Name: Registrazione Light-evocato Risposte postsinaptica nei neuroni in Dark-adattati, i preparativi della retina del mouse Slice Utilizzando tecniche di patch clamp (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Impara a registrare risposte postsinaptiche evocate dalla luce in neuroni retinici di topo adattati al buio utilizzando tecniche di patch clamp. Questo metodo consente registrazioni elettrofisiologiche ad alta sensibilità.

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Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 EY020533, WSU Startup Fund e sovvenzioni RPB.

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) presso la Wayne State University. 1. Preparazione della soluzione sperimentale <ol><li> Preparare la soluzione di dissezione 1 giorno a 1 settimana prima l&#39;esperimento vero e proprio. Utilizzare una soluzione tampone HEPES per la dissezione della retina a causa della sua forte capacità di buffering a temperature inferiori a 16. Mescolare tutti i prodotti chimici, come segue (in mm): 115 NaCl, KCl 2.5, 2.5 CaCl 2, 1.0 MgCl 2, 10 HEPES, 28 glucosio. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Conservare la soluzione in frigorifero fino a 1 settimana. </li><li> La soluzione di registrazione è medio Ames &#39;, che è un fluido spinale cerebrale artificiale (aCSF) progettato per preparazioni retina 17. Il giorno dell&#39;esperimento, pesare polvere Ames &#39;(4,4 g per 500 ml di soluzione) in un tubo. Inoltre, pesare NaHCO 3 (0,95 g per 500 ml di soluzione) e mescolare con la Apolvere mes. </li><li> Preparare la soluzione pipetta intracellulare per le registrazioni di patch clamp dal giorno dell&#39;esperimento. Mescolare tutti i prodotti chimici, come segue (in mm): 111 K-gluconato, 1.0 CaCl 2, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 10 NaCl, 1.0 MgCl 2, 5 ATP-Mg, e 1,0 GTP-Na. Aggiustare il pH a 7,2 con KOH. Filtrare la soluzione pipetta con un filtro a siringa convenzionale. Fai ~ 500 microlitri aliquote e memorizzarli in un congelatore o un congelatore. </li></ol> 2. Preparazione per la Giornata di Experiment <ol><li> La notte prima dell&#39;esperimento, posizionare un topo in una gabbia (C57BL / 6J o background simile, 4 - 8 settimane di vita, di sesso maschile), in uno spazio buio per O / N adattamento al buio. </li><li> Preparazione per la dissezione: <ol><li> Riempire dissezione soluzione (100-200 ml) in un bicchiere di vetro, posizionarlo sul ghiaccio, e la bolla con l&#39;ossigeno per almeno 10 min. </li><li> Avviare ossigenazione della scatola buia per la conservazione di preparazione della retina. </li><li> Preparare vetrini in plastica con guide di grasso per il riutilizzopreparazioni fetta fonodale e mettono ciascuno di essi in un piatto di plastica da 35 mm. </li><li> Collegare un nuovo lama di rasoio per un chopper (affettatrice tessuto). </li><li> Tagliare una membrana filtrante in due metà. Questo è per affettare retinica. </li><li> Allineare gli strumenti di dissezione e di trasferimento pipette vicino al microscopio da dissezione. L&#39;area di lavoro deve essere ben organizzato in modo che ogni strumento può essere facilmente accessibile al buio. </li></ol></li><li> Preparazione per le registrazioni di patch clamp: <ol><li> Sciogliere la polvere Ames &#39;e NaHCO 3 in acqua distillata (Ames 4,4 g e NaHCO 3 0.95g / 500 ml DDH 2 O). Medio Bubble Ames &#39;ossigeno misto (95% O 2 e 5% CO 2) per almeno 30 minuti, mentre il riscaldamento a una temperatura di registrazione (~ 35 ° C). Regolare il pH a 7,4 con NaHCO 3 mentre ancora ribolle. </li><li> Scongelare la soluzione pipetta interno durante la dissezione. Dopo lo scongelamento, aggiungere 0,01% solforodamina B per la colorazione intracellulare. </li></ol></li></ol> 3. retina Dissection <ol><li> In una stanza buia, eutanasia il mouse utilizzando anidride carbonica e pneumotorace bilaterale. Dopo 2 - 3 min usando l&#39;anidride carbonica, il mouse perderà coscienza. </li><li> Quando il mouse non risponde ad una presa di coda, enucleare rapidamente gli occhi e metterli in una soluzione di dissezione a freddo in un piatto di plastica. Eseguire il pneumotorace bilaterale per assicurare la morte dell&#39;animale. Memorizzare rapidamente l&#39;occhio nel piatto nella scatola buia. Utilizzare un visualizzatore a infrarossi per condurre la procedura nel buio. NOTA: In alternativa, isoflurano, decapitazione, o dislocazione cervicale può essere utilizzato per l&#39;eutanasia. Il