Name: Rilevazione di Exosomal Biomarker da campo elettrico indotto rilascio e di misura (Efirm) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Scopri il metodo Efirm per estrarre esosomi dai biofluidi e analizzarne il contenuto di RNA e proteine mediante campi elettrici e misurazioni elettrochimiche. Questa tecnica innovativa accelera la scoperta di biomarcatori per malattie.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro nazionale per le risorse di ricerca e il Centro Nazionale per l&#39;avanzamento Sciences traslazionale, National Institutes of Health, attraverso di Grant UL1TR000124 (FW); Felix &amp; Mildred Yip Dotata cattedra e la Famiglia Fondo Barnes (a DTWW), il National Institute of Dental Research &amp; craniofacciale dei National Institutes of Health in premio Numero T90DE022734 (MT). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

1. Magnetic Exosome Estrazione basata su Bead <ol><li> Pipettare una soluzione ben miscelato di 5 ml di microparticelle magnetiche rivestite di streptavidina in 495 ml di tampone fosfato salino (PBS) in una provetta per risospendere le sfere. Lavare e risospendere le sfere con 500 ml di PBS per tre volte di utilizzare una griglia magnetica. La cremagliera è una matrice di magneti sul lato di un&#39;unità abitativa che può contenere i tubi campione microcentrifuga. <ol><li> Per ogni lavaggio, prima lasciate che i tubi si siedono sulla griglia per 1 min, e quindi utilizzare un puntale per rimuovere con attenzione il buffer di surnatante senza disturbare le perline. </li><li> Posizionare le provette su un rack regolare senza magneti a lato. Aggiungere 500 ml di PBS nei tubi, e utilizzare la pipetta per miscelare la soluzione e perline insieme. Poi mettere i tubi di nuovo sul sostegno magnetico per separare nuovamente le perle dalla soluzione. </li><li> Eseguire questa rimozione di tampone via di magnetizzazione e risospensione in PBS untotale di tre volte. Questo esegue un lavaggio iniziale delle particelle magnetiche. </li></ol></li><li> Risospendere le sfere in 490 ml di tampone PBS, con il tubo posto sulla parte non magnetizzata del rack magnetica. Dispensare 5 ml di anticorpi anti-CD63 umano topo biotinilato a 1,0 mg / ml di brodo di concentrazione nella miscela di perline. Utilizzare la pipetta per mescolare le perline e anticorpi in soluzione. </li><li> Posizionare i tubi microcentrifuga con tallone e miscela di anticorpi biotinilati su un rotatore campione. Impostare i parametri rotatori per il rotatore campione per rotazione reciproca a 90 ° inclinazione per 5 sec e vibrante a 5 ° per 1 sec. Ruotare i tubi miscela campione-bead questi parametri per 30 minuti a RT. </li><li> Rimuovere l&#39;anticorpo non legato dopo coniugazione. <ol><li> Dopo 30 min di rotazione a RT, posizionare i tubi nel rack magnetica per 5 min. </li><li> Eseguire tre lavaggi di perline rimuovendo la fase liquida utilizzando una micropipetta e lavare con 500 μ; L di PBS. Dopo il lavaggio triple, risospendere le sfere in 490 ml di caseina-PBS e posto sulla parte non magnetizzata del rack. </li></ol></li><li> Estrazione Exosome utilizzando perline legate agli anticorpi. <ol><li> Etichettare ogni provetta con ID del campione mirato. Pipettare un campione di 10 ml di siero o saliva nella provetta. Usare la pipetta per mescolare il campione e sfere magnetiche pipettando più volte. </li><li> Posizionare i tubi con campioni e anti-umane perline anticorpi CD63 sui rotatori e ruotare per 2 ore a temperatura ambiente. Utilizzare gli stessi parametri dei rotatori come descritto al punto 1.2. </li><li> Dopo 2 ore di campione rotante, eseguire un lavaggio tripla magnetizzando di perline separati dalla soluzione, eliminando fase liquida con micropipetta, e risospensione perline in 500 ml di tampone Tris-HCl. Le perle risultanti