Name: Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di cultura e RT-qPCR. II. Totale coltivabili Virus Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Impara a misurare virus infettivi in campioni d'acqua con il metodo EPA 1615 usando cellule renali di scimmia Buffalo Green Monkey. Questo protocollo standardizzato supporta la valutazione del rischio per la salute pubblica.

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Gli autori ringraziano il Dr. Mark Borchardt, Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti, Marshfield, WI, per aver fornito il sierotipo 3 del poliovirus Sabin utilizzato in questo studio; Mary Jean See, Nancy Schable e Jenifer Jones della Dynamac Corporation per la preparazione delle colture BGM; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar e Larry Wymer per i contributi alla valutazione complessiva del metodo USEPA 1615; Gretchen Sullivan per l'assistenza tecnica; e proprietari di pozzi privati locali e servizi pubblici per averci permesso di raccogliere campioni d'acqua. Sebbene questo lavoro sia stato esaminato dall'USEPA e approvato per la pubblicazione, potrebbe non riflettere necessariamente la politica ufficiale dell'Agenzia. La menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali non costituisce approvazione o raccomandazione per l'uso.

NOTA: Si prega di consultare la sezione materiale supplementare S1 per un elenco di definizioni. Le procedure QA associati metodo USEPA 1615 sono descritti nella sezione materiali supplementari S2. 1. Filtro Procedura eluizione <ol><li> Prima Elution <ol><li> Inserire 500 ml di tampone estratto di carne 1,5%, pH 9,0, riscaldato a temperatura ambiente in un cilindro graduato. Aprire il contenitore della cartuccia del filtro e aggiungere una quantità sufficiente di estratto di carne per coprire completamente il filtro elettropositivo. Sostituire il coperchio del corpo del filtro e versare l&#39;estratto di carne rimanente in un bicchiere sterile. </li><li> Dopo 1 min di tempo di contatto, passare la soluzione di estratto di carne nell&#39;alloggiamento insieme a quello che rimane nel becher sterile lentamente attraverso il filtro utilizzando un recipiente a pressione o pompa peristaltica. Raccogliere l&#39;eluato in un bicchiere di vetro 2 L. </li></ol></li><li> secondo eluizione <ol><li> Ripetere i punti 1.1 utilizzando altri 500 ml di estratto di carne tamponata 1,5%, Ma aumenta il tempo di contatto al passo 1.1.2 per 15 min. </li><li> Aggiungere l&#39;estratto di carne dalla seconda eluizione al 2 L becher contenente che dalla prima eluizione. Aggiungere un ancoretta sterile per il bicchiere. </li></ol></li></ol> 2. Flocculazione Organic Concentrazione Procedura <ol><li> Sterilizzare una combinazione-elettrodo pH con ipoclorito di sodio 0,525% per almeno 5 minuti. Risciacquare l&#39;elettrodo con sterili dH 2 O e poi declorare con 0,05 M tiosolfato di sodio. Calibrare il pH-metro con pH compreso tra 4 e 7 standard. </li><li> Posizionare il bicchiere contenente l&#39;eluato su un piatto mescolare. Accendere la piastra e aumentare la velocità di agitazione fino a formare un vortice. </li><li> Regolare il pH dell&#39;eluato a 3,5 ± 0,1 lentamente goccia a goccia aggiunta di 1,2 M HCl al eluato. Aggiungere il HCl goccia a goccia, perché rapido Inoltre sarà inattivare virus. Durante questo tempo l&#39;eluato diventerà nuvoloso come un precipitato comincia a formarsi. </li><li> Ridurre la SPE miscelazioneed un stir lento e quindi continuare a monitorare e mantenere il pH dell&#39;eluato a 3,5 ± 0,1 a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Versare il precipitato sospeso estratto di carne in una o più bottiglie da centrifuga e centrifugare per 15 min a 2500 xga 4 ° C. Rimuovere le bottiglie dalla centrifuga e sia aspirare o decantare lentamente il supernatante per evitare la perdita del precipitato pellettato. Eliminare il surnatante. NOTA: Non ci può essere una considerevole variazione tra un sacco estratto di carne in quantità e qualità del precipitato. Il precipitato prodotta da alcuni lotti si dissolverà rapidamente mentre quello dalle altre partite si scioglie con difficoltà. </li><li> Aggiungere 30 ml di 0,15 M di fosfato sodico alla bottiglia da centrifuga contenente il precipitato. <ol><li> Utilizzare 0,15 M di fosfato di sodio, pH 9,0 per precipitati dal manzo sacco estratto che si dissolvono entro 5 minuti. Mescolare per 10 minuti dopo il precipitato è completamente sciolto, e poi andare subito al punto 2.7. </li><li> Utilizzare 0,15 M sodio fosfato, pH 7,0-7,5 