metodo di eutanasia dovrebbe seguire le linee guida del National Institute of Health (NIH) e / o la cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale. </li><li> In una stanza buia, regolare il microscopio da dissezione e illuminazione ad infrarossi. Al microscopio, trasferire un occhio dal suo piatto in un piatto di plastica 10 centimetri won la soluzione dissezione raffreddato. Continuously bolla ossigeno attraverso il tubo posto sul fondo del piatto di plastica. Regolare il volume del flusso in modo che non sia troppo basso, ma assicurarsi che non è sufficiente a disturbare la dissezione. </li><li> Cornea e obiettivo la rimozione: <ol><li> Fare un&#39;incisione sulla parte superiore della cornea con un coltello micro-chirurgica. Tenendo il nervo ottico all&#39;altra estremità del bulbo oculare impedisce l&#39;occhio da movimento. Estendere il taglio utilizzando un paio di forbici chirurgiche. Tagliare la cornea con un po &#39;sclera intorno ad esso. </li><li> Afferra l&#39;obiettivo con una pinza sottile e tirare lentamente la lente fuori. Se il vitreo è troppo appiccicoso per rimuovere la lente, tagliare il vitreo con un paio di forbici. </li><li> Una volta che l&#39;occhio-tazza è fatta, versare lentamente il freddo, la soluzione dissezione ossigenata in oculare con una piccola pipetta di trasferimento. NOTA: Il bulbo oculare si sgonfia rapidamente dopo un incisione nella cornea. È importante mantenere la forma dell&#39;occhio come deformare l&#39;occhio durante questo proprocedura danneggia la retina e provocare il distacco di retina. </li></ol></li><li> Identificare i lati dorsale e ventrale della retina: NOTA: A causa della distribuzione non uniforme del verde e la luce ultravioletta (UV) Coni 18, che identifica una specifica area della retina è importante per le registrazioni di risposta di luce. <ol><li> Identificare la linea che attraversa l&#39;oculare retinica passando vicino alla testa del nervo ottico. Questa linea passa per lo più attraverso il lato ventrale del nervo ottico; lato compreso il nervo ottico è il lato dorsale, mentre l&#39;altro è ventrale 19. Vedere questo punto di riferimento chiaramente sotto spettatori infrarossi. </li><li> A seconda dello scopo dell&#39;esperimento, fare un taglio sul lato inutili. Questo sarà utile dopo aver isolato la retina dalla oculare. </li></ol></li><li> Rimozione del vitreo: <ol><li> Facoltativamente, incubare l&#39;occhio-tazza con ialuronidasi (0,5 mg / ml) per 15 min. </li><li> Rimuovere il vitreo con una pinza extra-fini. Il vitreo è principalmenteattaccato al fondo e il bordo esterno dell&#39;occhio tazza. Rimuovere delicatamente senza toccare o frugando la retina. Come il vitreo potrebbe essere strettamente collegato al oculare, rimuovere delicatamente per evitare il distacco della retina dall&#39;occhio-coppa. Continuare a tirare fino a quando non la tensione si fa sentire. NOTA: Questo passaggio è particolarmente importante per sezionare la retina del mouse; Tuttavia, non è un problema per le retine di altre specie come il ratto o salamander. </li></ol></li><li> Isolare la retina dall&#39;occhio-coppa. Afferra la sclera e staccare delicatamente la retina con la parte posteriore del forcipe. NOTA: Whole-mount preparati retina può essere fatto dalla retina isolata. Fare tre o quattro tagli ai bordi e appiattire la retina, o tagliare la retina in diversi pezzi. </li><li> Tagliare la retina e scartare il superfluo metà della retina (punto 3.5). Nello stesso piatto di plastica, tagliare la retina rimanente in due pezzi. Per ogni pezzo della retina, tagliare i bordi per effettuare unalastra della retina, e tagliare i bordi di piegatura. </li><li> Trasferire una lastra retinica su una lastra di vetro usando un grande pipetta di trasferimento (~ 2 ml). Aspirare la soluzione in eccesso con una piccola pipetta, utilizzare un pezzo di carta da filtro per appiattire la lastra, e quindi inserire rapidamente un pezzo della membrana filtrante sulla parte superiore del tessuto. <ol><li> Usando una piccola pipetta di trasferimento, una goccia di soluzione di dissezione sulla membrana del filtro. Attendere ~ 15 sec finché la soluzione estende su membrana. Durante questo tempo, il tessuto retinico si attacchi alla membrana filtrante. </li><li> Versare soluzione dissezione più freddo sotto e intorno al filtro. Il tessuto retinico con la membrana del filtro galleggerà. Afferra la membrana filtro con una pinza e posizionarlo nella camera di taglio. Versare