sono oggi legati ai exosomes e sono pronti per il rilascio campo elettrico e misurazione. </li></ol></li></ol> 2. elettrica campo indotto Rilasciato unnd Misura di Exosomal Content <ol><li> Iniziale prerivestimento di elettrodi con GADPH Primer <ol><li> Applicare una plastica bene ad un matrice di elettrodi per evitare contaminazione incrociata dei singoli elettrodi. Per questo esperimento, utilizzare un array di elettrodi 16-sensore con ciascun elettrodo unità nella matrice costituita da un lavoro, banco, ed elettrodo di riferimento in oro nudo. </li><li> Preparare una miscela scorta di 100 sonde nM DNA, 0.3 M KCl, e pirrolo 10 mM pipettando reagenti azionari in un tubo di acqua ultrapura distillata. Mescolare bene nel vortex. NOTA: Per questo studio, la sonda di DNA selezionata corrispondente al gene di riferimento GAPDH, che è noto per esistere all&#39;interno esosomi. La sequenza di sonda utilizzata è: 5&#39;-Biotin-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 &#39;. Utilizzare questa miscela su tutti gli elettrodi. </li><li> Pipettare 60 ml di miscela monomerica sonda-DNA sulla superficie di ciascun elettrodo d&#39;oro. Esaminate gli elettrodi per garantire che vi sia un&#39;adeguata copertura della lavorazione, counter, e di riferimento elettrodi per la miscela liquida. </li><li> Electropolymerize miscela monomerica sonda per creare uno strato di polimero conduttore sulla superficie dell&#39;elettrodo applicando un&#39;onda quadra (CSW) profilo ciclico campo elettrico alla superficie dell&#39;elettrodo. Questo campo elettrico consiste nell&#39;applicare 350 mV per 9 secondi e subito il passaggio a 950 mV per 1 sec. Applicare questa profilo ciclico onda quadra all&#39;elettrodo per 10 cicli, per un totale di 100 secondi di campo elettrico applicato. </li><li> Risciacquare superficie del sensore 3 volte con acqua distillata e asciugare con azoto gassoso per rimuovere il liquido dalla superficie dell&#39;elettrodo. Assicurarsi che il liquido sia stato completamente rimosso dall&#39;elettrodo. </li></ol></li><li> Exosome Cargo scarico <ol><li> Load 5 ml di 1 micron di una sonda detector in 495 ml di miscela complessa bead-exosome e utilizzare una pipetta per mescolare. NOTA: La sonda rivelatore è una sequenza di DNA iniettore coniugato ad una molecola fluoresceina all&#39;estremità 3 &#39;. Il prob detectore sequenza utilizzata per questo studio corrisponde al GAPDH mRNA trovato all&#39;interno esosomi. La sequenza della sonda rivelatore coniugato con fluoresceina è: 5&#39;-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-fluoresceina-3 &#39;. </li><li> Pipettare 60 ml di sonda e miscela complessa bead-exosome su superficie elettrodo d&#39;oro con un gruppo di magneti sotto. Questo gruppo magnete consiste di sedici 2,54 millimetri di diametro magneti al neodimio allineati per corrispondere agli elettrodi di lavoro del sensore. Figura 2A illustra il posizionamento dei magneti e soluzione bead-exosome. </li><li> Una volta caricato campione sulla superficie dell&#39;elettrodo, applica 20 cicli del campo elettrico CSW con 9 sec a -300 mV e 1 sec a +200 mV (200 sec totale). Il carico exosomal che viene rilasciato si ibridano alle primer sulla superficie dell&#39;elettrodo. Se marcatori superficiali del exosome sono oggetto di indagine, ignorare questa parte dell&#39;esperimento. Figura 2B illustra questo processo. </li> &lt;li&gt; Wash-off gli analiti non legato sulla superficie dell&#39;elettrodo di triplo risciacquo la superficie dell&#39;elettrodo con acqua distillata. Essiccare l&#39;elettrodo con gas azoto. </li></ol></li><li> Reporter anticorpi e lettura <ol><li> Aggiungere 60 ml di 150 unità / ml di anticorpi anti-fluoresceina coniugato con perossidasi di rafano (HRP in 1: 1.000 diluizione) diluito in caseina / PBS. </li><li> Utilizzare un campo elettrico coniugazione spinti a complessi HRP anti-fluoresceina per il panino della sonda. Applicare -200 mV per 1 sec e +500 mV per 1 sec per 5 cicli alla superficie dell&#39;elettrodo. La Figura 2A mostra la cattura e rivelatore complessi sonda sia una proteina e di acido nucleico. </li><li> Triple superficie del sensore di lavaggio con acqua distillata e asciugare con azoto. </li><li> A seguito del dilavamento di anticorpi anti-fluoresceina in eccesso non legato, aggiungere 60 ml di 3,3 &#39;, 5,5&#39;-Tetrametilbenzidina (TMB) substrato. Caricare questo substrato a ogni superficie del sensore con una pipetta multicanale. </li><li> Eseguire lettura amperometrico della corrente misurando la corrente dell&#39;elettrodo a -200 mV per 60 sec utilizzando un potenziostato elettrochimico capace di misurazione simultanea di 16 canali. Figura 2C è un esempio di profilo di corrente durante la lettura. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig2highres.jpg" /> Figura 2. Componenti del Metodo Efirm. (A) Metodo di estrazione esosomi da BIOFLUID con CD63 anti-uomo rivestito microparticelle magnetiche e quindi lo scarico exosome carico con onde quadre ciclici applicate al complesso particelle exosome. (B) Schema di elettrodi biosensore di rilevazione dei bersagli di RNA / DNA / proteine ​​dal exosome rilasciato. (C) Esempio rappresentativo di lettura amperometrica dalla metodologia Efirm, dove più consistente attuale corrisponde to livelli elevati di una biomolecola. Questa cifra è da Wei et al. 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52439/52439fig2large.jpg" target="_blank">, cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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</ol>

David Wong è co-fondatore di RNAmeTRIX Inc., una società di diagnostica molecolare. PeriRx LLC sublicenza proprietà intellettuali relative alla diagnostica molecolare da RNAmeTRIX. David Wong è un consulente di PeriRx.

Come i risultati indicano, CD63 anti-umana rivestite nanoparticelle magnetiche sono in grado di catturare specificamente piccole particelle che hanno una dimensione che varia 70-100 nm. Questa particella catturata è coerente con il profilo precedentemente osservata di esosomi. Inoltre, l&#39;utilizzo del CSW bassa tensione in seguito alla cattura delle particelle è indicata per rimuoverli dalla superficie tallone e causare profili degradazione DNA simile a quello di un metodo tradizionale tampone di lisi base per il ril...

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>. The disclosures were updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>.

Errata: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Ricerca Exosome è un settore emergente della ricerca che esamina microvescicole lipidiche che portano RNA 1, 2 DNA e proteine ​​3 cargo. Precedenti indagini exosome biologia hanno portato alla identificazione di esosomi in biofluidi come il sangue 4, 5 urine, latte materno 6, e 7 saliva. Studi hanno dimostrato che esosomi giocano un ruolo in diverse vie cellulari, meditazione remoto comunicazione tra diversi sistemi del corpo 8. A causa del ruolo esosomi giocano nella comunicazione intercellulare, si ipotizza che possano pacchetto obiettivi biomolecole (proteine, RNA e DNA) correlati con stati patologici. In vitro 3 e modello animale 9 studi sembrano confermare questa ipotesi. In indagando contenuti exosomal per la scoperta di biomarcatori, è necessario sviluppare una metodologia per l&#39;isolamento selettivo exosome da biofluidi, expulsi indottosu di carico da esosomi, e la quantificazione di biomolecole exosome. Nella misura di questo lavoro, exosomes saranno definite come una struttura avente un diametro di circa 70-100 nm e possedendo superficie marcatore CD63. I ricercatori in genere