per tutti gli altri precipitati. Mescolare per 10-15 minuti per la dissoluzione, o precipitati più difficili, li rompere con una spatola sterile, ripetutamente aspira la soluzione su e giù durante la mescolando con una pipetta, agitando il precipitato a 160 rpm su un agitatore orbitale, o da una combinazione di queste procedure. NOTA: Quando si utilizza più di una bottiglia centrifuga, unire i precipitati con meno di 30 ml di fosfato di sodio e quindi utilizzare la parte restante dei 30 ml per sciacquare le bottiglie dopo aver combinato i precipitati in una bottiglia o bicchiere. </li><li> Se il precipitato combinato è in una bottiglia centrifuga fondo piatto, aggiungere una ancoretta alla bottiglia. Passare al punto 2.6.5. </li><li> Se il precipitato combinato è in una bottiglia centrifuga con un fondo conico, trasferisce in un piccolo bicchiere di vetro e aggiungere un ancoretta nel becher. </li><li> Posizionare la bottiglia o bicchiere su un agitatore magnetico, e mescolare fino a quando la precipitate ha sciolto completamente. </li><li> Re-sterilizzare un tipo di combinazione elettrodo di pH con ipoclorito di sodio 0,525% e declorare con tiosolfato di sodio 0,05 M come descritto al punto 2.1. Calibrare il misuratore pH con pH 7 e 10 standard. Lentamente regolare il pH del precipitato completamente disciolto a 9,0 con 1 M NaOH e quindi agitare per 10 min. </li></ol></li><li> Rimuovere la barra di mescolare e centrifugare il precipitato disciolto per 10 minuti a 4.000-10.000 xg e 4 ° C. </li><li> Versare con cautela il surnatante in un bicchiere di vetro senza disturbare il pellet. Aggiungere un ancoretta al bicchiere e scartare il pellet. </li><li> Porre il becher su un agitatore magnetico, e agitare la soluzione. Aggiungere 1,2 M HCl goccia a goccia per regolare il pH a 7,0-7,5. </li><li> Filtro sterilizzare il supernatante mediante passaggio attraverso un filtro sterilizzante contenente un prefiltro che è stata pretrattata con 15 ml di estratto di carne 1,5%, 0,05 M glicina, pH 7,0-7,5. </li><li> Volum campione Assaye (S) calcoli: <ol><li> Usa Equazione 1 per calcolare S per tutti i campioni di prova, tranne il Lab fortificato vuoto e il Laboratorio Bianco reagente, <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq1.jpg" width="100" /> Equazione 1 dove D (volume di campione originale analizzati) è di 500 L per le acque sotterranee, TSV (volume totale del campione) è il volume di campione campo passata attraverso il filtro a cartuccia electropositive 5 pollici ricevuto dal laboratorio, e FCSV (finale concentrato Volume del campione) è il volume seguente filtrazione nel passo 2.10. Un esempio è mostrato in supplementare materiali sezione S4.1. </li><li> Calcolare S per il laboratorio fortificato Blank (LFB, cioè, un controllo positivo della qualità utilizzando acqua seminato grado reagente) e il Laboratorio bianco reagente (LRB, cioè, un controllo negativo qualità utilizzando acqua distillata) moltiplicando la FCSV dello 0,3. </li></ol></li><li> Dividere il FCSV in three sottocampioni. <ol><li> Preparare sottocampioni 1 e 2 con un volume pari a 1,04 volte il volume del campione Assay. Congelare questi sottocampioni pari o inferiore a -70 ° C, se non possono essere analizzati utilizzando il test totale coltivabili virus (sottocampione 1, punto 4) o trasformati per i saggi molecolari (non mostrate) entro 24 ore; in caso contrario, tenere a 4 ° C. </li><li> Congelare il volume residuo (sottocampione 3) pari o inferiore a -70 ° C. </li></ol></li><li> Calcolare il volume Inoculo dividendo la S per 10. </li></ol> 3. Totale coltivabili Virus Quantal Assay NOTA: Per tutti i passi aggiungono sempre soluzioni con attenzione per evitare di disturbare il monostrato cellulare. <ol><li> Decantare o aspirare i media da recipienti contenenti un monostrato di cellule BGM a 3-6 giorni dopo la scissione e quindi aggiungere un volume di soluzione salina bilanciata pari alla media rimossi. </li><li> Decantare o aspirare la soluzione salina bilanciata dalla TE coltura cellularest vasi utilizzati e quindi inoculare le vasche sperimentali di colture cellulari <ol><li> Seminare 10 recipienti di prova per ogni campione di prova con un volume di sottocampione 1 pari al volume Inoculo insieme con i controlli totali virus coltivabili quantali test (materiali supplementari sezione S2.4). </li><li> Per la LFB e il Laboratorio fortificata matrice del campione (LFSM, cioè, campione matrice acqua testa di serie), preparare 5-, 25- e 125-diluizioni utilizzando sottocampione 3 e 0,15 M sodio