dissezione soluzione sopra il tessuto, e memorizzare la preparazione in scatola buia. NOTA: La procedura descritta è critica. È importante eseguire questi passaggi rapidamente per garantire che i bastoni tessuto retinico ai mem filtribrane e non si secca. </li></ol></li><li> Utilizzando un chopper, tagliare il tessuto retinico a fette. Circa 200 micron di spessore è fattibile per gli studi di patch clamp. </li><li> Posizionare un coprioggetto di plastica con guide di grasso nella camera di taglio. Trasferire una fetta retina sopra le rotaie grasso su un vetrino coprioggetto di plastica. Ruotare la fetta 90 ° in modo che la sezione trasversale è visibile. Premere la membrana del filtro verso il basso sul vetrino, quindi, coprire i lati della carta da filtro con grasso. <ol><li> Dopo la fetta è immobilizzato su un coprioggetto di plastica, afferrare il coprioggetto e trasferirlo in un piatto di plastica da 35 mm. Versare soluzione dissezione a freddo sulla preparazione della retina e immergere la preparazione. Conservare ogni piatto nella scatola scura, che dovrebbe essere ossigenato continuamente. NOTA: L&#39;intera procedura deve essere fatto con cura in modo che la membrana filtro non è deformata. Altrimenti, la fetta retina separa facilmente dalla membrana del filtro. </li></ol></li></ol><ol><li> Preparazione di registrazione: <ol><li> Prime i tubi di perfusione con media Ames &#39;. Lasciare tutte le bolle di passare attraverso quando si riempie il tubo. </li><li> Fai pipette di registrazione patch clamp con un estrattore. Per riempire una pipetta con la soluzione di pipetta, tuffo nella parte posteriore di una pipetta per 1 minuto fino a quando la punta della pipetta è riempita. Successivamente, riempire ~ 1/3 della pipetta utilizzando un filler micro-pipetta. Conservare ogni pipetta in una scatola pipetta umido. </li><li> Accendere l&#39;apparecchio per le registrazioni di patch clamp; incluso il computer, amplificatore, telecamera CCD, e microscopio. </li></ol></li><li> Spegnere la luce della stanza. Mettere una preparazione fetta della retina sulla camera palco microscopio con un visualizzatore a infrarossi. Dopo che è immobilizzato, iniziare perfusione continua. Impostare la temperatura perfusione a 33 a 37 ° C. </li><li> Visualizza la superficie fetta con la fotocamera CCD. Focus sul luogo di destinazione in cui il ce bersagliotipi ll risiedono. Selezionare una cellula sana, cercando di patch clamp registrazione (ad esempio, dovrebbe avere superficie liscia di aspetto e la forma delle cellule buona). </li><li> Inserire una pipetta di registrazione in un supporto pipetta. Avanzare la pipetta alla preparazione fetta. Quando è vicino alla preparazione fetta (~ 2 mm sopra), trovare la punta della pipetta con il microscopio. Una volta che il puntale è visibile al microscopio, spostare la punta verso la cella di destinazione. </li><li> Impostare l&#39;amplificatore. Regolare la pipetta a 0 mV / 0 pA (azzeramento) e avviare un impulso elettrico continua di ~ 5 mV a ~ 10 Hz. Controllare la resistenza pipetta; resistenza ideale è compresa tra 5 e 10 MW per la maggior parte dei neuroni della retina. </li><li> Inizia soffia fuori dalla punta. Utilizzare un boccaglio, o utilizzare una siringa, per applicare pressione positiva quando la pipetta immerge nella soluzione del bagno. Continuo soffiare la soluzione interna finché la punta è sulla superficie della cellula bersaglio. <ol><li> Quando la pressione positiva fa una piccola fossetta thsuperficie cellulare e, avanzare la punta leggermente e smettere di soffiare fuori. Verificare la resistenza pipetta, che dovrebbe aumentare. Se è in continuo aumento, lasciarlo e monitorare la resistenza fino a raggiungere&gt; 1 GΩ (gigaseal). Se la resistenza non aumenta spontaneamente, applicare delicatamente pressione negativa fino a diventare un gigaseal. </li></ol></li><li> Dopo il gigaseal è raggiunto, modificare il potenziale tenendo a -70 mV. Quindi, applicare ad intermittenza pressione negativa alla rottura della membrana all&#39;interno della punta della pipetta. Quando viene effettuata la configurazione whole-cell, la resistenza pipetta può essere compreso tra 500 MW e 1 GΩ, e la corrente capacitiva è visto. A volte correnti postsinaptiche spontanee possono essere osservati. </li><li> Registrare il rapporto IV da -80 a +40 mV. Diversi tipi di canali voltaggio-dipendenti vengono attivati ​​a seconda del tipo di cellula. </li><li> Record luce evocata correnti sinaptiche o tensioni. </li></ol>

