Name: Quantificazione del immunosoppressore Tacrolimus su macchie di sangue secco Uso LC-MS / MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Impara a quantificare il tacrolimus su macchie di sangue secco con LC-MS/MS per il monitoraggio terapeutico dei farmaci. Questo metodo minimamente invasivo migliora la compliance del paziente.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato dalla Federal Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti HHSF223201310224C contratto e dalla sovvenzione 1U01FD004573-01 del National Institutes of Health/FDA degli Stati Uniti.

Campioni di sangue de-identificati da individui sani sono stati presso la University of Colorado Hospital (Aurora, Colorado). L&#39;uso di campioni di sangue di banca de-identificati per gli studi di validazione, così come per la preparazione di calibratori e campioni di controllo di qualità è stato considerato &quot;esente&quot; dal Review Board Colorado multi-istituzionale (COMIRB, Aurora, Colorado). 1. Preparazione dei riferimenti e soluzioni <ol><li> Acquisto tacrolimus e lo standard interno D 2, 13 C-tacrolimus dai venditori elencati nella Lista dei materiali. <ol><li> Preparare soluzioni in metanolo puro ad una concentrazione di 1 mg / ml per tacrolimus e una concentrazione di 10 ug / ml per D 2, 13 C-tacrolimus. Fai soluzioni stock di materiali di riferimento sulla base di tre ponderazioni indipendenti. Soluzioni madre aliquote e conservare a -70 ° C o al di sotto. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione per precipitare le proteineed estrarre tacrolimus usando metanolo / 0,2 M ZnSO4 in acqua (7: 3, v: v). Questa soluzione contiene anche lo standard D interna 2, 13 C-tacrolimus ad una concentrazione di 2,5 ng / ml ed è usato per l&#39;estrazione di tutti i campioni eccetto per l&#39;estrazione di campioni bianchi (vedere 1.3.3). <ol><li> Preparare questa soluzione proteica precipitazione fresco ogni giorno estrazione e impostare la scadenza della soluzione a 12 hr. </li></ol></li><li> Preparazione della curva di calibrazione e di controllo della qualità (QC) campioni <ol><li> Preparare soluzioni di tacrolimus eseguendo appropriate diluizioni della soluzione di riserva utilizzando metanolo puro. </li><li> Per preparare calibratori e campioni di controllo di qualità, picco di 20 ml di soluzione madre opportunamente diluito in EDTA sangue intero, incubare a 37 ° C sotto leggera agitando in un bagno d&#39;acqua per consentire la distribuzione omogenea tacrolimus nelle cellule ematiche per 20 min e un&#39;aliquota in 1,5 ml polipoTubi ropylene con fondo conico e scatto coperchi. Assicurarsi che il volume relativo di solvente organico non supera il 5%. </li><li> Spot 50 ml di sangue intero a spillo nel centro di ogni cerchio sulle carte filtro utilizzando una pipetta. </li><li> Asciugare le macchie di sangue sulle schede di filtro a temperatura ambiente per 3 ore. </li><li> Preparare gli standard di calibrazione tacrolimus in EDTA umano sangue intero a concentrazioni di tacrolimus di 1, 2,5, 5, 10, 25, e 50 ng / ml. Preparare un campione in bianco per l&#39;estrazione, come gli standard di calibrazione con la soluzione di precipitazione delle proteine ​​contenente lo standard D interno 2, 13 C-tacrolimus (&quot;campione zero&quot;). </li><li> Preparare i campioni QC in EDTA sangue umano a concentrazioni di 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml. Preparare un campione in bianco. In contrasto con i campioni QC che sono estratti con precipitazione contenente lo standard interno D 2, 13 C-tacrolimus, estrarre il campione bianco con soluzione proteica precipitazione che fanon contiene lo standard D interno 2, 13 C-tacrolimus (&quot;campione in bianco&quot;). </li></ol></li><li> Raccolta dei campioni clinici <ol><li> Raccogliere macchie di sangue essiccato come descritto in 43,44. </li></ol></li></ol> 2. Estrazione di Tacrolimus sangue secco Spot Campioni <ol><li> Ispezionare visivamente la macchia di sangue secco per garantire la qualità del campione accettabile e il volume 45. </li><li> Centro Pugno del macchia di sangue sulla carta filtro con una perforazione di 6 mm. Nota: La qualità dei punzoni può essere monitorato mediante pesatura. Un disco filtro saturo perforato pesa media 5.02 mg ± 0,09 mg (range: 4.83- 5.14 mg, n = 12). </li><li> I dischi posto in provette da 1,5 ml in polipropilene con fondo conico e coperchi a innesto rapido. </li><li> Aggiungere 20-30 proiettili per ogni provetta. </li><li> Aggiungere 500 microlitri della soluzione di precipitazione delle proteine ​​(metanolo: 0.2 M ZnSO4, 7: 3, v: v con 2,5 ng / ml di standard interno) in ogni provetta. Per il extrazione di campioni bianchi, usare la soluzione di precipitazione proteica senza standard interno. </li><li> Omogeneizzare i dischi nel frullatore proiettile per 1 min (velocità massima, impostando &quot;10&quot;). </li><li> Agitare campioni a RT su multi-tubo vorticoso (velocità massima, impostando &quot;10&quot;) per 10 min. </li><li> Centrifugare i campioni a 16.000 xg e 4 ° C per 10 min. </li><li> Trasferire