fosfato, pH 7,0-7,5 come diluente. Un esempio di una procedura di messa a diluizioni figura supplementare S3 sezione dei materiali. Seminare 10 lavati contenitori di prova di colture cellulari per ogni serie di diluizioni utilizzando un volume dell&#39;inoculo su ciascun recipiente di prova, oltre ai vasi inoculati con sottocampione non diluito 1 al punto 3.2.1. </li><li> Per ogni campione di prova dal punto 3.2.1 (diversi da quelli inoculati nel passaggio 3.2.2) che ha CPE in tutte le 10 replicati dopo 14 giorni di incubazione (vedi punto 3.3), prepare diluizioni 5-, 25- e 125- e 625-fold del sottocampione 3. Inoculare 10 lavato contenitori di prova di colture cellulari per ogni serie di diluizioni utilizzando un volume dell&#39;inoculo su ciascun recipiente di prova con una nuova serie del quantal totale virus coltivabili controlli di analisi (materiali supplementari sezione S2.4). </li><li> Distribuire l&#39;inoculo sulla superficie dei monostrati cellulari inclinando vasi avanti e indietro. Incubare i recipienti di prova a temperatura ambiente per 80-120 min su una piattaforma oscillante meccanico a 1-5 oscillazioni / min o con oscillazione dei vasi ogni 15-20 minuti per consentire a qualsiasi virus presente di aderire a cellule. </li><li> Aggiungere terreno di mantenimento preriscaldata, e poi incubare i contenitori di prova a 36.5 ± 1 ° C. </li></ol></li><li> Cercare la comparsa di CPE in ciascun recipiente di prova utilizzando un microscopio al giorno per i primi 3 D e poi esaminarli ogni 2-3 giorni fino a giorno 14. Trasferimento eventuali recipienti di prova che mostrano ≥75% CPE ad un congelatore o fissato ainferiore a -70 ° C. Congelare tutte le rimanenti le culture e il totale dei virus coltivabili controlli saggio quantali pari o inferiore a -70 ° C dopo aver esaminato i vasi l&#39;ultimo giorno. </li><li> Scongelare tutte le culture e filtrare ≥15% del medium da ogni recipiente di prova CPE-positivo attraverso un filtro sterilizzante 0,2 micron. Se il volume specificato non può essere passato attraverso il filtro per intasamento, centrifugare il mezzo per 10 min a 1,500-18,000 xg e 4 ° C prima della filtrazione. </li><li> Eseguire un secondo passaggio di tutti i 1 st recipienti di prova che utilizzano passaggio lavati contenitori di prova BGM. <ol><li> Inoculare i nuovi vasi prova con un volume inoculazione che rappresenta il 10% del mezzo scongelato da tutti i recipienti negativi e dal mezzo filtrato dai vasi positivi. </li><li> Ripetere i punti 3.2.4-3.4.3, ma congelare qualsiasi recipiente di prova che è risultato negativo al 1 ° passaggio e positivo sul 2 ° come descritto al punto 3.3. Eseguire un passaggio 3 °età come descritto per il passaggio 2 ° utilizzando solo i controlli per analisi negativi e colture cellulari che erano negativi durante il 1 ° passaggio e positivo nel passaggio 2 nd. </li></ol></li><li> Identificare recipienti di prova individuali come virus positivo quando mostrano CPE sia in 1 ° e il 2 ° o passaggi, nel caso in cui CPE non si verifica fino al passaggio 2 °, in entrambi i passaggi 2 ° e 3 °. </li><li> Utilizzare Calcolatrice numero più probabile di EPA con le impostazioni del programma di default impostato come indicato nella Tabella S2 per calcolare i titoli del virus di tutti i campioni di prova. <ol><li> Inserire il numero di virus recipienti di prova replica positivi a partire dal punto 3.6 per ciascun campione nella calcolatrice per determinare il valore / ml MPN (M mL) e la parte superiore (CL UML) e inferiore (CL LML) il 95% dei limiti di confidenza valori / ml . </li><li> Obtain il valore / L MPN (M L) del campione corrispondente utilizzando Equazione 2. <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq2.jpg" width="100" /> Equazione 2 M ml è il valore / ml MPN al punto 3.7, S è il volume del campione del test, e D è il volume di campione originale analizzati. </li><li> Calcolare il superiore fiducia limite / L sostituendo il valore CL UML per il valore M mL. Calcolare il minore fiducia limite / L sostituendo il valore CL LML per il valore M mL. Un esempio di calcolo è illustrato nella sezione supplementare materiali S4.2. </li><li> I valori Rapporto M mL di 0 come ≤ 1 / D. Ad esempio, ≤ 0,002 MPN / L (≤ 1/500 L) per i campioni di acque sotterranee. </li><li> Calcolare i valori limite di confidenza MPN e il 95% per ogni laboratorio fortificato vuoto e Lab Reagente bianco dapprima moltiplicando i valori / ml ottenuti nella calcolatrice S e dividendo il risultato per 0,3. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