<ol><li>Werblin, F. S., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+retina+of+the+mudpuppy%2C+Necturus+maculosus+II.+Intracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Organization of the retina of the mudpuppy, Necturus maculosus II. Intracellular recording.</a> J Neurophysiol. 32 (3), 339-355 (1969).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Lukasiewicz, P., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+slowly+inactivating+potassium+current+truncates+spike+activity+in+ganglion+cells+of+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A slowly inactivating potassium current truncates spike activity in ganglion cells of the tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 8 (12), 4470-4481 (1988).</li>
<li>Kaneko, A., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+L-glutamate+on+the+anomalous+rectifier+potassium+current+in+horizontal+cells+of+Carassius+auratus+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of L-glutamate on the anomalous rectifier potassium current in horizontal cells of Carassius auratus retina.</a> J Physiol. 358, 169-182 (1985).</li>
<li>Kamermans, M., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA-mediated+positive+autofeedback+loop+controls+horizontal+cell+kinetics+in+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA-mediated positive autofeedback loop controls horizontal cell kinetics in tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 12 (7), 2451-2463 (1992).</li>
<li>Cook, P. B., McReynolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+inhibition+in+the+inner+retina+is+important+for+spatial+tuning+of+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lateral inhibition in the inner retina is important for spatial tuning of ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 1 (8), 714-719 (1998).</li>
<li>Pang, J. J., Gao, F., Wu , J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+current+responses+in+rod+bipolar+cells%2C+cone+depolarizing+bipolar+cells+and+AII+amacrine+cells+in+dark-adapted+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol.+558+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Light-evoked current responses in rod bipolar cells, cone depolarizing bipolar cells and AII amacrine cells in dark-adapted mouse retina.</a> J Physiol. 558 (Pt. 558 (Pt 3), 897-912 (2004).</li>
<li>Euler, T., Masland , R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+bipolar+cells+in+a+mammalian+retina%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of bipolar cells in a mammalian retina).</a> J Neurophysiol. 83 (4), 1817-1829 (2000).</li>
<li>Berntson, A., Taylor , W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+characteristics+and+receptive+field+widths+of+on-bipolar+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol.+524+Pt%22%5BJournal%5D)">Response characteristics and receptive field widths of on-bipolar cells in the mouse retina.</a> J Physiol. 524 Pt. 524 (Pt 3), 879-889 (2000).</li>
<li>Sterling, P., Smith, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+for+a+binary+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Design for a binary synapse.</a> Neuron. 41 (3), 313-315 (2004).</li>
<li>Borghuis, B. G., Marvin, J. S., Looger, L. L., Demb, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+nonlinear+glutamate+release+dynamics+at+bipolar+cell+synapses+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of nonlinear glutamate release dynamics at bipolar cell synapses in the mouse retina.</a> J Neurosci. 33 (27), 10972-10985 (2013).</li>
<li>Dowling, J. E., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+retinal+dystrophy+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inherited retinal dystrophy in the rat.</a> J Cell Biol. 14, 73-109 (1962).</li>
<li>Eggers, E. D., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28A%29%2C+GABA%28C%29+and+glycine+receptor-mediated+inhibition+differentially+affects+light-evoked+signalling+from+mouse+retinal+rod+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">GABA(A), GABA(C) and glycine receptor-mediated inhibition differentially affects light-evoked signalling from mouse retinal rod bipolar cells.</a> J Physiol. 572 (Pt 1), 215-225 (2006).</li>
<li>Ichinose, T., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mode+of+retinal+presynaptic+inhibition+switches+with+light+intensity%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mode of retinal presynaptic inhibition switches with light intensity).</a> J Neurosci. 32 (13), 4360-4371 (2012).</li>