il surnatante in fiale di vetro HPLC dotata di inserto 300 microlitri. Utilizzare guarnizioni in Teflon di pre-taglio. Nota: Estratto campioni possono essere conservati a -20 ° C o meno fino al momento dell&#39;analisi LC-MS / MS. </li></ol> 3. LC-MS / MS Analysis <ol><li> Carico 100 pl del supernatante del campione estratto nella colonna di estrazione cartuccia C8 e lavare con 7: 3 rapporto di 0,1% di acido formico in acqua: acetonitrile ad un flusso di 5 ml / min per 1 min. Le connessioni della valvola di commutazione sono mostrati in Figura 2 e il gradiente gestito dalla pompa di estrazione in Tabella 1 </strong&gt;. </li><li> Di seguito, attivare la valvola di commutazione con conseguente back-flush degli analiti dalla precolonna sulla colonna analitica. </li><li> Impostare il termostato a colonna a 65 ° C. </li><li> Eluire gli analiti dalla colonna analitica utilizzando le portate e gradiente mostrati nella Tabella 1. </li><li> Collegare la colonna analitica di uno spettrometro di massa tandem con la fonte di ionizzazione elettrospray turbo. Regolare i parametri chiave della spettrometro di massa in base alla tabella 2. </li><li> Rileva ioni positivi ([M + Na] +) nella modalità di reazione multipla (MRM). Utilizzare i seguenti passaggi di ioni per la quantificazione: tacrolimus: m / z (massa / carica) = 826,6 → 616,2 e D 2, 13 C-tacrolimus: m / z = 829,6 → 619,2. Nota: Il tempo totale di esecuzione è di 4,6 minuti. </li></ol> 4. Quantificazione <ol><li> Per ogni corsa, generare una curva di calibrazione in base ai calibratori preparati in 1.3.5 eincludere in ogni seduta analitica. <ol><li> Generare un diagramma di taratura riportando le concentrazioni nominali rispetto al fattore di risposta di analiti (Peak Area [Analita] / Peak Area [standard interno]) utilizzando il software spettrometro di massa. </li><li> Montare i calibratori utilizzando un fit quadratico in combinazione con 1 / X ponderazione. </li></ol></li><li> Per tacrolimus quantità nelle macchie di sangue essiccato integrare il tacrolimus e dello standard interno nei cromatogrammi MRM estratti. Calcolare il fattore di risposta per il tacrolimus (Peak Area [Analita] / Peak Area [standard interno]) e confrontare con la curva di calibrazione utilizzando il software spettrometria di massa. </li></ol> 5. Procedure di convalida <ol><li> Limite inferiore di rilevamento (LLOD) e il limite inferiore di quantificazione (LLOQ). <ol><li> Si consideri la concentrazione tacrolimus più basso con un rapporto picco-a-rumore di 4: 1 come limite inferiore di rilevamento (LLOD). Definire il limite inferiore di quantificazione (LLOQ) comeconcentrazione più bassa della curva di calibrazione con precisione uguale o superiore a ± 20% deviazione dalla concentrazione nominale e precisione uguale o migliore del 20% (coefficiente di varianza). </li></ol></li><li> Intra e inter-precisioni giorno e precisioni. <ol><li> Testare l&#39;accuratezza e la precisione a quattro livelli di concentrazione di 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) e 40 ng / ml (QC4). </li><li> Preparare i campioni QC su ogni giorno di convalida nel sangue intero EDTA umano, asciutto su schede di filtro, estrarre e analizzare come descritto sopra. </li><li> Determinare accuratezza e la precisione intra-day con 6 campioni per livello di concentrazione di QC. </li><li> Valutare accuratezza e la precisione inter-giorno per 20 giorni. Misurare ogni livello di controllo qualità con 4 campioni al giorno. </li><li> Analizzare due curve di calibrazione insieme con i campioni di QC su ogni giorno. </li><li> Calcola la precisione intra-day come% della concentrazione nominale (sei campioni per livello di concentrazione, vedere 5.2.2). Calcprecisione Ulate come coefficiente di variazione (CV%). </li><li> Considerare la precisione intra-day accettabile se rientra nella accettazione limita l&#39;85% al ​​115% della concentrazione nominale. Considerare precisione intra-day accettabile se è uguale o migliore di un CV (coefficiente di varianza) del 15%. </li><li> Calcola accuratezza e la precisione inter-giorno come la media per ogni livello di concentrazione QC analizzato nel corso dei 20 giorni di convalida. </li><li> Considerare media accuratezza inter-giorno accettabile se rientra nella accettazione limita l&#39;85% al ​​115% della concentrazione nominale. Considerare precisione inter-giorno accettabile se è uguale o migliore di un CV (coefficiente di varianza) del 15%. </li></ol></li><li> Esclusione di interferenze della matrice. <ol><li> Per l&#39;esclusione di interferenze che possono essere causati da segnali a matrice, analizzare vuote macchie di sangue essiccato (8 differenti individui, preferibilmente 4 maschi e 4 femmine). </li><li> Controllare visivamente cromatogrammi ionici. Se i picchi entro il tempo di ritenzionefinestra di tacrolimus vengono rilevati, integrare e confrontare le loro aree sotto la curva con quelle dei picchi di tacrolimus in campioni bianco arricchito con tacrolimus al LLOQ. L&#39;area dei picchi nei campioni bianchi non dovrebbero superare il 15% di