USEPA Metodo 1615 è stato sviluppato per l&#39;utilizzo durante il ciclo di terzo monitoraggio del regolamento di monitoraggio dei contaminanti non regolamentata (UCMR3) 17 e progettato principalmente per misurare la presenza di virus nelle acque sotterranee. Si condivide una serie di misure comuni con il metodo Informazione regola di raccolta (ICR), 15,18 ma ha due piccole differenze. Entrambi usano saggi quantali per misurare virus che producono CPE su monostrati di cellule BGM con quantificazione essendo basato su numero più probabile (MPN) calcoli. Metodo 1615 consente l&#39;uso di un filtro nuovo elettropositivo per concentrare virus da varie matrici acqua e riduce il numero di recipiente di prova coltura cellulare repliche per diluizione da 20 a 10. Entrambi modifiche minori riducono i costi complessivi di metodo. La riduzione del numero di repliche riduce lavoro, ma si traduce in un limite di rilevazione leggermente inferiore. Anche se le acque sotterranee sono tenuti ad avere concentrazioni più basse di virus di acque superficiali, 19,20 °e quantità di campione analizzati è di cinque volte superiore a quello di acque superficiali, compensando in parte le differenze. L&#39;uso di un minor numero di repliche sarà adeguato per la maggior parte delle acque superficiali, ma comunque richiede diluizione del campione. Metodo 1615 ha diversi passaggi critici e limitazioni. estratti da carne variano da lotto a lotto. Ogni lotto deve essere testato per efficacia della eluizione virus e la capacità di concentrazione virus attraverso le fasi di concentrazione secondari come descritto è materiali supplementari sezione S2.3. Il metodo utilizza formule precise per calcolare la quantità di campione per inoculare su colture di cellule BGM e per determinare i titoli del virus. risultati non accurati verranno generati se queste formule non sono rigorosamente seguite. La corretta tecnica asettica deve essere utilizzato per il mantenimento di colture cellulari. Non infetti controlli su colture di cellule BGM che mostrano il disagio durante il periodo di incubazione di 14 giorni probabilmente indicano problemi con la manutenzione coltura cellulare. Grande attenzione deve anche essere taken durante il pipettaggio passaggi coinvolti con l&#39;inoculazione di e medie Oltre a fiasche di coltura cellulare per evitare la contaminazione incrociata. I controlli di qualità descritti nel supplemento di materiali sezione S2 devono essere rigorosamente rispettate. Sezione S2 fornisce anche consigli per la risoluzione dei problemi problemi di qualità. Il meccanismo principale di adsorbimento virus electropositive filtri è un&#39;interazione carica correlata alla forza della carica positiva sul filtro e la forza della carica negativa del virus &#39;connesse al suo punto isoelettrico e il pH dell&#39;acqua in fase di test 21. Eluizione dai filtri è influenzata anche dalla forza di queste interazioni. Perché variano tra i tipi di virus e anche tra i ceppi all&#39;interno dello stesso tipo, eluizione dai filtri non è uniforme. Ciò significa che qualsiasi risultato può sottovalutare il livello effettivo di virus presente nelle acque ambientali. L&#39;uso della singola linea cellulare BGM sottostima anche verificarsi virus. La gammavirus enterici che può produrre CPE in questa linea cellulare in primo luogo è limitata a poliovirus e Enterovirus B sierotipi specie, nonché alcuni reovirus 14,15,22. Altri tipi di virus infettivo non verranno rilevati. Recuperi poliomielite in acque sotterranee e di grado reagente incontrato metodo USEPA 1615 criteri di prestazioni di accettazione sia per la valutazione delle prestazioni (PE, cioè campioni di acqua distillata seminato con titoli sconosciuti a un analista che vengono utilizzati per valutare le prestazioni dell&#39;analista prima dell&#39;inizio di uno studio) e campioni (LFB materiali supplementari Tabella S1). Il recupero 58% dalle acque sotterranee utilizzando la procedura di coltura è simile a quella riportata da altri utilizzando acqua di rubinetto 23,24. Il recupero medio dai campioni LFB di 111% con un coefficiente di variazione (CV) del 100% anche incontrato i criteri di accettazione metodo di prestazione anche se sono superiore a quello osservato per i campioni PE during l&#39;ICR. ICR significa recupero interlaboratorio è stata del 56% con un coefficiente di variazione (CV) del 92%, mentre i recuperi intralaboratorio medi variavano 36-85% (CV 58-131%; dati non pubblicati dal database ICR PE). recuperi più alti sono stati osservati in questo studio per i campioni LFB bassa del seme che per i campioni di sementi superiori (122 contro 42%). Nel momento in cui l&#39;ICR è in fase di progettazione, ci si aspettava che i campioni del PE ricevono bassi valori di semi avrebbero recupero inferiore, che coloro che ricevono elevati semi. Simile a quella osservata qui per i campioni LFB, recupero poliovirus campioni ICR PE erano 71% (CV 100%), 54% (CV 69%) e 44% (CV 71%) per valori seme ≤300 MPN, 300- 1.500 MPN, e&gt; 1500 MPN, rispettivamente. Ci sono molti metodi per la misurazione virus infettivo in campioni di acqua 25. Questo metodo è significativo rispetto ad altri metodi in grado di standardizzazione. La standardizzazione non solo include controlli di qualità e prestazioni,ma utilizza anche i volumi e le formule definite per garantire che tutti i laboratori di analisi di eseguire il metodo identico. Senza la standardizzazione, è difficile confrontare i risultati tra laboratori, e quindi la standardizzazione è fondamentale per lo svolgimento di studi su larga scala in diversi laboratori di analisi. Con la standardizzazione incorporato in questo metodo potrebbe essere ampliata in futuro per includere tipi di virus aggiuntivi e linee cellulari. La ricerca è in corso per fornire i dati per l&#39;inclusione di adenovirus nel metodo.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.
The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:
 These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2), 
 
