Sviluppo di inibitori di interazioni proteina-proteina attraverso REPLACE: Applicazione alla progettazione e allo sviluppo non ATP inibitori CDK competitivo

L'obiettivo generale della strategia è quello di generare un'efficace terapia farmacologica a piccola molecola attraverso la conversione di un inibitore peptidico di un'interazione proteina-proteina. Ciò si ottiene stabilendo una relazione struttura-attività per l'interazione peptidica proteina desiderata per capire quali parti possono essere efficacemente sostituite come secondo passo. La chimica computazionale viene utilizzata per identificare valide alternative di frammento per i determinanti peptidici noti, che possono quindi essere utilizzati per sintetizzare una libreria di ibridi peptidici di frammenti.

Successivamente, una libreria di ibridi viene sintetizzata tra questi frammenti e il peptide troncato al fine di generare molecole che possono essere testate in un saggio in vitro per identificare molecole che sono più simili a farmaci e che ricapitolano l'attività del peptide nativo. I risultati mostrano che è possibile identificare più composti simili a farmaci utilizzando la metodologia, e questi rappresentano punti di partenza efficaci per la scoperta di farmaci inibitori delle interazioni proteina-proteina. Quindi il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come lo screening ad alto rendimento è che la trazione proteica e proteica è estremamente impegnativa dal punto di vista della scoperta di farmaci e i metodi convenzionali non funzionano bene.

La strategia di sostituzione prevede l'approccio iterativo graduale e quindi può richiedere più tempo o è più probabile che sia efficace nel lungo periodo. Oggi dimostrerò la maggior parte delle procedure da solo con l'assistenza della mia associata, la dottoressa Sandra Craig, che imposterà alcune delle reazioni e delle procedure. Iniziare questa procedura con la convalida del protocollo di aggancio, seguita dalla preparazione del sito di legame del recettore e dei ligandi come descritto nel protocollo di testo per agganciare i ligandi nel solco della ciclina.

Innanzitutto, selezionare la routine di adattamento del ligando dal protocollo di interazioni del ligando del recettore impostato sul software, utilizzare il recettore e i ligandi preparati come input per questo protocollo. Per queste esecuzioni, selezionare PLP one come rete energetica. La rete energetica utilizzata dal programma di docking è il campo di forza per generare interazioni con i recettori dei ligandi e potenziali pose.

Plp uno è il potenziale lineare per la pace, che dà priorità alle interazioni di legame idrogeno. Specificare che l'energia delle pose deve essere ridotta al minimo e che il numero di pose generate è 10. Lasciate tutti gli altri parametri ai valori predefiniti in prima istanza.

Visualizza le pose nel programma di visualizzazione e quindi ordina in base ai valori decrescenti del punteggio PLP one. Utilizzare funzioni di punteggio come plp, una per stimare l'affinità di legame di un ligando ancorato in base alla posa di un ligando candidato, alla geometria e all'interazione non covalente con la struttura del recettore bersaglio. Analizza visivamente il 25% delle pose con punteggio per la super impossibilità con il gruppo di capping noto.

Osserva anche se la posa ha soddisfatto i filtri di interazione, che sono impostati per includere restrizioni atomiche che richiedono contatti intermolecolari noti per essere critici per il legame e/o sono necessari per posizionare il potenziale gruppo di capping nella geometria corretta per la formazione del legame ammidico. Infine, esaminare le pose per la complementarità visiva, che è definita come avere un riempimento efficiente della tasca di legame in un modo che è coerente con l'attività della struttura nota. Relazioni per la sintesi di gruppi di tappatura, utilizzo di tutti i materiali di partenza commerciali, solventi e reagenti e sintesi mediante chimica organica sintetica convenzionale.

Eseguire la cromatografia su strato sottile o TLC su gel di silice per monitorare le reazioni sciogliendo prima il materiale di partenza e la miscela di reazione nella fase mobile. Quindi individuare il materiale di partenza disciolto e la miscela di reazione sulla piastra TLC utilizzando tubi capillari. Posizionare la piastra TLC nella camera contenente la fase mobile.

Una volta che la fase mobile raggiunge il 90% della lastra TLC, rimuovere e asciugare la lastra all'aria. Utilizzare la luce UV per rilevare il materiale di partenza e le miscele di reazione come macchie visibili. Quindi calcola la RF di ogni punto, che è il rapporto tra la distanza percorsa dallo spot e la fase mobile.