quelli di tacrolimus al LLOQ. </li></ol></li><li> Ion soppressione / valorizzazione di ioni. <ol><li> Utilizzare un protocollo di infusione post-colonna come descritto 45 per valutare la potenziale interferenza di valorizzazione ioni di soppressione / ioni causati da componenti della matrice coeluiti. </li><li> Infondere tacrolimus ad una concentrazione di 10 ug / ml disciolti in 0,1% di acido formico: metanolo (30:70, v / v) post-colonna ad una velocità di 10 ml / min. <ol><li> Collegare una pompa a siringa con pezzo a T tra la colonna analitica e la sorgente electrospray dello spettrometro di massa. </li><li> Monitorare l&#39;intensità del segnale MS / MS delle transizioni MRM per tacrolimus ed il suo standard interno (m / z = 826,6 → 616,2 e m / z = 829,6 → 619,2) dopo l&#39;iniezione di estrated campioni bianchi (n = 8 campioni provenienti da diversi individui). Nota: In assenza di enhancement ione soppressione / ione del segnale continuo causato dalla infusione di analiti non deve essere influenzata mediante iniezione della matrice vuota, mentre soppressione ionica provoca un tuffo del segnale e ione enhancement un picco. </li></ol></li></ol></li><li> Riporto. <ol><li> Valutare il potenziale riporto analizzando estratti campioni bianchi dopo i massimi calibratori (50 ng / ml, n = 6). </li><li> Controllare visivamente cromatogrammi ionici. Se vengono rilevati picchi all&#39;interno della finestra del tempo di ritenzione di tacrolimus, integrare e confrontare le loro aree sotto la curva con quelle dei picchi di tacrolimus in campioni bianco arricchito con tacrolimus al LLOQ. L&#39;area dei picchi nei campioni bianchi non dovrebbero superare il 15% di quelli di tacrolimus al LLOQ. </li></ol></li><li> Recuperi estrazione. <ol><li> Determinare recuperi confrontando i segnali degli analiti dopo l&#39;estrazione del QC samples a tutti e quattro i livelli di concentrazione (n = 6 per concentrazione) con quelli di vuoto macchie di sangue essiccato a spillo con i corrispondenti importi di tacrolimus dopo l&#39;estrazione. </li><li> Preparare quattro serie di QC (livelli di concentrazione: 2, 4, 20, 40 ng / ml). </li><li> Preparare un altro 4 serie di corrispondenti &quot;campioni di prova di ripristino&quot; individuando 50 ml di sangue intero EDTA bianco sulle carte di carta filtro e asciugare per 2 ore. </li><li> Hereafter, sia per il controllo di qualità e in bianco &quot;campioni di prova di recupero&quot;, tagliare l&#39;intera macchia di sangue sulla carta filtro con le forbici e inserire i dischi risultanti in un tubo di polipropilene con fondo conico e coperchio a scatto. </li><li> Estrarre tutti i campioni. </li><li> Trasferire il surnatante (400 microlitri) in fiale HPLC vetro. </li><li> Aggiungere tacrolimus soluzione madre alle vuote &quot;campioni di prova di recupero estratto&quot; per raggiungere concentrazioni di 2, 4, 20 e 40 ng / ml (4 l di 200, 400, 2.000, 4.000 ng / ml tacrolimus magazzino solutions a 400 ml di surnatante). </li><li> Dopo l&#39;analisi LC-MS / MS, confrontare i segnali in entrambi i campioni QC e &quot;campioni di prova di recupero&quot; della corrispondente concentrazione (recupero% = campioni del segnale diluiti prima che i campioni di estrazione / segnale spillo dopo l&#39;estrazione x 100). </li></ol></li><li> Integrità diluizione. <ol><li> Stabilire integrità diluizione utilizzando campioni addizionati di analiti a 500, 250 e 100 ng / ml. </li><li> Dopo l&#39;estrazione, diluire i campioni con soluzione proteica precipitazioni (1:10, n = 3 per livello di concentrazione). </li><li> Calcolare deviazioni dalle concentrazioni nominali. Considerare i risultati che rientrano nel 85% -115% dei accettabili nominale. </li></ol></li><li> Stabilità. <ol><li> Indagare stabilità utilizzando i campioni QC a tutti e quattro i livelli di concentrazione (n = 4 per concentrazione) ha analizzato in diversi punti temporali e alle diverse condizioni di conservazione. </li><li> Confrontare i risultati dopo l&#39;immagazzinamento con i valori nominali. Considerare risultati che rientrano nel 85% -115% dei accettabili nominale. </li><li> Stabilire stabilità campione per 1 settimana a temperatura ambiente, 1 settimana a 4 ° C, 1 mese a -20 ° C e 1 mese a -80 ° C. </li><li> Test di stabilità di congelamento-scongelamento in tre cicli (-20 ° C). Prova campione estratto e stabilità campionatore automatico inserendo campioni nel campionatore automatico termostatato regolato a 4 ° C. Iniettare campioni dopo 72 ore. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Anche se, come detto, il concetto di farmaco terapeutico e monitoraggio aderenza tacrolimus basato su macchie di sangue essiccato è attraente, ci sono sfide analitiche che vanno oltre quelli tipicamente associati con l&#39;analisi LC-MS / MS di tacrolimus in EDTA venosa campioni di sangue intero. Questi includono, ma non sono limitati a, il fatto che la matrice è sangue intero capillare imbevuto nel materiale linters di cotone del materiale carta filtro usato qui e il volume di sangue (20 ml). Tuttavia, l&#39;analisi ad...