prima purificano exosomes di ultracentrifugazione 10 e poi elaborare il contenuto exosomal attraverso l&#39;utilizzo di kit tampone di lisi. L&#39;utilizzo di metodi tampone di lisi richiede tempi di incubazione che vanno da minuti a ore. Questo processo può potenzialmente danneggiare exosome carico e portare a campione degrado. Ad esempio, salivare RNA exosome rilasciato tramite tampone di lisi nell&#39;ambiente extracellulare circostante possiede una emivita di sotto 1 min, rendendo la misurazione di exosomal post-RNA Lysis Buffer un compito particolarmente difficile senza l&#39;aggiunta di reagenti stabilizzazione 11. L&#39;effetto composto di aggiungere vari reagenti per la lisi e la stabilizzazione può introdurre agenti che complicano e interferire con la analysis di contenuti exosomal. Un approccio alternativo può essere utile per lo scarico rapidamente contenuti exosomal e conservare in modo sicuro il carico per la caratterizzazione. In questo lavoro, si propone l&#39;utilizzo di un campo elettrico non uniforme per il rilascio di contenuti exosomal. Campi elettrici sono stati conosciuti per portare la capacità di polarizzare e disturbare il doppio strato lipidico che forma membrane cellulari. Il nostro lavoro sperimentale esplora l&#39;uso di non-uniforme onde quadre ciclici (CSW) per interrompere la struttura microvesicle di esosomi e rilasciando merci trasportate. Questo metodo utilizza tensioni in diverse centinaia di millivolt gamma, il che significa che la maggior parte delle biomolecole non saranno interrotte. Abbiamo dimostrato che l&#39;utilizzo di un&#39;onda ciclica quadrati è in grado di comandare il rilascio di salivare exosome contenuti mRNA nell&#39;ambiente fluido circostante. Questa versione del contenuto exosomal è perfettamente integrato con un sistema di elettrodi che può essere usato per quantificare i livelli di espressione biomarker 12,13. Questo metodo proposto consente una rapida, sensibile, e tampone di lisi analisi prive di contenuti exosome. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig1highres.jpg" /> Figura 1. Panoramica Efirm Workflow.. Il metodo Efirm è sostanzialmente divisa in tre principali fasi che sono necessarie per la purificazione e esosomi analisi. Questo metodo di rilascio e di analisi dei contenuti exosomal basato CSW viene utilizzato in combinazione con microsfere magnetiche specifici CD63 per l&#39;isolamento exosome. Queste perle di CD63-affinità consentono l&#39;isolamento selettivo di esosomi da campioni salivari (e altri fluidi biologici). Dopo l&#39;incubazione e l&#39;estrazione dei esosomi utilizzando le perle magnetizzati, le perle sono migrati al sistema sensore elettrochimico per la CSW basato rilascio contenuto e parte l&#39;analisi dell&#39;esperimento. Figura 1 fornisce una panoramica del lavoroflusso del metodo Efirm.

<table><tbody><tr><td>Sistema di lettura Helios a 16 canali con interfaccia chip&nbsp;</td><td>Genefluidica, Stati Uniti</td><td> RS-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>16x Sensor Chip, Bare Gold, confezione da 5 chip</td><td>Genefluidics, USA</td><td>SC1000-16X-B</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilato anti-umano CD63 Anticorpo</td><td>Ancell, USA</td><td>215-030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Invitrogen, USA</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Neodynium Magnetics (1/10" dia. x 1/32" di spessore)</td> <td>K& J Magnetics, USA</td><td>DH101</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata ultrapura</td><td>Life Technologies, USA</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Mettler Toldeo 3 M KCl Solution</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>1911512</td><td></td></tr><tr><td>Pyrrole</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>W338605-100g</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td><td>Roche, Germania</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>Substrato