Name: Transposon Mediated Integrazione di DNA plasmide nella zona subventricolare di topi neonati a generare modelli Novel di Glioblastoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Scopri come indurre glioblastomi in topi neonati mediante iniezione intraventricolare di plasmidi transposon. Questo protocollo consente di monitorare la progressione tumorale con bioluminescenza e analizzare le alterazioni genetiche specifiche.

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Ringraziamo il Dr. John Ohlfest e la Dr. Stacey Decker13 per il generoso dono dei plasmidi e per la formazione fornita per padroneggiare questo metodo. Ringraziamo Marta Dzaman per l'aiuto nella standardizzazione della procedura di colorazione con ematossilina-eosina delle sezioni incluse in paraffina. Ringraziamo anche Molly Dahlgren per aver esaminato attentamente questo manoscritto e per aver fornito utili suggerimenti. Questo lavoro è supportato da sovvenzioni NIH/NINDS a MGC e PRL, da sovvenzioni della Leah's Happy Hearts Foundation a MCG e PRL. Premio per giovani investigatori della Alex's Lemonade Foundation e la borsa di studio della St. Baldrick's Foundation a CK.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo articolo, abbiamo dettaglio un metodo versatile e riproducibile per la generazione di nuovi modelli di GBM utilizzando integrazione SB transposase- mediata oncogeno DNA plasmide nelle cellule che circondano la zona subventricolare di topi neonati. Vi presentiamo un protocollo per generare plasmidi trasposoni nuovi geni di interesse, illustreremo come monitorare la progressione dei tumori negli animali vivi, e come caratterizzare caratteristiche isto-patologico e immunoistochimiche di questi tumori. <p clas...