 to: 
 
 These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).
 
The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:
 The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR, 
 
 to: 
 
 The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

virus enterici sono un gruppo eterogeneo di virus che infettano il sistema intestinale umano e che sono trasmessi per via fecale-orale. Questi virus entrano nelle acque superficiali e sotterranee attraverso impianto di trattamento delle acque reflue e degli effluenti fossa settica, fosse settiche impropriamente progettati o rotti, linee di fogna spezzate, overflow fognari combinati, e altre fonti puntuali e non punto di 1-4. infezioni umane e malattie da virus a base acquosa si verificano attraverso il consumo di acqua contaminata o non adeguatamente disinfettati o attraverso il contatto con l&#39;acqua ricreativo. I sintomi della malattia possono coinvolgere lieve a grave gastroenterite; congiuntivite; febbre; distress respiratorio superiore; mano, l&#39;afta epizootica; miocardite; meningite asettica; encefalite; paralisi; sepsi 5-8, e la morte 9,10. USEPA Metodo 1615 fornisce una procedura per misurare particelle di virus enterici infettive in acque ambientali e bere. Queste acque possono conteneremiscela di virioni infettive e non infettive, ma solo le particelle infettive rappresentano un rischio per la salute potenziale. Particelle virali infettive perdono infettività nel corso del tempo in acque ambientali e bere da perdita di integrità proteine ​​del capside, danni agli acidi nucleici dovute alle radiazioni UV dai raggi solari, e danni a causa di eventuali disinfettanti che possono essere presenti 11-13. La procedura virus coltivabili totale previsto nel metodo si basa sulla produzione di effetto citopatico (CPE) nella linea cellulare di rene di scimmia Buffalo verde (BGM). Questa linea cellulare è stata scelta per la sua diffusione nel campo della virologia ambientale 14,15, anche se la gamma di tipi di virus infettivi rilevati sono limitati principalmente ad alcuni enterovirus 15. Lo scopo di questo lavoro è quello di descrivere le procedure Metodo 1615 di per eluizione di filtri a cartuccia electropositive cinque pollici, la concentrazione secondaria, e la misurazione del totale dei virus coltivabili. Una valutazione dellametodo globale è descritto in Cashdollar et al. 16.

<table><tbody><tr><td>Estratto di manzo, polvere essiccata</td><td>BD Bacto</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>Tubi criogenici</td><td>Thermo Fisher</td><td>3775/945373</td><td></td></tr><tr><td>Hank' </td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma oscillante meccanica</td><td>Daigger</td><td>EF4907G</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-285-729</td><td></td></tr><tr><td>Filtro sterilizzante con prefiltro</td><td>VWR</td><td>28143-295</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa sterilizzante</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>Standard di</td> <td>pHSigma-Aldrich</td><td>33643, 33646, 33648</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1018 o M4642</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio, 7,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>tripsina, EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr></tbody></table>

metodo epa 1615. misura di enterovirus e norovirus presenza in water di cultura e rt-qpcr. ii. totale coltivabili virus assay

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Un metodo standardizzato è necessario quando gli studi nazionali sulla presenza del virus nelle acque ambientali e potabili utilizzano più laboratori di analisi. Il metodo 1615 dell'Agenzia per la protezione dell'ambiente degli Stati Uniti (USEPA) è stato sviluppato con l'obiettivo di fornire uno standard per la misurazione di Enterovirus e Norovirus in queste acque. Il virus viene concentrato dall'acqua utilizzando un filtro elettropositivo, eluito dalla superficie del filtro con estratto di manzo e quindi ulteriormente concentrato utilizzando la flocculazione organica. Qui presentiamo il protocollo del Metodo 1615 per l'eluizione del filtro, la concentrazione secondaria e la misurazione dei virus totali coltivabili. Una parte dell'eluato concentrato di ciascun campione viene inoculata su dieci fiasche replicate di cellule renali di scimmia verde di bufalo. Il numero di matracci che dimostrano effetti citopatici viene utilizzato per quantificare il numero più probabile (MPN) di unità infettive per litro. Il metodo utilizza una serie di controlli di qualità per aumentare la qualità dei dati e ridurre le variazioni interlaboratorio e intralaboratorio. I laboratori devono soddisfare standard di prestazione definiti. Il metodo 1615 è stato valutato esaminando il recupero del virus da acque sotterranee e reattive seminate con poliovirus Sabin di tipo 3. I recuperi medi del poliovirus con il test coltivabile totale sono stati del 111% in acqua di grado reagente e del 58% nelle acque sotterranee.