Tacrolimus è un potente immonosuppressant 1-7 che ha una struttura macrolide 8 (Figura 1). A causa di cis - isomeria trans dei legami CN forma due rotameri in soluzione 9 che possono essere separati da fase inversa cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) Tacrolimus è lipofila e solubile in alcoli (metanolo: 653 g / L, etanolo: 355 g / L), idrocarburi alogenati (cloroformio: 573 g / L) ed etere. E &#39;scarsamente solubile in idrocarburi alifatici (esano: 0,1 g / L e acqua (pH 3:. 0,0047 g / L) 9 La molecola non contiene alcun cromofori e la sua massima UV-assorbimento è di 192 nm Tacrolimus agisce attraverso l&#39;inibizione della calcineurina. . Il suo meccanismo d&#39;azione è stato rivisto in riferimenti 10,11. Attualmente è utilizzato in oltre l&#39;80% dei pazienti sottoposti a trapianto di organi solidi negli Stati Uniti 12. L&#39;indice terapeutico di tacrolimus è considered per essere stretto 13. Inoltre, la correlazione tra le dosi di tacrolimus e concentrazioni nel sangue è scarsa e la farmacocinetica è variabile 14,15. Il monitoraggio terapeutico per guidare tacrolimus dosaggio in pazienti sottoposti a trapianto è pertanto la pratica clinica generale 16-20. L&#39;obiettivo è quello di mantenere le concentrazioni di tacrolimus nel sangue entro un range terapeutico predefinito. Le concentrazioni ematiche tacrolimus al di sotto del range terapeutico possono tradursi in una maggiore attività di reazioni allo-immunitario cronici o acuti, mentre concentrazioni superiori al finestra terapeutica aumentano il rischio di sovra-immunosoppressione, il cancro e tossicità, quali nefrotossicità, neurotossicità, ipertensione e diabete. Alta farmacocinetica variabilità individuale di tacrolimus può essere dannoso sia per trapianto di organi e la sopravvivenza del paziente 21,22. Mentre variabilità inter-individuale di farmacocinetica di tacrolimus è causata principalmente da polimorfismi CYP3A5, ragioni intra-individualevariabilità includono, ma non sono limitati a, farmaco-farmaco, malattia-droga e cibo-farmaco interazioni 14,15. Anche la mancanza di aderenza alla terapia immunosoppressiva terapeutico è un fattore e una delle ragioni principali per la perdita del trapianto 23,24. Queste considerazioni suggeriscono che spesso a casa di farmaci terapeutici e il monitoraggio di aderenza della concentrazione ematica complessiva può essere utile al fine di garantire che i pazienti abbiano l&#39;esposizione tacrolimus all&#39;interno della finestra terapeutica desiderata in ogni momento. Tuttavia, la logistica e il costo di più frequente monitoraggio terapeutico in quanto è in corso la pratica clinica 15 è proibitivo. Uno dei motivi è che il paziente deve vedere un prelevatore di avere il campione di sangue venoso richiesto disegnata. Macchie di sangue secco sono recentemente emersi come un concetto attraente 25-28. Dopo una semplice dito attaccare il paziente raccoglie una goccia di sangue su una speciale carta di carta da filtro e dopo che la macchia di sangue è dried, può essere inviato ad un laboratorio centrale per l&#39;analisi di tacrolimus e qualsiasi altro immunosoppressore che il paziente può essere attualmente in corso. Questo è diventato possibile grazie allo sviluppo di test LC-MS / MS altamente sensibili e specifici per la quantificazione di tacrolimus e di altri immunosoppressori in volumi molto piccoli di sangue come macchie di sangue essiccato (in genere 20 microlitri di sangue) 25,29-43. Un altro vantaggio è che minimamente invasive, strategie a basso volume di raccolta dei campioni, come macchie di sangue essiccato facilitano notevolmente monitoraggio terapeutico e studi di farmacocinetica in bambini piccoli 28. Tacrolimus è di solito misurata in EDTA venoso sangue intero 15. Le ragioni sono che tacrolimus distribuisce ampiamente in cellule del sangue e che gli studi clinici hanno riportato una migliore correlazione tra le concentrazioni di valle di tacrolimus nel sangue rispetto al plasma con eventi clinici 15,18. In confronto, l&#39;analisi di tacrolimus in macchie di sangue essiccato è basato su sangue capillare che viene miscelato con la matrice carta da filtro. Questo rappresenta una sfida in termini di solubilizzazione di tacrolimus e potenziali interferenze con l&#39;analisi LC-MS / MS. Presentiamo qui un test stabilito e convalidato in base omogeneizzazione della macchia di sangue secco con un frullatore proiettile in combinazione con un alto flusso colonna linea campione ripulire procedura e analisi LC-MS / MS. Ad oggi, questo test è stato utilizzato con successo per la quantificazione di oltre cinquemila tacrolimus secca campioni blood spot per il monitoraggio aderenza negli studi clinici.

