Visualizzazione diretta del Murine Dorsale Cochlear Nucleus per optogenetic stimolazione del percorso uditivo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di accedere chirurgicamente al nucleo cocleare in un modello murino per consentire esperimenti basati sull'optogenetica. Ciò si ottiene preparando prima il topo per la craniotomia e ritraendo lateralmente la pelle, i tessuti molli e i muscoli che sovrastano il cuoio capelluto. Come secondo passo, viene eseguita una craniotomia sull'osso interparietale sinistro, a circa due millimetri dalla linea di sutura lambda.

Questa regione si sovrappone al nucleo cocleare. Successivamente, utilizzando un tubo di aspirazione a cinque francesi, aspirare la porzione più laterale del cervelletto sinistro sovrastante il DCN. Il risultato mostra una visuale libera del DCN.

I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi di assistenza come la guida stereotassica, sono sia quelli di ottenere la visualizzazione diretta del nucleo cocleare sia di posizionare un simulatore di neuros come una sorgente luminosa o un array di elettrodi sulla superficie del tronco encefalico. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave sia nel campo dell'optogenetica che dell'udito. Nessuna protesi, come il trasferimento genico, può consentire al tronco encefalico uditivo di essere stimolato dalla luce con una risoluzione facciale e temporale sufficiente.

Dopo aver anestetizzato un topo con ketamina e xilazina tramite somministrazione intraperitoneale, controllare il riflesso di ritiro del pizzico del dito del piede e monitorare la frequenza cardiaca e la frequenza respiratoria per confermare la corretta anestesia. Quindi applicare un unguento veterinario su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza. Successivamente, radere i capelli sovrastanti il cuoio capelluto per fornire un accesso senza ostacoli al sito chirurgico.

Dopodiché, posiziona il topo in un piccolo supporto stereotassico per animali. Regolare il morsetto del muso in modo che sia abbastanza largo da consentire una respirazione adeguata, ma abbastanza stretto da immobilizzare completamente la testa del topo. Al microscopio, praticare un'incisione verticale attraverso la pelle, partendo dalla linea mediana direttamente tra il padiglione auricolare ed estendendosi fino alla parte dell'occipite.

Quindi spostare la pelle lateralmente. Rimuovere i muscoli sovrastanti le ossa parietale, interparietale e occipitale sinistra del cranio con un bisturi o una forbice dell'iride. Nel frattempo, ridurre al minimo il sanguinamento applicando una leggera pressione con un applicatore con punta di cotone per 10-15 secondi.

Successivamente, identifica le linee di sutura sagittale e lambda. Usando un paio di gioielli Ron. Eseguire una craniotomia sull'osso interparietale sinistro a circa due millimetri di distanza dalla linea di sutura lambda.

Questa regione si sovrappone al DCN dopo la craniotomia. Si deve osservare un sottile strato di dura madre che sovrasta il cervelletto, rimuoverlo con cura utilizzando una lama di bisturi. Rimuovere il sangue coagulato con punte di cotone o gocciolare delicatamente soluzione salina sul cervelletto per eliminare il sangue.

Quindi utilizzare un tubo di aspirazione a cinque francesi per aspirare la porzione più laterale del cervelletto sinistro, sovrastante il DCN per assistere. Durante l'aspirazione, impostare il piano focale del microscopio alla profondità prevista del nucleo cocleare per migliorare la visualizzazione e garantire un'immagine nitida. Rimuovere circa un quarto o un terzo del cervelletto sinistro.

Il principale punto di riferimento adiacente alla DCN è l'AM del canale semicircolare superiore. Dopo l'aspirazione, ulteriori emorragie, l'accumulo di liquido cerebrospinale e lo spostamento del cervelletto sul DCN appariranno rapidamente nell'instillazione di soluzione salina nella craniotomia per prevenire la coagulazione del sangue. Utilizzare una combinazione di tamponamento delicato con una punta dentale e aspirazione per liberare un percorso per la visualizzazione diretta del DCN.

Dopo che il DCN è chiaramente visibile e privo di sangue e liquido cerebrospinale sovrastanti, effettuare una microiniezione a pressione del vettore con una siringa Hamilton a tenuta di gas da cinque microlitri. Utilizzare un ago calibro 34 con uno smusso poco profondo per ridurre al minimo il trauma contusivo e localizzare il volume di iniezione all'interno del DCN. Quindi introdurre lentamente l'ago con un micro manipolatore fino a quando la punta non è più visibile sotto la superficie del DCN.

Inizia a iniettare 1,5 microlitri del vettore. Al termine di ciò, estrarre lentamente l'ago, successivamente riavvicinare la pelle e consentire al topo di riprendersi secondo la procedura di recupero standard. Dopo due-quattro settimane di guarigione e incubazione del trasferimento genico mediato dal virus, anestetizzare nuovamente il topo iniettato con il vettore, quindi rimuovere il tessuto cicatriziale sopra il sito della craniotomia.

Successivamente, identificare una combinazione di cervelletto rimanente e tessuto cicatriziale sovrastante il DCN. Utilizzare un'aspirazione francese cinque per aspirare il cervelletto sovrastante e il tessuto cicatriziale. A seguito dell'aspirazione.

Applicare rapidamente la soluzione salina nella craniotomia. Per prevenire l'ululazione del sangue, utilizzare una combinazione di tamponamento delicato del punto dentale e aspirazione per liberare il percorso per la visualizzazione diretta del DCN. Il DCN è ora accessibile per gli esperimenti di fisiologia basati sull'optogenetica mostrati qui è il posizionamento di una fibra laser direttamente sulla superficie del DCN, che consente la stimolazione ottica della serie di impulsi di luce blu DCNA infettata da opsina sulla superficie del DCN infetto che provoca una risposta uditiva del tronco encefalico guidata otticamente.

Utilizzando un micro manipolatore, una fibra ottica accoppiata a un laser a luce blu viene posizionata direttamente sulla superficie del nucleo cocleare e accesa. Qui possiamo identificare la luce blu pulsata sulla superficie del nucleo cocleare. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la simulazione elettrica del nucleo, che ci consente di confrontare direttamente non solo le risposte neurali evocate acusticamente, ma anche quelle evocate elettricamente con quelle evocate dalla simulazione ottica.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare ed eseguire la craniotomia e l'aspirazione cerebellare con l'obiettivo finale della visualizzazione diretta e dell'accesso al nucleo cocleare.