Glioblastoma multiforme (GBM) è il (60%) tumore cerebrale primario più comune negli adulti, con una sopravvivenza mediana di 15-21 mesi, quando trattati con la chirurgia, la radioterapia e la chemioterapia 1. Nuove terapie per GBM sono indispensabili. Terapie sperimentali richiedono test su modelli animali che riproducono in maniera adeguata le caratteristiche salienti della malattia umana. Strategie per indurre GBM nei roditori sono mutagenesi chimica con agenti alchilanti, linea germinale o alterazioni genetiche somatiche, o il trapianto utilizzando linee cellulari di glioma 2. I modelli più utilizzati impiegano l&#39;impianto di linee cellulari di glioma, sia ortotopicamente, nel cervello o sottocutanea utilizzando cellule singeniche negli animali con genotipo identico; o xenogeniche, linee più comunemente umani cellule GBM, impiantati in topi immunocompromessi 3. Xenotrapianti offrono molti vantaggi per lo studio dei tumori intracranici: comodità di riproducibilità, standatassi di crescita rdized, tempo di morte e di tumore localizzazione. Tuttavia, questi modelli hanno dei limiti a causa l&#39;approccio chirurgico artificiale, invasivo utilizzato per implantologia e limitata capacità di riprodurre accuratamente istologica tratti caratteristici di GBM umano (grado IV): pseudo-pallisading necrosi, atipie nucleari, invasione diffusa, la proliferazione di micro-vascolare e la formazione di anomalie vascolari glomeruloid 4-7. Induzione di GBM alterando il genoma delle cellule somatiche con il DNA oncogeno, sia con vettori virali 8-12, o con transposon mediata integrazione 13, riproduce più da vicino l&#39;eziologia delle malattie umane e ricapitola le caratteristiche isto-patologici di GBM umana. Storicamente, i tumori del SNC sono stati classificati in base alla cella percepita di origine, che è stato osservato, sarebbe un fattore predittivo per la sopravvivenza 14. GBM sono classificati in primaria e secondaria. Emergenti prove today punti per la natura altamente eterogenea di glioblastoma primario 15. GBM secondaria (15%), il risultato della trasformazione maligna di astrocitoma di grado basso (grado I) e astrocitoma anaplasic (grado II), sono associati con insorgenza più precoce della malattia, una migliore prognosi e un modello &quot;proneurale&quot; di espressione genica , considerando primaria GBM (85%) mostrano un esordio tardivo, cattiva prognosi e gliali (classica), neurale o pattern di espressione mesenchimali. Se questi pattern di espressione genica in correlazione con la cella effettiva di origine del tumore è ancora indagato attivamente. Accumulare dati mostrano che la combinazione di mutazioni genetiche associate con GBM è predittivo per la sopravvivenza. Ad esempio, la perdita di eterozigoticità (LOH) di cromosomi 1p / 19q, mutazioni IDH1, PDGFRα amplificazioni, sono associati con GBM secondarie, proneurale modello di espressione e una migliore prognosi, mentre EGFR sovraespressione, Notch e Sonic hedgehog attivazione via, Nf1 e PTEN perdita e le mutazioni di p53 sono correlati con neurale, classica, o mesenchimali GBM primario e prognosi peggiore 16,17. L&#39;avvento di progetti di sequenziamento su larga scala e l&#39;accumulo di numerosi campioni dei pazienti disponibili per il test porta una ricchezza di nuove informazioni per quanto riguarda le mutazioni genetiche e percorsi implicati in GBM patogenesi e nella progressione e la possibilità della medicina individualizzata, dove le terapie possono essere specificamente adattati alle le anomalie genetiche del paziente. In ultima analisi, per valutare il valore predittivo di tali mutazioni e percorsi in modo sistematico, e per testare possibili trattamenti in ogni caso, richiede modelli animali di GBM con alterazioni genetiche pre-determinati. Transposon mediata integrazione di DNA genomico offre un approccio praticabile. The Sleeping Beauty sistema trasposoni, membro del / classe di mariner Tc1 di trasposoni, è stato &quot;svegliato&quot; (costruzione) in un proce multi-stepss di mutagenesi sito specifica di un gene trasposasi salmonidi, che divenne in sospeso più di 10 milioni di anni fa 18,19. In sostanza, i trasposoni DNA fiancheggiate da sequenze specifiche (ripetizioni invertite / ripetizioni diretti: IR / DR) possono essere integrate nel genoma in maniera &quot;taglia e incolla&quot;, mediante l&#39;attività della Bella Addormentata trasposasi. Il trasposasi riconosce le estremità dei siti IR, accise il trasposone e integra in modo casuale in un altro sito DNA tra le basi T e A, basi che vengono duplicati ad ogni estremità del trasposone durante trasposizione (Figura 1a). La Bella Addormentata trasposasi è composto da tre domini, un dominio di legame trasposone, una sequenza di localizzazione nucleare e un dominio catalitico. Quattro molecole trasposasi sono tenuti a portare le due estremità del trasposone insieme e consentire trasposizione, tuttavia, se sono presenti troppe molecole di trasposasi, possono dimerize e tetramerize di inibirela reazione di recepimento 20. Una reazione trasposizione efficiente richiede un rapporto ottimale di trasposasi di trasposoni. Il DNA codificante la trasposasi può essere spedito sullo stesso plasmide con il trasposone (in cis) o su un plasmide diverso (in trans). Per assicurare il rapporto ottimale tra la trasposasi e trasposoni, un promotore di attività adeguata può essere scelta per l&#39;espressione della trasposasi (per il modello &quot;cis&quot;) o il rapporto dei plasmidi nella soluzione iniettabile possono essere ottimizzati (per la modello di &quot;trans&quot;). The Sleeping Beauty transposon sistema può essere utilizzato con successo per la genomica funzionale, mutagenesi inserzionale, transgenesi e la terapia genica somatica 21. Essendo un costrutto sintetico riprogettato per una molecola funzionale da una variante salmonide dormiente, la Bella Addormentata trasposasi non si lega ad altri trasposoni in esseri umani o di altri mammiferi 20. Fin dalla sua scoperta, l&#39;ingegneria molecolare ha Enhanced l&#39;efficacia trasposizione del sistema di trasposoni SB attraverso variazioni nelle sequenze IR e l&#39;aggiunta di dinucleotidi TATA fiancheggia la trasposone, causando i trasposoni pT2. Questi trasposoni hanno ottimizzato vincolante della SB al sito IR e una maggiore efficacia di escissione. Il trasposasi SB anche subito un significativo miglioramento; la trasposasi utilizzato negli esperimenti qui presentati è la SB100X, una trasposasi iperattivo generato da una strategia di rimescolamento DNA seguito da uno screening genetico su larga scala in cellule di mammifero 22. In questo rapporto presentiamo un metodo rapido, versatile e riproducibile per indurre intrinseca GBM in topi con non-virale, l&#39;integrazione transposon mediata di plasmide DNA nelle cellule della zona sub-ventricolare di topi neonati 23. Vi presentiamo un modo semplice per creare trasposoni con nuovi geni suscettibili di integrazione genomica utilizzando la Bella Addormentata trasposasi e dimostrare come monitorare plasmide assorbimento eprogressione della malattia con bioluminescenza. Si caratterizzano anche caratteristiche istologiche e immunoistochimiche del GBM riprodotto con questo modello. Inoltre, vi presentiamo un metodo rapido per generare linee di cellule GBM primari di questi tumori. Il Modello di bellezza di sonno, in cui i tumori sono indotti da cellule originali dell&#39;animale, permette la valutazione funzionale del ruolo dei geni candidati GBM nell&#39;induzione e progressione dei tumori. Questo sistema è anche adatto per la sperimentazione di trattamenti GBM nuove, tra cui terapie immunitarie in topi immuno-competente, senza la necessità di interventi chirurgici infiammatorie invasive, che possono alterare il microambiente locale.