di 3,3&prime;,5&prime;-tetrametilbenzidina (TMB/H2O2, bassa attività)</td><td>Neogen, USA</td><td>330175</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Life Technologies, USA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Caseina/PBS</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>37532</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevazione di exosomal biomarker da campo elettrico indotto rilascio e di misura (efirm)

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Esosomi sono strutture microvescicolare che svolgono un ruolo di mediazione nella comunicazione intercellulare. È interessante studiare il carico interno di esosomi per determinare se trasportano malattie biomarcatori discriminatori. Per l&#39;esecuzione di analisi exosomal, è necessario sviluppare un metodo per l&#39;estrazione e l&#39;analisi exosomes da biofluidi bersaglio senza danneggiare il contenuto interno. Rilascio elettrico campo indotto e misura (Efirm) è un metodo per estrarre specificamente esosomi da biofluidi, scaricando il loro carico, e testare il loro contenuto di RNA / proteine ​​interna. L&#39;utilizzo di un CD63 specifici anticorpi microparticelle magnetico anti-umano, esosomi vengono prima precipitati da fluidi biologici. Dopo l&#39;estrazione, a bassa tensione onde elettriche quadre ciclici (CSW) vengono applicati per distruggere la membrana vescicolare e causare carico scarico. Il contenuto del exosome viene ibridato al primer DNA o anticorpi immobilizzati su una superficie dell&#39;elettrodo per quantification contenuto molecolare. Il metodo Efirm è vantaggioso per l&#39;estrazione di esosomi e scarico merci per analisi senza tampone di lisi. Questo metodo è in grado di eseguire il rilevamento preciso dei due bersagli di RNA e proteine ​​biomarcatori nella exosome. Efirm estrae esosomi specificamente in base alle loro marcatori di superficie al contrario di tecniche basate dimensioni. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e test dimostrano la funzionalità del metodo per exosome acquisizione e l&#39;analisi. Il metodo è stato applicato a Efirm exosomal analisi di 9 topi iniettati con le cellule H640 cancro del polmone umano (una linea cellulare trasfettata per esprimere il marcatore exosome umana CD63-GFP), al fine di testare il loro profilo exosome contro 11 topi che ricevono controlli saline. Elevati livelli di biomarkers exosomal (riferimento gene GAPDH e proteine ​​marcatori superficie umana CD63-GFP) sono stati trovati per l&#39;H640 iniettato topi in entrambi i campioni di siero e saliva. Inoltre, saliva e campioni di siero sono stati dimostrato di avere linearità (R = 0,79). Questi risultati sono suggestivi per la vitalità di biomarcatori exosome salivari per la rilevazione di malattie distali.

Validazione di Exosome Cattura di Beads Uso TEM Isolamento di esosomi da saliva utilizzando sfere magnetiche CD63 anti-umani è stato convalidato dopo protocollo di estrazione mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) immagini. TEM mostra sfere magnetiche con granuli 70-100 nm immediatamente adiacenti (vedi Figura 3A, 3B e), in coerenza con il profilo noto di esosomi. Nessun 70-100 granuli nm sono stati osservati per le sfere magnetiche di saliva ...

Gli esosomi sono strutture microvescicolari che si trovano all'interno di biofluidi che potenzialmente trasportano importanti biomarcatori discriminatori della malattia. Qui, viene utilizzato un nuovo metodo per estrarre specificamente gli esosomi e testare rapidamente il carico esosomiale per entrambi i bersagli RNA/proteina dopo la rottura degli esosomi utilizzando onde quadre cicliche elettriche non uniformi.