<table><tbody><tr><td>Tacrolimus</td><td>U.S. Pharmacopeial Convention</td><td>1642802</td><td></td></tr><tr><td>D2,13C-Tacrolimus</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td></td><td></td>F370002</tr><tr><td>Globuli rossi</td><td>Università del Colorado Hospital</td><td>W20091305500 V</td><td></td></tr><tr><td>Plasma</td><td>Università del Colorado Hospital</td><td>W2017130556300Q</td><td></td></tr><tr><td>Acetone CHROMASOLV, HPLC, &ge; 99,9%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439126-4 L</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo 99,9%, HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2632-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo Optima LC/MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Acqua Optima LC/MS, UHPLC-UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A118P-500</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di zinco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Z68-500</td><td></td></tr><tr><td>0,5 &ndash; 10 &; l. pipetta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008649</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf tubo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>10 &ndash; 100 &; micro; l. pipetta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008651</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l. puntali per pipette con filtro, sterili</td><td>Neptune</td><td>BT 10XLS3</td><td></td></tr><tr><td>100 &ndash; 1.000 & l. pipetta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008653</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; l. puntali per pipette con filtro, sterili</td><td>Neptune</td><td>BT 100</td><td></td></tr><tr><td>1.000 &mu; l. puntali per pipette con filtro, sterili</td><td>Multimax</td><td>2940</td><td></td></tr><tr><td>2 &ndash; 20 & l. pipetta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008650</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Eppendorf tubo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-681-258</td><td></td></tr><tr><td>20 &ndash; 200 &; micro; l. pipetta, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008652</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l. puntali per pipette con filtro, sterili</td><td>GeneMate</td><td>P-1237-20</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l. puntali per pipette con filtro</td><td>Multimax</td><td>2938T</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l. puntali per pipette con filtro, sterili</td><td>Multimax</td><td>2936J</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu; l inserti per fiale HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>ARO-9973-13</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia PR2002</td><td>Mettler Toledo</td><td>1117050723</td><td></td></tr><tr><td>Bilance AX205 Delta Range</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119343379</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender Omogeneizzatore</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Biofuge Fresco</td><td>Heraeus</td><td>290395</td><td></td></tr><tr><td>Salviette</td> <td>monousoPDI</td><td>Q55172</td><td></td></tr><tr><td>Fiale in vetro, 4 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-955-334</td><td></td></tr><tr><td>Fiale in vetro, 20 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B7800-20</td><td></td></tr><tr><td>Guanti, nitrile</td><td>Titan Brand Gloves</td><td>44-100S</td><td></td></tr><tr><td>Fiale HPLC, 9 mm, 2 ml, trasparenti</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 9921-13</td><td></td></tr><tr><td>Coperchi per fiale HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 8952-13-B</td><td></td></tr><tr><td>Ago, 18 G 1,5</td><td>Precision Glide</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Rack per provette Eppendorf Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-11</td><td></td></tr><tr><td>Rack per fiale HPLC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-541-29</td><td></td></tr><tr><td>Perline in acciaio 0,9 - 2 mm</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Scatole di stoccaggio per congelatori / frigoriferi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>Vortex multitubo standard</td><td>VWR Scientific Products</td><td>658816-115</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK</td><td>GE Whatman&nbsp;</td><td>2016-05</td><td></td></tr><tr><td>Autocampionatore</td><td>CTC PAL&nbsp;</td><td>amico. HTCABIx1</td><td></td></tr><tr><td>Pompa binaria, Agilent 1260 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G1312B</td><td></td></tr><tr><td>Pompa binaria, Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G4220A</td><td></td></tr><tr><td>Micro degasatore a vuoto, Agilent 1260</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G13798</td><td></td></tr><tr><td>Forno a colonna, Agilent 1290 con 2 posizioni&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1216C</td><td></td></tr><tr><td>Vano colonna termostatata con valvola di commutazione integrata a 6 vie</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1316C</td><td></td></tr><tr><td>Cartuccia pre-colonna HPLC, Zorbax XDB C8 (5 &; m dimensione delle particelle), 4,6 &punto medio; Colonna</td> analitica <td>HPLC Phenomenex</td><td>820950-926</td><td></td>da 12,5 mm</tr><tr><td>, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 &; m dimensione delle particelle), 4,6 &punto medio; </td> Spettrometro <td></td><td></td> di massa tandem Phenomenex 993967-906 <td></td>da 150 mm</tr><tr><td>API5000 MS/MS con sorgente TurboIonspray</td><td>AB Sciex</td><td>4364257</td><td></td></tr><tr><td>Software di spettrometria di massa</td><td>AB Sciex</td><td>Analyst 1.5.1</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione del immunosoppressore tacrolimus su macchie di sangue secco uso lc-ms / ms

