtro.

Una volta incollati insieme, versare altra soluzione di dissezione fredda sotto e intorno al filtro fino a quando la membrana non galleggia. Quindi, posizionare la membrana del filtro nella camera di affettamento e coprire con una soluzione dissecante. Lavorando rapidamente per garantire che la membrana non si asciughi, utilizzare il tritatutto per tagliare il tessuto retinico a fette.

Inserire un vetrino coprioggetti in plastica con guide per il grasso nella camera di affettatura. Trasferire una fetta di retina sopra le guide del grasso e ruotare la fetta di 90 gradi in modo che la sezione trasversale sia visibile. Premere la membrana filtrante sul vetrino coprioggetti prima di coprire i lati della carta da filtro con grasso.

Dopo che le fette si sono immobilizzate su un vetrino di plastica, trasferirlo in un piatto di plastica da 33 millimetri. Immergere la preparazione con una soluzione di dissezione al carbone e conservare ogni piatto in una scatola scura continuamente ossigenata. Per registrazioni con morsetto patch.

Adescare i tubi di profusione con il mezzo di punta e lasciare che tutte le bolle passino dal tubo. Dopo aver realizzato le pipette di registrazione con una polare di vetro, riempire nuovamente il puntale con la soluzione per pipette. Quindi, utilizzare un riempitore per micropipette per riempire circa un terzo della pipetta una volta riempita, conservare ogni pipetta in una scatola per pipette umida.

Quindi, accendi l'attrezzatura per le registrazioni delle piante di patch, inclusi l'amplificatore del computer, la telecamera CCD e il microscopio che lavorano in condizioni di oscurità. Posizionare una preparazione di fette di retina sul tavolino del microscopio con l'aiuto di un visore a infrarossi. Dopo che è stato immobilizzato, iniziare la perfusione continua.

Impostare la temperatura di perfusione da 33 a 37 gradi Celsius. Visualizzate la superficie della fetta con una videocamera CCD. Concentrati sulla posizione di destinazione.

Con i tipi di celle di destinazione risiedono, selezionare una cella dall'aspetto sano per una registrazione patch clat. Una volta identificata una cellula sana, posizionare una pipetta di registrazione in un portapipetta e far avanzare la pipetta fino alla preparazione della fetta. Quando è vicino alla preparazione della fetta, trovare la punta della pipetta con un microscopio.

Una volta che la punta della pipetta è visibile al microscopio, spostarla verso il basso verso la cellula target. Quindi, imposta l'amplificatore e regola la pipetta su pika amp. Cinque volt per amplificatore Nana.

Avviare un impulso elettrico continuo di circa cinque millivolt e circa 10 hertz e controllare la resistenza della pipetta. Una resistenza ideale è compresa tra cinque e 12 mega ohm. Per la maggior parte dei neuroni retinici.

Quando è pronta, utilizzare un boccaglio o una siringa per soffiare la soluzione interna fino a quando la punta della pipetta non si trova sulla superficie della cellula target. Quando la pressione positiva crea una piccola fossetta sulla superficie della cella, far avanzare leggermente la punta e smettere di soffiare. Se la resistenza della pipetta è in continuo aumento, lasciarla e monitorare la resistenza fino a quando non raggiunge più di un giga ohm.

Se la resistenza non aumenta spontaneamente, applicare delicatamente una pressione negativa fino a quando non diventa una giga tenuta. Dopo aver ottenuto la tenuta giga, modificare il potenziale di tenuta a meno 70 millivolt, quindi applicare una pressione negativa intermittente per rompere la membrana all'interno del puntale della pipetta. Quando viene realizzata l'intera configurazione della cella, la resistenza della pipetta può essere compresa tra 500 mega ohm e un giga ohm e la corrente capacitiva è osservabile.

Registrare la relazione IV da 80 a 40 millivolt negativi. A seconda del tipo di cella, verranno attivati diversi tipi di canali con gate di tensione. Infine, registra le correnti o le tensioni sinaptiche evocate dalla luce.

Questa preparazione a fette vista a 10 x mostra sia i fotorecettori che le cellule gangliari senza distacco dalla carta da filtro. Quando questa preparazione viene osservata con un obiettivo 60x, ogni strato cellulare viene osservato chiaramente. La luce evocata dai neuroni retinici è stata evocata in risposta a un passo luminoso.

L'ampiezza del picco e il tempo di decadimento variano a seconda del tipo e del sottotipo di cellula. Il tipo di cellula e il suo sottotipo morfologico sono stati rivelati mediante marcatura dello zolfo dopo registrazioni fisiologiche Dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada agli scienziati nel campo della ricerca sulla retina per studiare le funzioni della segnalazione visiva naturale, nonché i contributi dei meccanismi sinaptici.