Rilevazione di Exosomal Biomarker da campo elettrico indotto rilascio e di misura (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è estrarre in modo efficiente gli esosomi dai fluidi biologici, rilasciare il contenuto intracellulare degli esosomi ed analizzarlo rapidamente. Questo viene ottenuto innanzitutto estraendo gli esosomi dai fluidi biologici mediante microparticelle magnetiche rivestite con anticorpi specifici per marcatori degli esosomi, quindi caricando gli esosomi estratti sulla superficie di un elettrodo. Successivamente, gli esosomi vengono lisiati mediante un campo elettrico e il loro contenuto viene ibridato con sonde presenti sulla superficie dell'elettrodo.Viene inoltre ibridata al sistema una molecola marcatrice. L'ultimo passaggio consiste nell'aggiungere una soluzione di substrato alla superficie dell'elettrodo e quindi ottenere il segnale misurando la corrente elettrica. In definitiva, la misurazione elettrochimica della corrente viene utilizzata per determinare la quantità di acido nucleico o di contenuto proteico nel campione di esosoma.Il principale vantaggio di questa tecnologia rispetto ai metodi esistenti, come l'ultracentrifugazione e il tampone lisina, è che si tratta di un metodo semplice e rapido per estrarre e analizzare il contenuto degli esosomi. Siamo molto entusiasti di questa tecnologia perché, per la prima volta, la tecnologia efim ci permette di utilizzare le informazioni rilasciate dagli organi in condizioni patologiche o fisiologiche, che provengono dall'organo di origine attraverso la vascolarizzazione e arrivano nella nostra cavità orale. Questa tecnologia ci consente di catturare tali informazioni e di rilasciare il contenuto molecolare che possiamo rilevare contemporaneamente in modo flessibile.Questa informazione discriminatoria per la malattia, in generale, può risultare difficile per gli utenti nuovi rispetto a questo metodo, poiché l'uso di microparticelle magnetiche può essere complesso se non si presta sufficiente attenzione. Inoltre, l'impiego di metodi elettrochimici nell'analisi di campioni biologici può rappresentare un paradigma nuovo per alcuni. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché l'uso delle microparticelle magnetiche e il caricamento elettrochimico sono difficili da apprendere. È necessario prestare particolare attenzione durante la manipolazione delle microparticelle magnetiche e durante il loro caricamento sugli elettrodi.Per iniziare la risospensione, preparare una soluzione madre contenente 10 microgrammi per millilitro di microparticelle magnetiche ricoperte di streptadina e aggiungere cinque microlitri. Aggiungere la soluzione a un tubo da microcentrifuga contenente 495 microlitri di PBS per lavare le perle. Prima, posizionare il tubo su un supporto magnetico per un minuto ed eliminare con attenzione il tampone senza disturbare le perle.Quindi trasferire il tubo su un supporto non magnetico. Aggiungere 500 microlitri di PBS e agitare delicatamente per lavare le perle. Ripetere il lavaggio un totale di tre volte; dopo l'ultimo lavaggio, riutilizzare le perle.Sospendere le perline in 490 microlitri di PBS e quindi aggiungere cinque microlitri di anticorpo Biotinilato anti-CD63 umano da mouse proveniente da una soluzione madre di un milligrammo per millilitro. Mescolare la soluzione mediante pipettaggio e programmare un rotatore per campioni per una rotazione reciproca a 90 gradi per cinque secondi e una vibrazione a cinque gradi per un secondo. Posizionare i tubi nel rotatore ed eseguire il programma per 30 minuti a temperatura ambiente.Successivamente, trasferire le provette sul portaprovette magnetico per cinque minuti. Lavare le perle tre volte con 500 microlitri di PBS e quindi risospendere in 490 microlitri di PBS contenente Caine. Etichettare una provetta con l'identificazione del campione e quindi aggiungere 10 microlitri del campione, pipettando più volte per mescolare il campione con le perle coniugate con l'anticorpo.Successivamente, trasferire le provette sul rotatore per campioni ed eseguire lo stesso programma per due ore a temperatura ambiente. Quindi lavare le perline tre volte con 500 microlitri di un tampone di tris cloridrato uno molare. Utilizzando il supporto magnetico, gli esosomi sono ora legati alle perline magnetiche per preparare l'elettrodo.Prima diluire i reagenti concentrati della sonda, del cloruro di potassio e del monomero ole in acqua distillata. La sonda di DNA biotinilata al capo 5' è specifica per l'mRNA di GA DH. Mescolare la soluzione della sonda con il monomero mediante vortex.Utilizzare un array di elettrodi con 16 sensori