Virus è stato concentrato dalla falda fonte di tre impianti per il trattamento dell&#39;acqua potabile e un privato ben utilizzando i filtri elettropositivi. Due serie di campioni, costituiti da un campione di campo e controllo LFSM, sono stati raccolti dagli impianti di depurazione in occasioni separate, e un set campione è stato prelevato dal pozzo privato. Il recupero complessivo virus è stato determinato utilizzando campioni LFSM da due delle piante e il pozzo privato (due campioni da una pianta e un campione da un altro sono stati esclusi dal calcolo in quanto il valore MPN delle sementi utilizzate con ogni campione non è stato possibile determinare con precisione a causa ai risultati CPE anomali tra flaconi replicati). Recupero medio poliovirus da campioni di acque sotterranee in media 58% con un coefficiente di variazione del 79% (Figura 2) 16. Nessun virus coltivabili è stata rilevata in nessuno dei duplicati campioni di campo acqua di falda testa di serie. prestazioni Metodo anche stata misurata utilizzando LFB samples modificati utilizzando due diversi livelli di semi. A titolo &quot;basso&quot; di 300 MPN di poliovirus è stato utilizzato per valutare le prestazioni a livelli inferiori rispetto al livello di 500 &quot;standard&quot; MPN LFB utilizzato nel metodo USEPA 1615. Un &quot;alto&quot; titolo di 1.000 MPN di poliovirus è stato utilizzato per testare le prestazioni al il livello del controllo LFSM. Questi controlli effettuati simile con un recupero medio del 111% ed un coefficiente di variazione del 100% (figura 2). Tutti LRB campioni sono risultati negativi e tutti i campioni LFB eseguite all&#39;interno della gamma di accettazione (materiali supplementari Tabella S1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig1.jpg" /> È mostrato Figura 1. Filtro di eluizione. Uno schema per l&#39;utilizzo di un contenitore di pressione per filtro a cartuccia eluizione. pressione positiva viene utilizzato per spingere manzo Solubilizzazione nel contenitore pressione attraverso l&#39;aria contenitore della cartucciacontenente il filtro a cartuccia elettropositivo. Una pompa peristaltica può essere sostituito per il contenitore di pressione, con l&#39;ingresso della pompa essendo collocata nel contenitore contenente la soluzione estratto di carne. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig2.jpg" /> Figura 2. Media poliovirus di recupero (%) da Ground e grado reagente acqua. Il recupero medio per cento viene mostrato per poliovirus da terra ( <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig3.jpg" /> ; n = 4) e il grado del reagente acqua ( <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig4.jpg" /> ; n = 12) dei campioni. I dodici campioni di acqua distillata inclusi sei seminato con 300 MPN e sei seminato con 1.000 MPN di poliovirus. barre di errore rappresentano errore standard.

Qui presentiamo una procedura per misurare i virus coltivabili totali utilizzando la linea cellulare di rene Buffalo Green Monkey. La procedura fornisce uno strumento standardizzato per misurare la presenza di virus infettivi nelle acque ambientali e potabili.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di cultura e RT-qPCR. II. Totale coltivabili Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