<table><tbody><tr><td>Standard da laboratorio di Stoelting con adattatori per ratti e topi</td><td>Stoelting</td><td>51670</td><td>Altre aziende producono telai simili, ognuno di loro con piccoli adattatori per mouse è adatto.</td></tr><tr><td>Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>Le iniezioni possono essere effettuate senza di esso, ma&nbsp; &nbsp; &nbsp; L'iniettore automatico consente una maggiore riproducibilità e praticità</td></tr><tr><td>10 &mu; l Siringa MICROLITER montata a mano serie 700</td><td>Hamilton</td><td>Modello 701</td><td>Questo modello di siringa eroga da 0,5 a 500 ul di soluzione in modo affidabile. Possono essere utilizzati anche altri syrnges (ad esempio 5 ul, modello 75)</td></tr><tr><td>ago ipodermico calibro 30 (1,25", 15o smusso)&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>S/O# 197462</td><td>Questo ago è ideale per perforare la pelle e il cranio di un topo neonatale senza la necessità di altre procedure invasive. Se diventa opaco (non entra facilmente nella pelle), deve essere sostituito.</td></tr><tr><td>in vivo-jetPEI</td><td>Polyplus Transfection</td><td>201-10G</td><td>Aliquot in piccoli volumi e mantenere a -20 oC&nbsp;</td></tr><tr><td>D-luciferina, sale di potassio</td><td>Goldbio.com</td><td>LuckK-1g</td><td>Altre fonti di lucifierasi di lucciola sono altrettanto adeguate</td></tr><tr><td>Soluzione di ematossilina, Harris Modified</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HHS128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62550-01</td><td>Per l'inclusione di cervelli per criosezione e immunoistovaglia</td></tr><tr><td>DMEM / F-12 avanzato, senza glutammina</td><td>Life Tecnologie</td><td>12634-010</td><td>Per la coltura delle neurosfere</td></tr><tr><td>B-27&uml; Integratore (50X), senza siero</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Integratore senza siero per la coltura delle neurosfere</td></tr><tr><td>Integratore N2 (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Integratore senza siero per la coltura delle neurosfere</td></tr><tr><td>Normocyn</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-1</td><td>Agente anti-micoplasma per la coltura delle neurosfere</td></tr><tr><td>EGF umano ricombinante</td><td>PEPROTECH</td><td>AF-100-15</td><td>Integratore di fattore di crescita per la cultura di&nbsp; neurosfere</td></tr><tr><td>FGF-basico umano ricombinante</td><td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td>Integratore di fattore di crescita per la coltura di neurosfere</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase&nbsp; Reagente per il distacco cellulare&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3003001</td><td>Per la dissociazione delle neurosfere</td></tr><tr><td>Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749510-0590</td><td>Per la dissociazione di tumori appena sezionati Falcon</td></tr><tr><td>Cell Strainers mesh size 70 um</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Per la generazione di sospensioni di singole cellule di neurosfere dissociate</td></tr><tr><td>Xileni Grado istologico</td><td>Fisher Scientific</td><td>Protocollo C8H10</td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina Harris Senza mercurio (acidificato)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245-678</td><td></td></tr><tr><td>Protocollo Eosyn Y Solution (intensificato)</td><td>Fisher Scientific</td><td>314-631</td><td></td></tr></tbody></table>