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Il tacrolimus inibitore della calcineurina è la pietra angolare della maggior parte dei protocolli di trattamento immunosoppressivi dopo il trapianto d&#39;organo solido negli Stati Uniti. Tacrolimus è un farmaco ristretto indice terapeutico e come tale richiede un monitoraggio terapeutico e aggiustamento della dose in base a intere sue concentrazioni ematiche. Per facilitare la casa farmaci terapeutici e monitoraggio aderenza, la raccolta di macchie di sangue essiccato è un concetto interessante. Dopo un dito bastone, il paziente raccoglie una goccia di sangue su carta da filtro a casa. Dopo che il sangue è asciugato, viene inviato al laboratorio di analisi dove tacrolimus è quantificato utilizzando la spettrometria di massa ad alta prestazione cromatografia liquida-tandem (HPLC-MS / MS) in combinazione con un manuale semplice passo precipitazione delle proteine ​​e l&#39;estrazione della colonna in linea. Per l&#39;analisi tacrolimus, un disco 6 mm è perforato dal centro satura di spot sangue. La macchia di sangue viene omogeneizzato con un proiettile frullatore unnd poi le proteine ​​vengono precipitate con metanolo / 0,2 M ZnSO4 contenente lo standard D interno 2, 13 C-tacrolimus. Dopo vortex e centrifugazione, 100 pl di surnatante viene iniettato in una colonna di estrazione in linea e lavate con 5 ml / min di 0,1 formico acido / acetonitrile (7: 3, v: v) per 1 min. Di seguito, la valvola di commutazione viene attivato e gli analiti sono back-lavata sulla colonna analitica (e separati usando un acido formico / acetonitrile pendenza 0,1%). Tacrolimus è quantificato in modalità positiva Multi reazione (MRM) usando uno spettrometro di massa tandem. Il saggio è lineare da 1 a 50 ng / ml. Variabilità inter-assay (3,6% -6,1%) e l&#39;accuratezza (91,7% -101,6%), valutato in 20 giorni soddisfano criteri di accettazione. Recupero medio estrazione è 95,5%. Non ci sono rilevanti riporto, le interferenze della matrice e effetti matrice. Tacrolimus è stabile nelle macchie di sangue essiccato a temperatura ambiente ea 4 ° C per 1 settimana. Campioni estratti incampionatore sono stabili a + 4 ° C per almeno 72 ore.

