Rilevazione di Exosomal Biomarker da campo elettrico indotto rilascio e di misura (Efirm)

L'obiettivo generale di questa procedura è estrarre in modo efficiente gli esosomi dai biofluidi, espellere il carico di esosomi e analizzare rapidamente il carico. Ciò si ottiene estraendo prima gli esosomi dai biofluidi utilizzando microparticelle magnetiche con anticorpi mirati al marcatore dell'esosoma e quindi caricando gli esosomi estratti sulla superficie di un elettrodo. Successivamente, l'esosoma viene posato utilizzando un campo elettrico e il carico dell'esosoma viene ibridato con sonde sulla superficie dell'elettrodo.

Anche una molecola reporter viene ibridata al sistema. Il passaggio finale consiste nell'aggiungere una soluzione di substrato alla superficie dell'elettrodo e quindi ottenere la lettura misurando la corrente elettrica. In definitiva, la misurazione elettrochimica della corrente viene utilizzata per mostrare la quantità di acido nucleico o contenuto proteico nel campione di esosomi.

Il vantaggio principale di questa tecnologia rispetto al metodo esistente, come l'ultra centrificazione e il tampone di lisina, è che si tratta di un metodo semplice e rapido per estrarre e testare il contenuto di esosomi. Siamo molto entusiasti di questa tecnologia perché, per la prima volta, questa tecnologia efim ci permette di utilizzare le informazioni che vengono emesse dagli organi in malattia o in normalità che vengono emesse dall'organo di origine attraverso il sistema vascolare e quando entrano nella nostra cavità orale. Questa tecnologia ci consente di acquisire queste informazioni e rilasciare il contenuto molecolare che possiamo rilevare contemporaneamente in modo flessibile.

Questa malattia informazioni discriminatorie, in generale, gli utenti nuovi a questo metodo possono avere difficoltà perché l'uso di microparticelle magnetiche può essere difficile se non si sta attenti. Inoltre, l'uso di metodi elettrochimici nell'analisi di campioni biologici può essere un nuovo paradigma per alcuni La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le microparticelle magnetiche e l'elettrocarico sono difficili da imparare. Particolare attenzione deve essere prestata quando si maneggiano le microparticelle magnetiche e le si carica sugli elettrolodi.

Per iniziare la risospensione, una soluzione madre contenente 10 microgrammi per millilitro di microparticelle magnetiche rivestite di strept adin e aggiungere cinque microlitri. La soluzione ad una provetta da microcentrifuga contenente 495 microlitri di PBS per lavare le perle. Per prima cosa, posizionare la provetta su una griglia magnetica per un minuto e rimuovere con cura il tampone senza disturbare le perline.

Quindi trasferire la provetta su una rastrelliera non magnetica. Aggiungere 500 microlitri di PBS e PET per lavare le perline. Fallo per un totale di tre volte dopo il lavaggio finale.

Sospendi le perle in 490 microlitri di PBS e poi aggiungi cinque microlitri di anticorpo biotinilato di topo anti-umano CD 63 da una soluzione madre di un milligrammo per millilitro. Miscelare la soluzione mediante pipettaggio, programmare un rotatore di campioni per una rotazione reciproca a 90 gradi per cinque secondi e una vibrazione a cinque gradi per un secondo. Posizionare i tubi nel rotatore ed eseguire il programma per 30 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, trasferire le provette sulla rastrelliera magnetica per cinque minuti. Lavare le perle tre volte con 500 microlitri di PBS e poi rispenderle in 490 microlitri di PBS contenente Caine. Etichettare una provetta con l'identificazione del campione, quindi aggiungere più volte 10 microlitri di pipetta per campioni per miscelare il campione con le perle coniugate con anticorpi.

Quindi, trasferire le provette nel rotatore di campioni ed eseguire lo stesso programma per due ore a temperatura ambiente. Quindi lavare la perlina tre volte con 500 microlitri di un tampone tris cloridrato monomolare. Utilizzando la cremagliera magnetizzata, gli esosomi sono ora legati alle perle magnetizzate per preco l'elettrodo.

Per prima cosa diluire i reagenti stock della sonda, il cloruro di potassio e il monomero ole in acqua distillata. La sonda a cinque prime biotinilate DNA è specifica per l'mRNA GA DH. Mescolare la soluzione della sonda monomerica mediante vortex.