Quindi, posizionare la miscela di reazione in un imbuto separatore e lavarla con una soluzione acquosa di acido o basica, a seconda dei casi. Raccogliere il solvente organico e farlo evaporare in un evaporatore rotante prima dell'essiccazione. Il prodotto grezzo ottenuto sotto vuoto scioglie 500 milligrammi di prodotto grezzo in tre o cinque millilitri di solvente adatto e aggiunto a un campione di silice o RP 18 prima di essiccarlo all'aria, posto un campione contenente il prodotto grezzo in silice, cartucce a scatto a fase inversa.

Purificare il materiale grezzo utilizzando la cromatografia flash automatizzata ad alte prestazioni. Utilizzo di una colonna a scatto da 100 grammi con gradiente. Esecuzione di oltre 15 volumi di colonne.

Essiccare il prodotto purificato raccolto nel solvente dalla cromatografia flash utilizzando un evaporatore rotante facendo evaporare tutto il solvente fino a essiccarlo. Successivamente asciugare ulteriormente il prodotto sotto vuoto per rimuovere tutti i solventi residui. Eseguire la caratterizzazione del prodotto purificato mediante NMR MS e HPLC analitica come descritto nel protocollo di testo per sintetizzare il frammento con cappuccio terminale, i peptidi inibitori legati o l'assemblaggio di flip.

Composti peptici terminati mediante metodi standard di sintesi in fase solida. Attivare cinque equivalenti dell'aminoacido C terminale in 4,4 equivalenti di HBTU in due millilitri di DIMETILFORMAMMIDE o DMF per cinque minuti. Caricare la miscela sulla resina di pista utilizzando sei equivalenti di isopropil etilammina per un'ora a temperatura ambiente.

Rimuovere il gruppo protettivo FM dal residuo terminale C utilizzando il 20% di INE in tre millilitri di DMF per 10 minuti. Accoppiare gli amminoacidi successivi passo dopo passo ad ogni passo. Accoppiare cinque equivalenti dell'amminoacido successivo utilizzando sei equivalenti di DI isopropilico, etilammina e 4,4 equivalenti di HBTU in due millilitri di DMF per un'ora.

A temperatura ambiente, applicare cicli di lavaggio dopo l'accoppiamento degli amminoacidi e le fasi di protezione FM D dopo l'assemblaggio dei peptidi. Accoppiare gruppi di tappatura N utilizzando sei equivalenti di DI isopropilico, etilammina e 4,4 equivalenti di HBTU in due millilitri di DMF per un'ora a temperatura ambiente al termine dell'assemblaggio del peptide. Trattare la miscela di reazione con due millilitri della miscela di scissione durante la notte per rimuovere i gruppi protettivi della catena laterale e Cleve capovolge la resina tritrando il prodotto risultante con etere datilico freddo per precipitare e, se necessario, concentrare in un evaporatore rotante filtrare il solido risultante e asciugare sotto vuoto o liofilizzare utilizzando un liofilizzatore.

A questo punto, procedere al saggio di legame di polarizzazione della fluorescenza come descritto nel protocollo di testo per la determinazione del legame competitivo. Viene mostrata la struttura del modello di H-A-K-R-R-L-I-F legato alla scanalatura di legame del ciclone. La scanalatura del ciclo è costituita da due tasche idrofobiche, una tasca primaria più grande e una tasca secondaria più piccola, che sono colmate da residui acidi raffigurati in rosso.

Altre importanti interazioni includono i contatti di legame idrogeno della spina dorsale del peptide e le interazioni di accoppiamento ionico dei tre residui basici del peptide qui, viene mostrata la modalità di legame di tre cinque D-C-P-T-R-L-I-F, mostrata con interazioni di legame idrogeno con atomi a catena laterale di triptofano due 17 e glutammina 2 54 agganciati. Vengono mostrate le pose di tre gruppi rappresentativi e di capping con ciascuno di questi composti che possiedono legami idrogeno con gli atomi filtro di interazione del triptofano due 17 e della glutammina 2 54. Come raffigurato dalle linee tratteggiate verdi, il finocchio sussistente fa interazioni della parete di Vander con la tasca idrofobica secondaria.

Dopo aver visto questo video, avrai una migliore comprensione di come eseguire e applicare la strategia di sostituzione, convertendo un noto inibitore peptidico in una molecola più simile a un farmaco, che inibisce la trazione di una proteina proteica ed è un punto di partenza per lo sviluppo terapeutico.