Cromatogrammi ionici rappresentativi di un campione in bianco, un campione addizionato al limite inferiore di quantificazione e un campione del paziente sono mostrati nella figura 3. Le curve di calibrazione Il limite inferiore di rilevamento era di 0,5 ng / ml e il limite inferiore di quantificazione è 1,0 ng / ml. Cinquanta ng / ml è stato scelto come il più alto calibratore come concentrazioni più elevate sono difficilmente raggiungibile in cl...

Qui descriviamo un test di cromatografia liquida ad alte prestazioni-spettrometria di massa tandem (HPLC-MS/MS) per quantificare l'immunosoppressore tacrolimus in macchie di sangue essiccato utilizzando una semplice fase manuale di precipitazione delle proteine ed estrazione online della colonna.

Quantificazione del immunosoppressore Tacrolimus su macchie di sangue secco Uso LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare il tacrolimus nelle macchie di sangue essiccato. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla quantificazione di tacrolimus nei campioni di sangue dopo il prelievo di sangue per via endovenosa è che i pazienti possono raccogliere i campioni da soli. Le strategie di raccolta di campioni a basso volume minimamente invasive, come le macchie di sangue essiccato, facilitano anche il monitoraggio terapeutico dei farmaci e gli studi di farmacocinetica nei bambini piccoli. Dopo una semplice puntura del dito, il paziente raccoglie una goccia di sangue su una speciale carta da filtro e, dopo che la macchia di sangue è stata asciugata, può essere inviata a un laboratorio centrale per l'analisi del tacrolimus e di qualsiasi altro immunosoppressore che il paziente potrebbe assumere.La quantificazione dei farmaci sulle macchie di sangue essiccato è diventata possibile grazie allo sviluppo di saggi LCM SM S altamente sensibili e specifici per la quantificazione di tacrolimus e di altri immunosoppressori in volumi di sangue molto piccoli come le macchie di sangue essiccato. In primo luogo, preparare soluzioni madre in metanolo puro a una concentrazione di un milligrammo per millilitro per tacrolimus e a una concentrazione di 10 microgrammi per millilitro. Per D due soluzioni madre aliquote 13 C e conservarle a una temperatura negativa di 70 gradi Celsius o inferiore in ogni giorno di estrazione, preparare un rapporto di sette a tre di metanolo e 0,2 molari di solfato di zinco in acqua per precipitare le proteine ed estrarre il tacrolimus.La soluzione madre standard interna viene addizionata nella soluzione di precipitazione. Impostare la scadenza della soluzione a 12 ore. Successivamente, preparare le soluzioni madre di tacrolimus eseguendo un'appropriata diluizione della soluzione madre utilizzando metanolo puro per preparare i calibratori e i campioni di controllo qualità.Versare 20 microlitri della soluzione madre opportunamente diluita in EDT. Un sangue intero incubare a 37 gradi Celsius sotto agitazione delicata in un bagno d'acqua per 20 minuti per consentire una distribuzione omogenea di tacrolimus nei componenti cellulari del sangue. Per preparare una maggiore quantità di calibratori e campioni di controllo qualità, aggiungere 2000 microlitri della soluzione madre opportunamente diluita in EDT.Un sangue intero incubare a 37 gradi Celsius sotto agitazione delicata in un bagno d'acqua per 20 minuti per consentire una distribuzione omogenea di tacrolimus nei componenti cellulari del sangue. Quindi aliquotare i campioni in provette di polipropilene da 1,5 millilitri con fondo conico e coperchi a scatto. Individuare 50 microlitri di sangue intero addizionato al centro di ciascun cerchio su schede filtranti utilizzando una pipetta dopo aver asciugato le macchie di sangue a temperatura ambiente per tre ore, preparare gli standard di calibrazione del tacrolimus nel sangue intero umano EDTA a concentrazioni di tacrolimus di 2,5, 5, 10, 25 e 50 nanogrammi per millilitro.Preparare un campione bianco per l'estrazione come gli standard di calibrazione con la soluzione di precipitazione proteica, non contenente lo standard interno D due 13 C tacrolimus. Successivamente, preparare campioni di controllo qualità in sangue intero umano EDTA a concentrazioni di 0, 2, 4, 20 e 40 nanogrammi per millilitro. Preparare anche un campione bianco Dopo aver raccolto le macchie di sangue essiccate, ispezionare visivamente ciascuna di esse per garantire una qualità e un volume del campione accettabili.Quindi perforare il centro della macchia di sangue sulla scheda del filtro con un perforatore da sei millimetri. Posizionare i dischi in provette di polipropilene da 1,5 millilitri con fondo conico e far scattare i coperchi. Aggiungi da 20 a 30 proiettili in ogni tubo.Successivamente, aggiungere 500 microlitri della soluzione di precipitazione proteica in ciascuna provetta. Omogeneizzare i dischi in un frullatore a proiettile per un minuto alla massima velocità. Al termine, agitare i campioni a temperatura ambiente su un vortice multitubo alla massima velocità per 10 minuti.Quindi centrifugare i campioni a 16.000 GS e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, trasferire SNAT in fiale di vetro HPLC dotate di un inserto da 300 microlitri. A questo punto, caricare 100 microlitri del supernat del campione estratto sulla colonna di estrazione a cartuccia C otto con un rapporto di sette a tre dello 0,1% di acido formico in acqua e nitrile acido a un flusso di cinque millilitri al minuto.Successivamente azionare per un minuto la valvola di commutazione con conseguente risciacquo degli analiti dal pre-cal sulla colonna analitica. Quindi impostare il termostato a colonna a 65 gradi Celsius. Eluire gli analiti dalla colonna analitica utilizzando le velocità di flusso e il gradiente mostrati qui.Collegare la colonna analitica a uno spettrometro di massa tandem tramite la sorgente di ionizzazione turbo electrospray. Regolare i parametri chiave dello spettrometro di massa in base alla tabella seguente. Quindi, rileva gli ioni positivi nella modalità di reazione multipla.Per quantificare il tacrolimus nelle macchie di sangue essiccato, confrontarlo con la curva di calibrazione utilizzando i cromatogrammi ionici rappresentativi del software di spettrometria di massa di un campione bianco. Qui sono mostrati un campione addizionato al limite inferiore di quantificazione e un campione di paziente. Di seguito è riportata una tipica curva di calibrazione.Il coefficiente medio di correlazione è 0,9994. I risultati di accuratezza e precisione sono mostrati in dettaglio qui. Non sono state osservate indicazioni di una significativa soppressione o potenziamento ionico e non è stato osservato alcun carryover rilevante con conseguente superamento dei picchi.È stato rilevato il 15% del segnale al limite inferiore di quantificazione. L'integrità della diluizione è stata studiata analizzando campioni preparati a concentrazioni superiori al calibratore più alto e diluiti in una soluzione di precipitazione proteica dopo l'estrazione per raggiungere le concentrazioni target. Tutte le diluizioni testate hanno soddisfatto i criteri di accettazione.Non sono state osservate perdite dopo una settimana di stoccaggio a temperatura ambiente, dopo una settimana di stoccaggio a quattro gradi Celsius e dopo un mese di stoccaggio a meno 20 gradi Celsius. Inoltre, non sono state osservate perdite dopo un mese di conservazione a meno 80 gradi Celsius dopo tre cicli di congelamento e disgelo e dopo 72 ore di campioni estratti nel campionatore automatico a quattro gradi Celsius. Una volta padroneggiati, è possibile estrarre 20 campioni in meno di un'ora.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la chiave per una quantificazione affidabile è la qualità della macchia di sangue essiccato e che il disco viene perforato da un'area completamente satura della carta da filtro. Le tecniche e il test mostrati in questo video forniscono una piattaforma tecnologica per quantificare altri immunosoppressori e farmaci nelle macchie di sangue essiccato.

quantification-immunosuppressant-tacrolimus-on-dried-blood-spots

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Tregs sono potenti soppressori del sistema immunitario. Vi è una mancanza di marcatori di superficie unica per definire loro, quindi, le definizioni di Tregs sono soprattutto funzionali. Qui descrivere un...