Utilizzare un array di elettrodi a 16 sensori in cui ogni elettrodo unitario è costituito da un contatore di lavoro e da elettrodi di riferimento composti da oro nudo. Posizionare un pozzetto di plastica sull'array di elettrodi per evitare la contaminazione incrociata degli elettrodi. Trasferire 60 microlitri della soluzione della sonda monomerica sulla superficie di un elettrodo d'oro in modo che il contatore di lavoro e gli elettrodi di riferimento siano coperti dal liquido.

Applicare un profilo di campo elettrico a onda quadra ciclica noto come campo A-C-S-W-E a una sonda monomerica elettropolimerizzata. Questo crea uno strato di polimero conduttore sulla superficie dell'elettrodo. Sciacquare il sensore tre volte con acqua distillata e poi asciugarlo con azoto gassoso per rimuovere il liquido dalla superficie dell'elettrodo.

Dopo aver preco l'elettrodo con la sonda di cattura, aggiungere cinque microlitri di una soluzione monomoleare della sonda rivelatrice a 495 microlitri della soluzione complessa di esosomi a microsfere, quindi mescolare mediante pipettaggio. Qui. La sonda è un primer di DNA coniugato con fluoresceina a tre prime, specifico per GA dh. Posizionato un array di elettrodi precodificato su un array di magneti composto da 16 magneti allineati agli elettrodi di lavoro del sensore.

Quindi trasferire 60 microlitri della soluzione di esosoma della perlina sulla superficie dell'elettrodo. Applicare il campo A-C-S-W-E per 20 cicli. Il carico esosomiale rilasciato si ibriderà con la sonda sulla superficie dell'elettrodo.

Sciacquare la superficie dell'elettrodo tre volte con acqua distillata per rimuovere eventuali analiti non legati, quindi aspirare l'elettrodo con azoto gassoso. Successivamente, effettuare una diluizione da uno a 1000 di anticorpo coniugato HRP anti fluoresceina in PBS contenente Caina. Quindi aggiungere 60 microlitri di diluizione dell'anticorpo sulla superficie dell'elettrodo.

Applicare il campo A-C-S-W-E sulla superficie dell'elettrodo per coniugare l'anticorpo HRP anti fluoresceina alla sonda del rivelatore. Sciacquare la superficie del sensore tre volte con acqua distillata per rimuovere l'anticorpo in eccesso, quindi aspirare l'elettrodo con azoto gassoso. Quindi, caricare 60 microlitri di substrato TMB su ciascuna superficie del sensore con una pipetta multicanale utilizzando una statistica di potenziali elettrochimici per misurare la corrente dell'elettrodo a 200 millivolt negativi per 60 secondi.

Per ottenere la lettura tric, la microscopia elettronica a trasmissione è stata utilizzata per determinare se gli esosomi erano legati alle perle magnetiche. I granuli di dimensioni da 70 a 100 nanometri attaccati alle perle sono coerenti con le dimensioni note degli esosomi dopo lisi da parte del campo elettrico o del detergente. Non sono evidenti esosomi vicino alle perline.

L'mRNA di GA DH negli esosomi è stato rilevato mediante lettura atrica. La quantità di GA DH presente nel tempo diminuisce come previsto dopo la lisi dell'esosoma da parte del campo elettrico o del detergente, indicando l'esposizione all'ambiente extra vescicolare della saliva. Efim è stato utilizzato per misurare il contenuto esosomiale del siero e della saliva di topi a cui sono state iniettate cellule tumorali del polmone umano, producendo un marcatore esosomico umano CD 63 GFP.

Dopo 20 giorni, livelli più elevati di GFP CD 63 sono stati riscontrati sia nel siero che nel sali dei topi a cui sono state iniettate le cellule tumorali, ma non nei topi a cui è stata iniettata soluzione salina. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che evitare di toccare le perle per estrarre una quantità adeguata di liquido durante il lavaggio delle perle per lavare uniformemente la superficie dell'elettrodo e caricare correttamente le regioni sull'elettrodo. Questa tecnologia, questa tecnologia efim, ha fornito quella capacità critica insoddisfatta di come una malattia sistemica, un organo distale, possa rilasciare le proprie informazioni e calcolarle in questa entità chiamata esosomi.

Come entrano nella saliva, nella nostra cavità orale e sono in grado di catturare gli esosomi, rilasciare questi bersagli molecolari e consentire che venga rilevato contemporaneamente a malattie minacciose, diabete, cancro al pancreas o altri disturbi potenzialmente letali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre rapidamente gli esosomi da un biofluido, come scaricare il carico degli esosomi e come analizzare rapidamente il contenuto degli esosomi utilizzando un sistema di elettrodi integrato.