<li>Ichinose, T., Fyk-Kolodziej, B., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+ON+cone+bipolar+cell+subtypes+in+temporal+coding+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Roles of ON cone bipolar cell subtypes in temporal coding in the mouse retina.</a> J Neurosci. 34 (26), 8761-8771 (2014).</li>
<li>Baicu, S. C., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-base+buffering+in+organ+preservation+solutions+as+a+function+of+temperature%3A+new+parameters+for+comparing+buffer+capacity+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency.</a> Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li>
<li>Haverkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primordial%2C+blue-cone+color+system+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The primordial, blue-cone color system of the mouse retina.</a> J Neurosci. 25 (22), 5438-5445 (2005).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
<li>Farre, C. G., M Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+screening+-+automated+patch+clamp+on+the+rise%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery+today.+Technologies%22%5BJournal%5D)">Ion channel screening - automated patch clamp on the rise.</a> Drug discovery today. Technologies. 5 (1), e1-e34 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Una buona registrazione può essere ottenuta solo con una buona preparazione della retina e configurazioni di patch clamp ben progettate. Sebbene tutti i passaggi sopra descritti siano importanti, la discussione evidenzia alcuni passaggi critici sia per la dissezione che per le registrazioni. 
Per la dissezione, due cose sono particolarmente importanti: il raffreddamento e l'ossigenazione. Dopo aver enucleato l'occhio, rimuovere rapidamente la parte anteriore dell'occhio in una camera di dissez...

La retina è una delle parti uniche del sistema nervoso. Essendo una parte accessibile del cervello, la sua architettura sinaptica è stata ben caratterizzata. Inoltre, le funzioni di questa rete neurale possono essere esaminate con uno stimolo fisiologico: la luce. Se il tessuto retinico viene isolato in una camera buia con procedure appropriate, i neuroni nel tessuto risponderanno alla luce. Questa preparazione è stata utilizzata per studiare l'elaborazione del segnale visivo e chiarire vari meccanismi sinaptici e funzioni della rete neurale, nonché i meccanismi della malattia. 
Le risposte alla luce nei neuroni retinici sono state registrate per decenni. I primi studi hanno utilizzato elettrodi affilati per effettuare registrazioni intracellulari dai neuroni retinici del cucciolo di fango1. Negli anni '80, la tecnica del patch clamp è stata inventata2 e presto è diventata un metodo popolare tra i ricercatori della vista3,4. Le registrazioni di singole cellule da vertebrati inferiori, inclusi i neuroni retinici di fango e pesce, sono stati metodi popolari che hanno contribuito a chiarire i meccanismi di elaborazione del segnale visivo5,6. 
Dopo che sono state sviluppate tecniche di mutazione genetica, la retina del topo è diventata un modello più popolare per i ricercatori della visione7-9. La retina dei mammiferi è più attraente di quella dei vertebrati inferiori perché è evolutivamente più vicina alla retina umana e c'è l'opportunità di utilizzare modelli di malattia. Tuttavia, le cellule retiniche di topo sono piccole e fragili10 e fare preparazioni retiniche e condurre registrazioni con patch clamp in una stanza buia è impegnativo. Con il miglioramento della tecnologia, sono diventati disponibili diversi approcci per studiare i meccanismi di segnalazione visiva, come gli studi di imaging11 e l'elettroretinogramma (ERG)12. Tuttavia, la registrazione di singole cellule con il metodo patch clamp è ancora importante perché è altamente sensibile dal punto di vista temporale e spaziale rispetto ad altri metodi. Pertanto, abbiamo condotto continuamente registrazioni di patch clamp e migliorato i nostri metodi per studiare l'elaborazione del segnale visivo nelle preparazioni di fette di retina di topo13-15.
In questo video tutorial, i protocolli vengono presentati con suggerimenti importanti. Una buona registrazione può essere ottenuta solo con una buona preparazione. Esercitarsi nella dissezione animale e costruire un robusto patch clamp rig consentirà alla maggior parte dei ricercatori di ottenere registrazioni di successo.