Umano In Vitro</emSoppressione> come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

Riportiamo un metodo per la valutazione di assorbimento di droga utilizzando una pompa e il modello farmaci (diazepam e tacrolimus). Dopo l'analisi di droga mediante cromatografia liquida ad alta prestazione, le concentrazioni di droga e di livelli di assorbimento nei tubi di set di somministrazione sono calcolati.

Valutazione della Drug Sorption di PVC- e tubi in Amministrazione non-PVC-based delle formazioni con una pompa

Qui, descriviamo un'analisi cromatografica accoppiata con la separazione di mobilità dello ione dei precursori del peptide seguita dalla ad alta risoluzione (~ 30.000) MS-rilevazione dei frammenti peptidici per la quantificazione degli standard del peptide a spillo in un anticorpo monoclonale digest.

Un saggio di HS-MRM per la quantificazione delle proteine di cellula ospite in biofarmaceutica di proteine mediante spettrometria di massa di liquido cromatografia dello ione mobilità QTOF

Combinazione di ivacaftor e ivacaftor-lumacaftor sono due nuovi farmaci CF. Tuttavia, c'è ancora una carenza di comprensione sulle loro PK/PD e farmacologia. Presentiamo una tecnica ottimizzata di HPLC-MS per l'analisi simultanea di ivacaftor e suoi metaboliti principali e lumacaftor.

Metodo ottimizzato di LC-MS/MS per l'analisi di High-throughput di campioni clinici di Ivacaftor, suoi principali metaboliti e Lumacaftor nei fluidi biologici di pazienti affetti da fibrosi cistica

Questo protocollo descrive un metodo semplice e utile per memorizzare sangue periferico e del siero/plasma per analisi a valle, quali single nucleotide polymorphism (SNP) valutazione e analisi di ELISA.

Secchi di sangue e siero macchie come uno strumento utile per la conservazione dei campioni valutare biomarcatori del cancro

Qui, descriviamo un protocollo utilizzando laser capture microdissection accoppiato con analisi LC/MS spazialmente-quantificare distribuzioni di droga all'interno dei granulomi della tubercolosi polmonare. L'approccio ha ampia applicabilità a quantificare le concentrazioni di farmaco all'interno di tessuti ad alto dettaglio spaziale.

Spaziali quantificazione delle droghe nelle lesioni di tubercolosi polmonare di Laser Capture Microdissection liquido cromatografia spettrometria di massa (LCM-LC/MS)

Qui descriviamo un approccio proteomico di singola cellula per valutare immunitario fenotipica e funzionale (induzione di citochine intracellulari) alterazioni nei campioni di sangue periferico intero, analizzati tramite citometria a massa.

Cella singola analisi di Immunophenotype e produzione di citochine nel sangue periferico intero tramite citometria a massa

Gli attuali metodi di analisi dell'aderenza dei pazienti ai complessi regimi di tubercolosi farmacoresistente (DR-TB) possono essere imprecisi e dispendiosi in termini di risorse. Il nostro metodo analizza i capelli, una matrice facilmente raccolta e conservata, per concentrazioni di 11 farmaci DR-TB. Utilizzando LC-MS/MS, possiamo determinare i livelli di farmaci sub-nanogrammi che possono essere utilizzati per comprendere meglio l'aderenza ai farmaci.

Pannello LC-MS/MS convalidato per quantificare 11 farmaci TB resistenti ai farmaci in piccoli campioni di capelli

Un modo affidabile e ripetibile per produrre una lesione cervicale unilaterale del midollo spinale utilizzando il dispositivo di simulazione Infinite Horizon è descritto. Il metodo si avvale di un telaio progettato e bloccare per stabilizzare la colonna vertebrale. La procedura standardizzata e biomeccanica risultato lesioni parametri lesioni sufficienti e durature.

Un modello contusivo unilaterale di lesioni del midollo spinale cervicale Uso della Impactor Infinite Horizon

Per svelare sono disperatamente necessari dei primi meccanismi molecolari alla base della prostata cancro iniziazione, il romanzo e sistemi modello umane innovative e approcci. Il potenziale di pre-prostatica seno urogenitale mesenchima (UGSM) per indurre pluripotenti popolazioni di cellule staminali di formare epitelio prostatico umano è un potente strumento sperimentale nella ricerca della prostata.

Formazione di epitelio prostatico umano utilizzando tessuti ricombinazione dei roditori urogenitale Mesenchima Sinus e cellule staminali umane

Impara a quantificare il tacrolimus su macchie di sangue secco con LC-MS/MS per il monitoraggio terapeutico dei farmaci. Questo metodo minimamente invasivo migliora la compliance del paziente.

Quantificazione del immunosoppressore Tacrolimus su macchie di sangue secco Uso LC-MS / MS

Esplora altri video