transposon mediated integrazione di dna plasmide nella zona subventricolare di topi neonati a generare modelli novel di glioblastoma

Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma

Esiste un urgente bisogno di testare il contributo di nuovi geni alla patogenesi e alla progressione dei glioblastomi umani (GBM), il tumore cerebrale primario più comune negli adulti con prognosi infausta. Nuove potenziali terapie stanno rapidamente emergendo dal banco e richiedono test sistematici in modelli sperimentali che riproducono fedelmente le caratteristiche salienti della malattia umana. Qui descriviamo in dettaglio un metodo per indurre nuovi modelli di GBM con l'integrazione mediata da trasposoni di DNA plasmidico in cellule della zona subventricolare di topi neonatali. Presentiamo un modo semplice per clonare nuovi trasposoni suscettibili di integrazione genomica utilizzando il sistema di trasposoni Sleeping Beauty e illustriamo come monitorare l'assorbimento dei plasmidi e la progressione della malattia utilizzando la bioluminescenza, l'istologia e l'immuno-istochimica. Descriviamo anche un metodo per creare nuove linee cellulari primarie di GBM. Idealmente, questo rapporto consentirà un'ulteriore diffusione del sistema di trasposoni della Bella Addormentata tra i ricercatori di tumori cerebrali, portando a una comprensione approfondita della patogenesi e della progressione del GBM e alla progettazione e alla sperimentazione tempestiva di terapie efficaci per i pazienti.

Per caratterizzare caratteristiche isto-patologici di glioblastomi SB-indotte, C57 / BL6 topi neonati sono stati iniettati in P1 con luciferasi plasmide codificante (pT2 / SB100x-Luc) in combinazione con plasmidi codifica trasposoni con DNA oncogeno, cioè, NRAS (Pt / CAGGS -NRASV12) e SV40 LGT (PT / CMVSV40-LGT) (Figura 3c) o un plasmide codificante una breve p53 tornante con PDGFβ e un reporter GFP (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) in combinazione con NRAS (Figura 3d). Gli animali so...

Qui descriviamo un protocollo efficiente e versatile per indurre, monitorare e analizzare nuovi glioblastomi (GBM) utilizzando DNA trasposone iniettato nei ventricoli di topi neonatali. Le cellule della zona subventricolare, che assorbono il plasmide, trasformano, proliferano e generano tumori con caratteristiche isto-patologiche del GBM umano.

Transposon Mediated Integrazione di DNA plasmide nella zona subventricolare di topi neonati a generare modelli Novel di Glioblastoma

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary ...