<table><tbody><tr><td>Topi (28-60 giorni, maschio)</td><td>Jackson laboratory</td><td>C57BL/6J ceppo</td><td></td></tr><tr><td>Ames' polvere media</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td>eccellente</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>eccellente</td></tr><tr><td>Strumento di dissezione: pinze</td><td>Dumont</td><td>#4, #5, #55</td><td>eccellente</td></tr><tr><td>Strumento di dissezione: forbici</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td>eccellente</td></tr><tr><td>Strumento di dissezione: coltello chirurgico</td><td>Surgistar</td><td>7514</td><td>eccellente</td></tr><tr><td>lama di rasoio (per elicottero)</td><td>EMS</td><td>71970</td><td>eccellente</td></tr><tr><td>Chopper</td><td>fatto a mano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visualizzatore a infrarossi</td><td>Night Owl Optics</td><td>NOBG1</td><td>Mostra una visione luminosa. La messa a fuoco di piccoli oggetti è un problema.</td></tr><tr><td>Estrattore</td><td>Sutter</td><td>P-1000</td><td>eccellente; produce pipette di dimensioni costanti.</td></tr><tr><td>Dark box</td><td>Pelican</td><td>dark box</td><td>eccellente</td></tr><tr><td>sistema di bloccaggio patch</td><td>Scientifica</td><td>slice scope 2000</td><td>Ottima configurazione. La maggior parte dei componenti chiave sono inclusi in un unico pacchetto. I micromanipolatori sono eccellenti.</td></tr><tr><td>Amplificatore</td><td>Molecular Devices</td><td>multiclamp 700B</td><td>Controllo eccellente e facile.</td></tr><tr><td>Software di acquisizione</td><td>Software Molecular Devices</td><td>pClamp</td><td>Controllo eccellente e semplice.</td></tr><tr><td>Sorgente luminosa (LED)</td><td>Cool LED</td><td>pE-2 Sistema a 4 canali</td><td>Eccellente</td></tr><tr><td>telecamera CCD</td><td>Q-imaging</td><td>Retiga 2000</td><td>Eccellente</td></tr><tr><td>gabbia di Faraday</td><td>fatta a mano</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

registrazione light-evocato risposte postsinaptica nei neuroni in dark-adattati, i preparativi della retina del mouse slice utilizzando tecniche di patch clamp

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

La retina è la porta verso il sistema visivo. Per comprendere i meccanismi di elaborazione dei segnali visivi, indaghiamo funzioni di rete neurale della retina. I neuroni della retina nella rete comprendono numerosi sottotipi. Più di 10 sottotipi di cellule bipolari, cellule gangliari, e le cellule amacrine sono stati identificati da studi morfologici. Più sottotipi di neuroni della retina sono pensati per codificare le caratteristiche distinte di segnalazione visiva, come il movimento e il colore, e la forma più percorsi neurali. Tuttavia, i ruoli funzionali di ciascun neurone nel trattamento del segnale visivo non sono pienamente compresi. Il metodo di patch clamp è utile per affrontare questa questione fondamentale. Qui, un protocollo per registrare risposte sinaptiche luce evocati nel topo neuroni della retina con delle patch clamp registrazioni in condizioni di oscurità adattato è fornito. Gli occhi del mouse sono dark-adattato O / N e preparazioni fetta della retina vengono sezionati in una stanza buia con illuminazione ad infrarossi e gli spettatori. Luce infrarossa non lo faattivare fotorecettori mouse e conserva quindi la loro capacità di risposta luce. Patch clamp viene utilizzato per registrare le risposte luce evocata nei neuroni della retina. Un colorante fluorescente viene iniettato durante le registrazioni per caratterizzare sottotipi morfologiche neuronali. Questa procedura permette di determinare le funzioni fisiologiche di ogni neurone nella retina mouse.

Una preparazione fetta rappresentativo è mostrato in Figura 1. La preparazione fetta è in posizione diritta, mostrando fotorecettori alle cellule gangliari in una superficie piana, e nessun distacco dalla carta da filtro. Se la porzione è inclinato, solo una parte della preparazione è a fuoco, il che rende difficile identificare una cella appropriata di patch serraggio. Per le registrazioni, è importante scegliere un buon soma, che di solito ha una superficie lucida, una forma rotonda ancora, e non visi...

Dimostreremo come preparare fette di retina dall'occhio del topo e registrare le risposte alla luce nei neuroni retinici. L'intera procedura viene eseguita in condizioni adattate al buio.