in cui ogni elettrodo unitario è costituito da elettrodi di lavoro, contatore e di riferimento composti da oro nudo. Posizionare un pozzetto di plastica sull'array di elettrodi per evitare contaminazioni incrociate tra gli elettrodi. Trasferire 60 microlitri della soluzione del sonda monomero sulla superficie di un elettrodo d'oro in modo che gli elettrodi di lavoro, contatore e di riferimento siano coperti dal liquido.Applicare un profilo di campo elettrico a onda quadra ciclica, noto come campo A-C-S-W-E, per elettropoliemerizzare una sonda monomerica. Ciò crea uno strato polimerico conduttivo sulla superficie dell'elettrodo. Risciacquare il sensore tre volte con acqua distillata e quindi asciugarlo con gas azoto per rimuovere il liquido dalla superficie dell'elettrodo.Dopo aver preriscaldato l'elettrodo con la sonda di cattura, aggiungere cinque microlitri di una soluzione di un micromolare della sonda di rilevamento a 495 microlitri della soluzione complessa di microsferette ed esosomi, quindi mescolare mediante pipettaggio. La sonda è un primer di DNA coniugato con fluoresceina all'estremità tre primi, specifico per GA dh. Posizionare un array di elettrodi pre-codificato sopra un array di magneti costituito da 16 magneti allineati agli elettrodi di lavoro del sensore.Trasferire quindi 60 microlitri della soluzione di esosomi con perline sulla superficie dell'elettrodo. Applicare un campo A-C-S-W-E per 20 cicli. Il carico esosomale rilasciato si ibridizzerà con la sonda presente sulla superficie dell'elettrodo.Sciacquare la superficie dell'elettrodo tre volte con acqua distillata per rimuovere eventuali analiti non legati, quindi asciugare l'elettrodo con gas azoto. Successivamente, preparare una diluizione da uno a 1000 di anticorpo anti-fluoresceina coniugato con HRP in PBS contenente Caine. Aggiungere quindi 60 microlitri della diluizione di anticorpo sulla superficie dell'elettrodo.Applicare il campo A-C-S-W-E sulla superficie dell'elettrodo per coniugare l'anticorpo anti-fluoresceina HRP alla sonda di rilevamento. Risciacquare la superficie del sensore tre volte con acqua distillata per rimuovere l'eccesso di anticorpo, quindi asciugare l'elettrodo con gas azoto. Successivamente, caricare 60 microlitri di substrato TMB su ciascuna superficie del sensore mediante pipetta multicanale, utilizzando un potenziostato per misurare la corrente dell'elettrodo a -200 millivolt per 60 secondi.Per ottenere il risultato di lettura tric, è stata utilizzata la microscopia elettronica a trasmissione per determinare se gli esosomi fossero legati alle perle magnetiche. I granuli di dimensioni comprese tra 70 e 100 nanometri attaccati alle perle sono compatibili con le dimensioni note degli esosomi dopo la lisi provocata dal campo elettrico o dal detergente. Non sono visibili esosomi nelle vicinanze delle perle. L'mRNA di GA DH negli esosomi è stato rilevato mediante lettura atric. La quantità di GA DH presente diminuisce nel tempo come previsto in seguito alla lisi degli esosomi da parte del campo elettrico o di un detergente, indicando l'esposizione all'ambiente extravesicolare della saliva. Efim è stato utilizzato per misurare il contenuto esosomale del siero e della saliva di topi a cui erano state iniettate cellule di carcinoma polmonare umano che producono un marcatore esosomale umano CD 63 GFP.Dopo 20 giorni, livelli più elevati di CD63 GFP sono stati riscontrati sia nel siero che nella saliva dei topi inoculati con le cellule tumorali, ma non nei topi inoculati con soluzione salina. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di evitare di toccare le perle per estrarre una quantità adeguata di liquido durante il lavaggio delle perle, lavare uniformemente la superficie dell'elettrodo e caricare correttamente le regioni sull'elettrodo. Questa tecnologia, questa tecnologia efim, ha fornito quella fondamentale capacità insoddisfatta di come una malattia sistemica, un organo distale, possa rilasciare le proprie informazioni e calcolarle in questa entità chiamata esosomi.Come arrivano nella saliva, nella nostra cavità orale, e come è possibile catturare gli esosomi, rilasciare questi bersagli molecolari e consentirne la rilevazione contemporanea in malattie potenzialmente gravi come il diabete, il cancro del pancreas o altri disturbi a rischio per la vita. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come estrarre rapidamente gli esosomi da un liquido biologico, come liberare il contenuto degli esosomi e come analizzare velocemente il loro carico mediante un sistema elettrodico integrato.

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