L'obiettivo di questa procedura è creare nuovi modelli per i glioblastomi e, in ultima analisi, sviluppare nuovi approcci terapeutici inducendo la formazione di glioblastomi che presentano specifiche mutazioni genetiche nei topi. Questo viene ottenuto innanzitutto creando plasmidi transposonici che codificano per i geni di interesse specifici. I passaggi successivi consistono nel preparare i plasmidi con un reagente di trasfezione e iniettarli nel ventricolo laterale di topi neonati.L'assorbimento durante la progressione tumorale viene quindi monitorato mediante luminescenza. Quando gli animali mostrano un aumento della massa tumorale, vengono sacrificati per analisi istologiche e immunoistochimiche. In questo modo, nuovi glioblastomi con alterazioni genetiche specifiche vengono indotti in ceppi selvatici o con modificazioni genetiche mirate.Questi tumori possono essere studiati in vivo oppure utilizzati in vitro per generare nuove linee cellulari suscettibili di analisi biochimiche e di esperimenti di citotossicit&agrave; mediante l'uso di agenti chemioterapici. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come ad esempio le iniezioni ortotopiche di linee cellulari di glioblastoma, &egrave; che i tumori vengono indotti dalla trasformazione maligna di cellule endogene a un animale immunocompetente, attraverso alterazioni genetiche scelte in modo molto specifico. Questo processo riproduce in modo pi&ugrave; fedele l'eziologia della malattia umana e ne ricapitola le caratteristiche istopatologiche salienti del GBM umano.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neuro-oncologia, ad esempio quali sono le mutazioni guida responsabili dell'induzione di diversi tipi di glioblastoma multiforme, classico, pre-neurale, neurale, negli adulti o nei tumori pediatrici. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del GPM, poiché nuovi chemioterapici, terapie radianti, immunoterapie o una loro combinazione possono essere testati relativamente in fretta in vivo o in vitro utilizzando questo modello.L'idea iniziale per questo metodo mi è venuta durante una discussione con il mio collega, il dottor John dell'Università del Minnesota, che aveva sviluppato un modello iniziale di tumore cerebrale utilizzando l'integrazione mediata dal trasposone Sleeping Beauty di oncogeni e di un inibitore dei geni soppressori tumorali nel DNA genomico dell'ospite. Ritenni che questa metodologia sarebbe stata molto efficace per studiare l'impatto di nuove mutazioni nella progressione tumorale e per contribuire allo sviluppo di terapie mirate contro il cancro cerebrale. Da tre a quattro settimane prima dell'esperimento, preparare una gabbia per l'accoppiamento con un topo maschio e una femmina, includendo un igloo di plastica colorato per arricchire l'ambiente e aumentare le probabilità di accoppiamento. Rimuovere il maschio una volta confermata la gravidanza e, 18 giorni dopo il giorno dell'accoppiamento, iniziare a monitorare la femmina per il parto.Assicurarsi che una madre surrogata sia disponibile intorno al momento del parto. Nel primo giorno postnatale, eseguire le iniezioni intraventricolari. Preparare la soluzione da iniettare prelevando innanzitutto 20 microlitri della miscela di DNA contenente il trasposone su plasmidi a una concentrazione finale di 0,5 microgrammi di DNA per microlitro.Aggiungere successivamente un’aliquota di 20 microlitri di soluzione di PEI alla soluzione di DNA e lasciare incubare a temperatura ambiente da 20 minuti a un’ora, dopo di che la miscela deve essere conservata sul ghiaccio. Per l’ago di iniezione, collegare una siringa da 10 microlitri a un ago ipodermico da 30 gauge, smussato a 12,5 gradi. Quindi collegare la siringa a una micropompa con iniezione automatica.Verificare il setup con 10 microlitri di acqua e assicurarsi di svuotare la siringa. A questo punto, raffreddare la piattaforma stereotassica per soggetti neonati utilizzando una miscela di ghiaccio secco e alcol. Quando la temperatura raggiunge un valore compreso tra 2 e 8 gradi Celsius, procedere con le iniezioni.Anestetizzare prima un cucciolo ponendolo sul ghiaccio