Registrazione Light-evocato Risposte postsinaptica nei neuroni in Dark-adattati, i preparativi della retina del mouse Slice Utilizzando tecniche di patch clamp

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è ottenere registrazioni della risposta alla luce da neuroni retinici adattati al buio. Questo viene raggiunto innanzitutto prelevando l'occhio di un topo. Il secondo passo consiste nell'isolare la retina e tagliarla per preparare delle sezioni. Successivamente, il preparato retinico viene montato e osservato al microscopio per individuare una cellula bersaglio per le registrazioni mediante tecnica del patch clamp. Dopo aver stabilito una configurazione del patch clamp in modalità cella intera, uno stimolo luminoso viene applicato nelle vicinanze della cellula. Infine, la risposta elettrofisiologica simultanea può essere osservata tramite un software di acquisizione.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'imaging KRC è l'elevata sensibilità di registrazione e la possibilità di identificare morfologicamente le cellule registrate. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché lavorare al buio totale può risultare complesso e disorientante per chi non è abituato. Per iniziare un'esperimento, posizionare gli strumenti da dissezione e le pipette di trasferimento vicino al microscopio stereoscopico.Lo spazio di lavoro sarà ben organizzato in modo che ogni strumento possa essere facilmente accessibile al buio. Quando si è pronti, utilizzare un visore a infrarossi per eseguire la procedura al buio. Dopo l'eutanasia, enucleare rapidamente gli occhi e posizionarli in una capsula contenente soluzione fredda per dissezione, mantenuta all'interno di una scatola oscura e operando al microscopio.Trasferire un occhio in una piastra contenente soluzione di dissezione fredda, continuamente saturata con ossigeno. Per rimuovere la cornea e il cristallino, tenere fermo il nervo ottico all'estremit&agrave; opposta del bulbo oculare per impedirne il movimento ed effettuare un'incisione nella parte superiore della cornea con un bisturi microchirurgico.Allarga l'incisione utilizzando un paio di forbici chirurgiche ed asporta la cornea, lasciando una parte della sclera che la circonda. Successivamente, afferra il cristallino con pinzette fini ed estrailo lentamente. Una volta preparato il contenitore oculare, versa delicatamente nel contenitore una soluzione dissetante ossigenata e fredda, utilizzando una pipetta di trasferimento piccola.Lavorare rapidamente per mantenere la forma della retina ed esercitare una pressione delicata per identificare i lati dorsale e ventrale della retina. Utilizzare visori a infrarossi per identificare la linea che attraversa la coppa oculare retinica, passando vicino alla testa del nervo ottico. Questa linea attraversa principalmente il lato ventrale del nervo ottico e il lato che include il nervo ottico è il lato dorsale.A seconda dell'esperimento, effettuare un taglio sul lato ventrale o dorsale. Questo indica il lato non necessario ed è un marcatore utile per i passaggi successivi. Successivamente, rimuovere delicatamente l'umor vitreo con pinzette molto fini senza toccare la retina.Il vitreo è principalmente attaccato alla parte inferiore e al margine esterno della coppa oculare. Poiché il vitreo potrebbe essere fortemente aderente alla coppa oculare, procedere delicatamente per rimuovere il distacco della retina. Continuare a tirare fino a quando non si avverte alcuna tensione.Una volta isolata la retina, afferrare la sclera e staccare delicatamente la retina. Utilizzando la parte posteriore della pinzetta, tagliare la retina e scartare la metà non necessaria nella stessa capsula di plastica. Tagliare la retina rimanente in due pezzi per ogni pezzo.Tagliare i bordi per ottenere una sezione retinica e rifinire i bordi piegati. Successivamente, utilizzare una pipetta di trasferimento grande per trasferire una sezione retinica su una piastra di vetro. Aspirare la soluzione in eccesso con una pipetta piccola e utilizzare un pezzo di carta filtrante per appiattire la sezione.Posizionare delicatamente un pezzo della membrana filtrante sopra il tessuto utilizzando una piccola pipetta di trasferimento. Applicare una goccia di soluzione di dissezione sulla membrana filtrante. Attendere circa 15 secondi mentre la soluzione si diffonde e attacca il tessuto retinico alla membrana filtrante.Una volta attaccati, versare ulteriore soluzione dissetante fredda sotto e intorno al filtro finché la membrana non galleggia. Successivamente, posizionare la membrana filtrante nella camera di taglio e coprirla con soluzione dissetante. Lavorando