L'obiettivo generale del seguente protocollo è misurare il livello di particelle virali infettive in un campione d'acqua. Questo viene ottenuto utilizzando una soluzione estrattiva basica per eluire particelle virali cariche negativamente da un filtro elettropositivo che è stato concentrato con virus provenienti da acqua potabile o ambientale. La raccolta dei virus su un filtro cartuccia elettropositivo è descritta nella Parte Uno di questa serie.Come secondo passaggio, il pH dell’eluito viene lentamente ridotto, il che provoca la formazione di un flocculo costituito dalle proteine estratte e dal virus presente nel campione. Successivamente, il flocculo viene raccolto mediante centrifugazione, disciolto in un buffer di fosfato di sodio e sterilizzato per filtrazione per rimuovere batteri e muffe. Quindi, l’eluito finale concentrato viene inoculato su cellule renali di scimmia verde Buffalo, e le cellule vengono osservate per effetto citopatico, o CPE, per 14 giorni, al fine di rilevare la replicazione virale.Per rilasciare le particelle virali associate alle cellule, tutti i flaconi contenenti cellule vengono congelati al termine di 14 giorni, oppure quando il CPE in un qualsiasi flacone raggiunge il 75% o più. Dopo un secondo e un terzo passaggio per confermare che il CPE è dovuto alla replicazione virale, si utilizza un programma calcolatore del Numero Più Probabile, o MPN, per determinare il numero più probabile per litro di ciascun campione analizzato. Infine, la componente acida virale coltivabile totale del Metodo EPA 1615 fornisce una misura del livello di particelle virali infettive nel campione d'acqua.Questo saggio totale del virus rappresenta solo una componente del Metodo EPA 1615. Il metodo completo misura la presenza di enterovirus e norovirus nelle acque potabili e ambientali. Eventuali riscontri di virus possono quindi essere utilizzati come dati di ingresso per valutare il rischio derivante dall'esposizione a questi virus nell'acqua potabile e in quella ricreativa.Il vantaggio principale di questo protocollo è che fornisce un unico approccio standardizzato per la misurazione dei virus nell'acqua. L'approccio si basa effettivamente sul metodo della Information Collection Rule pubblicato nel 1996. Il problema principale che incontrano le persone alle prime armi con questo metodo è mantenere la linea cellulare BGM libera da contaminazioni e interpretare gli effetti citopatici, o CPE.Shay Fout e io dimostreremo le procedure di eluizione e flocculazione organica, seguite dalla tecnica di coltura cellulare. Per eseguire la prima eluizione, versare 500 millilitri di estratto di carne tamponato al 1,5% a temperatura ambiente, pH 9,0, in un cilindro graduato. Successivamente, aprire l'alloggiamento del cartuccia filtro ed aggiungere una quantità sufficiente di estratto di carne per coprire completamente il filtro elettropositivo.Collocare il resto dell'estratto di carne in un becher. Sostituire il coperchio del contenitore del filtro. Dopo un minuto di tempo di contatto, utilizzare una pompa peristaltica e un tubo sterile per far passare lentamente attraverso il filtro la soluzione di estratto di carne presente nel contenitore, insieme a quella rimanente nel becher.Raccogliere l’eluito in un becher di vetro sterile da 2 litri. Ripetere questi passaggi con ulteriori 500 millilitri di estratto di carne al 1,5% tamponato, utilizzando però un tempo di contatto di 15 minuti. Aggiungere l’estratto di carne della seconda eluizione al becher da 2 litri contenente quello della prima eluizione e inserire nel becher una barretta magnetica sterile.Posizionare il becher contenente l'eluito su un agitatore magnetico. Accendere l'agitatore e aumentare la velocità di agitazione fino a formare un vortice. Regolare lentamente il pH dell'eluito a 3,5 ± 0,1 aggiungendo goccia a goccia acido cloridrico 1,2 molare, o HCl.Aggiungere l'acido goccia a goccia, poiché un'aggiunta rapida inattiverebbe il virus. Durante questo periodo, l'eluito diventerà torbido, poiché inizierà a formarsi un precipitato. Ridurre la velocità di mescolamento a una lenta agitazione e continuare a monitorare e mantenere il pH dell'eluito a 3,5 ± 0,1 a temperatura ambiente per 30 minuti.Quindi, versare la sospensione dell'estratto di carne precipitato in una o più bottiglie per centrifuga e centrifugare per 15 minuti a 2.500 ×g a quattro gradi Celsius. Rimuovere le bottiglie dalla centrifuga e decantare lentamente il soprannatante per evitare la perdita del precipitato pellettizzato. Il soprannatante può essere scartato.Per i lotti di estratto di carne che si sciolgono entro 5 minuti, aggiungere 30 millilitri di fosfato di sodio 0,15 molare, pH 9,0, nel flacone da centrifuga contenente il precipitato. Consultare il protocollo scritto per le istruzioni su come sciogliere i precipitati che non si sciolgono entro cinque minuti. Mescolare per 10 minuti dopo che il precipitato si &egrave; completamente sciolto.Successivamente, rimuovere la bacchetta magnetica ed eseguire la centrifugazione del precipitante disciolto per 10 minuti a 4.000-10.000 ×g e a quattro gradi Celsius. Versare con attenzione il soprannatante in un becher di vetro senza disturbare il pellet. Aggiungere una bacchetta magnetica al becher e scartare il pellet.Posizionare il becher su un agitatore magnetico e agitare la soluzione. Aggiungere lentamente HCl 1,2 M goccia a goccia per regolare il pH tra 7,0 e 7,5. Filtrare in condizioni sterili il soprannatante facendolo passare attraverso un filtro sterilizzante contenente un prefiltro che è stato pretrattato con 15 millilitri di estratto di carne tamponato al 1,5%, pH 7,0–7,5.Vedere il protocollo scritto per calcolare il Volume