rapidamente per assicurarsi che la membrana non si secchi, utilizzare il tritatore per tagliare il tessuto retinico in fette.Posizionare un vetrino di plastica con rotaie di grasso nella camera di taglio. Trasferire una sezione retinica sopra le rotaie di grasso e ruotare la sezione di 90 gradi in modo che la sezione trasversale sia visibile. Premere la membrana filtrante sul vetrino prima di ricoprire i lati della carta filtrante con grasso.Dopo aver immobilizzato le sezioni su un coprioggetto di plastica, trasferirlo in una piastra di plastica da 33 millimetri. Immergere il preparato in soluzione fisiologica per dissezione e conservare ogni piastra in una scatola scura continuamente ossigenata. Per le registrazioni con tecnica del patch clamp.Prima di tutto, spurgare le cannule di perfusione con il mezzo aims, facendo uscire tutte le bolle dalle tubazioni. Dopo aver preparato le pipette di registrazione con un polarizzatore di vetro, riempire retroattivamente la punta con la soluzione per pipetta. Successivamente, utilizzare un ausilio per micropipetta per riempire circa un terzo della pipetta; una volta riempita, conservare ogni pipetta in una scatola per pipette umida.Successivamente, accendere l'apparecchiatura per le registrazioni su preparati vegetali, inclusi il computer, l'amplificatore, la telecamera CCD e il microscopio che lavorano in condizioni di oscurità. Posizionare un preparato di fetta retinica sul piano del microscopio avvalendosi di un visore a infrarossi. Dopo che il preparato è stato immobilizzato, iniziare la perfusione continua.Impostare la temperatura di perfusione tra 33 e 37 gradi Celsius. Visualizzare la superficie della sezione con una telecamera CCD. Mettere a fuoco sulla posizione target.Una volta individuati i tipi cellulari bersaglio, selezionare una cellula dall'aspetto sano per una registrazione patch-clamp. Dopo aver identificato una cellula sana, posizionare una pipetta di registrazione in un supporto per pipetta e avanzare la pipetta verso il preparato di sezione. Quando la pipetta è vicina al preparato di sezione, localizzarne la punta mediante microscopio.Una volta che la punta della pipetta è visibile al microscopio, abbassare la punta verso la cellula bersaglio. Successivamente, impostare l'amplificatore e regolare la pipetta al pika amp. Cinque volt per nanoampere.Avviare un impulso elettrico continuo di circa cinque millivolt e circa 10 hertz e verificare la resistenza della pipetta. Una resistenza ideale è compresa tra cinque e 12 megaohm. Per la maggior parte dei neuroni retinici.Quando pronto, utilizzare un boccaglio o una siringa per espellere la soluzione interna finché la punta della pipetta non raggiunge la superficie della cellula bersaglio. Quando la pressione positiva crea una piccola depressione sulla superficie cellulare, avanzare leggermente la punta e interrompere l'espulsione. Se la resistenza della pipetta aumenta continuamente, lasciarla in posizione e monitorare la resistenza fino a quando non supera un gigaohm.Se la resistenza non aumenta spontaneamente, applicare delicatamente una pressione negativa fino a ottenere un sigillo giga. Una volta raggiunto il sigillo giga, modificare il potenziale di mantenimento a meno 70 millivolt, quindi applicare intermittente pressione negativa per rompere la membrana all'interno della punta della pipetta. Quando viene ottenuta la configurazione whole cell, la resistenza della pipetta può variare tra 500 megaohm e un gigaohm, ed è osservabile la corrente capacitiva.Registrare la relazione intensità-tensione (IV) da -80 a 40 millivolt. Diversi tipi di canali attivati dalla tensione verranno attivati a seconda del tipo cellulare. Infine, registrare le correnti o le tensioni sinaptiche evocate dalla luce.Questa preparazione di fetta osservata a 10 x mostra sia i fotorecettori che le cellule gangliari, senza distacco dalla carta filtro. Quando questa preparazione viene osservata con un obiettivo da 60 x, ogni strato cellulare è chiaramente visibile. Potenziali postsinaptici eccitatori evocati dalla luce nei neuroni retinici sono stati registrati in risposta a uno stimolo luminoso a gradino.L'ampiezza del picco e il tempo di decadimento variano a seconda del tipo e sottotipo cellulare. Il tipo cellulare e il suo sottotipo morfologico sono stati rivelati mediante marcatura con zolfo dopo le registrazioni fisiologiche, a seguito del loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello studio della retina per indagare le funzioni della segnalazione visiva naturale, nonché i contributi dei meccanismi sinaptici.

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