del Campione per il Saggio, o S, di tutti i campioni da analizzare. Successivamente, calcolare il Volume dell'Inoculo dividendo S per 10. Utilizzando questi calcoli, suddividere il volume finale del campione concentrato, ovvero il campione ottenuto dopo la sterilizzazione mediante filtrazione, in tre sottocampioni, come descritto nel protocollo scritto.Inoculare 10 provette di prova contenenti uno strato monocellulare di cellule BGM per ogni campione da analizzare, con il volume del sottocampione uno, pari al Volume di Inoculo, insieme ai controlli totali dell’assay quantitativo virale coltivabile. Per il Campione Bianco Arricchito in Laboratorio e per la Matrice del Campione Arricchito in Laboratorio, preparare diluizioni 5, 25 e 125 volte utilizzando il sottocampione tre e fosfato di sodio 0,15 molare, pH 7,0-7,5, come diluente. Oltre alle provette inoculate con il sottocampione uno non diluito, inoculare 10 provette di coltura cellulare lavate per ogni serie di diluizioni, utilizzando un Volume di Inoculo per ciascuna provetta di prova.Distribuire l'inoculo sulla superficie dei monocapani cellulari inclinando i vasi avanti e indietro. Incubare i vasi di prova a temperatura ambiente per 80-120 minuti su una piattaforma meccanica oscillante a una frequenza di uno a cinque oscillazioni al minuto, oppure agitando manualmente i vasi ogni 15-20 minuti, in modo da consentire l'assorbimento eventuale del virus da parte delle cellule. Successivamente, aggiungere il mezzo di mantenimento preriscaldato ai vasi di prova, prima di incubarli a 36,5 ± 1 °C.Cercare l'insorgenza di effetti citopatici in ogni contenitore di prova al microscopio nei primi tre giorni, quindi esaminarli ogni due o tre giorni fino al giorno 14. Trasferire in un congelatore regolato a meno 70 gradi Celsius o inferiore tutti i contenitori di prova che mostrano effetti citopatici superiori al 75%. Dopo l'esame dei contenitori nell'ultimo giorno, congelare tutte le colture rimanenti e i controlli del saggio quantitativo di virus coltivabili a meno 70 gradi Celsius o inferiore.Quindi, scongelare tutte le colture e filtrare più del 15% del mezzo da ogni provetta di prova positiva per CPE attraverso un filtro sterilizzante da 0,2 micron. Il passaggio successivo consiste nell'eseguire un secondo passaggio di tutte le provette di prova del primo passaggio utilizzando provette di cellule renali BGM lavate. Per fare ciò, inoculare le nuove provette di prova con un volume di inoculo che rappresenta il 10% del mezzo scongelato proveniente da tutte le provette negative, nonché dal mezzo filtrato delle provette positive.Ripetere i passaggi effettuati per il primo passaggio, congelando qualsiasi provetta di prova risultata negativa al primo passaggio e positiva al secondo. Successivamente, eseguire un terzo passaggio come descritto per il secondo passaggio, utilizzando esclusivamente i controlli negativi del saggio e le colture cellulari risultate negative durante il primo passaggio e positive nel secondo passaggio. Identificare singole provette di prova come positive al virus quando mostrano effetti citopatici sia nel primo che nel secondo passaggio, oppure, nel caso in cui l'effetto citopatico non si manifesti fino al secondo passaggio, sia nel secondo che nel terzo passaggio.Utilizzare il calcolatore del Numero Più Probabile dell'U.S. Environmental Protection Agency con le impostazioni predefinite del programma come indicato nel protocollo testuale, per calcolare i titoli virali di tutti i campioni in esame. Successivamente, utilizzare i valori ottenuti per il Numero Più Probabile di unità infettive per millilitro, insieme ai limiti di confidenza superiore e inferiore per millilitro, per calcolare il Numero Più Probabile di unità infettive per litro e i corrispondenti limiti di confidenza, come descritto nel protocollo testuale. Viene mostrata la percentuale media di recupero per il Poliovirus da campioni di acqua di falda e di acqua reagente.Il recupero medio del virus della poliomielite da campioni di acqua sotterranea ha avuto una media del 58% con un coefficiente di variazione del 79%. Nessun virus coltivabile è stato rilevato in nessuno dei campioni duplicati di acqua sotterranea non inoculati. Le prestazioni del metodo sono state inoltre valutate utilizzando campioni di bianco arricchito in laboratorio, modificati mediante l’uso di due diversi livelli di inoculo. I dodici campioni di acqua di grado reagente includevano sei campioni inoculati con 300 MPN di unità infettive e sei inoculati con 1.000 MPN di unità infettive di Poliovirus.Questi controlli hanno mostrato prestazioni simili, con un recupero medio del 111% e un coefficiente di variazione del 100%. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare una tecnica asettica e buone pratiche di laboratorio per prevenire la contaminazione dei campioni. È inoltre importante ricordare che, quando si lavora con agenti patogeni virali, si devono adottare precauzioni come l'uso di guanti, ogni volta che si esegue questa procedura. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come diluire virus e filtri elettropositivi e come eseguire saggi di flocculazione organica e di coltura cellulare.Oltre a questa procedura, puoi anche eseguire saggi molecolari per identificare e rilevare altri tipi di virus.

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Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

EPA Il metodo 1615 utilizza un filtro elettropositivo per concentrare enterovirus e norovirus nelle acque ambientali e potabili. Questo manoscritto descrive la procedura per la raccolta dei campioni per le analisi del Metodo 1615.

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