per due minuti. Mentre il cucciolo è sul ghiaccio, caricare la siringa con la soluzione da iniettare. Una volta anestetizzato, trasferire il cucciolo sul telaio e immobilizzare la testa tra i supporti auricolari ricoperti di garza.Verificare che il lato dorsale del cranio sia orizzontale e parallelo alla superficie del telaio. Inoltre, le suture craniche devono essere chiaramente visibili. Se la testa del cucciolo non è immobilizzata in modo sufficientemente saldo, si sposterà durante l'iniezione.Se invece viene compresso troppo saldamente tra i bracci auricolari del telaio, il lambda non sarà visibile e la pressione all'interno del cranio forzerà la soluzione iniettata a fuoriuscire. Una volta che il cucciolo è saldamente trattenuto dal telaio, pulire la testa con etanolo al 70%, quindi abbassare l'ago e regolarne la posizione in modo che tocchi il lambda. Successivamente, sollevare l'ago e spostarlo lateralmente di 0,8 millimetri e di 1,5 millimetri in senso anteroposteriore. Quindi abbassarlo nuovamente fino a quando appena ammira la cute.Registrare le coordinate di questa posizione. Quindi abbassare l'ago di 1,5 millimetri attraverso la cute e il cranio fino alla corteccia, fino al ventricolo laterale. Iniettare 0,75 microlitri nell'arco di 90 secondi e attendere un minuto per permettere alla soluzione di diffondersi.Il prossimo cucciolo da iniettare può essere anestetizzato. Dopo aver rilevato il peso, sollevare lentamente l'ago, quindi trasferire il cucciolo in un'area di recupero sotto una lampada riscaldante. Il tempo che intercorre tra l'anestetizzazione e il riscaldamento deve essere inferiore a 10 minuti.Più velocemente si monitora la respirazione, meglio è; se necessario, massaggiare delicatamente gli arti per stimolare la respirazione. Una volta che il cucciolo si è riscaldato, ha un colore roseo e una respirazione regolare, restituirlo alla madre. Di solito ci vogliono da cinque a sette minuti a partire dall'iniezione.Se vengono inietti diversi cuccioli, tutti devono essere recuperati prima di restituirli alla madre. Se dopo mezz'ora non sono tutti pronti, restituirne metà alla madre e rimettere il resto successivamente, alla fine della procedura, monitorando la madre. Dopo aver restituito i cuccioli.Se non risponde ai cuccioli, aggiungere la madre surrogata alla gabbia. Da 24 a 72 ore dopo l'iniezione, monitorare l'assunzione del plasmide e trasferire tutti i cuccioli in piatti di coltura tessutale a sei pozzetti, un cucciolo per pozzetto. Successivamente, caricare una siringa da un millilitro con 30 milligrammi per millilitro di Lucifer in soluzione salina o PBS e applicare un ago ipodermico da 30 gauge.Iniettare 30 microlitri di soluzione per via sottocutanea tra le scapole di ogni cucciolo; per evitare di ferire il cucciolo, iniettare la soluzione al di sotto di una piccola piega cutanea. Trasferire immediatamente i cuccioli in un sistema di imaging bioluminescente in vivo. Impostare una sequenza per acquisire quattro immagini consecutive a intervalli di un minuto, con esposizione automatica, ampia apertura e un diaframma pari a uno. In seguito.Dopo circa 17 giorni, gli animali potrebbero iniziare a sviluppare tumori macroscopici rilevabili mediante bioluminescenza e istologia. Potrebbero essere necessarie fino a sei settimane per monitorare i tumori. Iniettare 100 microlitri di soluzione di luciferina per via intraperitoneale con un ago da 26 gauge.Dopo tre minuti, anestetizzare gli animali in una camera per anestesia con ossigeno e fluoruro di isoflurano, quindi posizionare gli animali nella camera di imaging dotata di coni per disperdere il fluoruro di isoflurano. Acquisire una serie di sei immagini a intervalli di due minuti con tempo di esposizione automatico, binning medio e un'apertura del diaframma (F-stop) aperta pari a uno. L'area di interesse è tipicamente un'ovale sulla testa; misurare l'intensità della luminescenza in ciascun animale utilizzando le stesse impostazioni per caratterizzare le caratteristiche istopatologiche dei glioblastomi indotti da SB.Neonati di topo neri C57 sono stati iniettati al tempo P1 con un plasmide e luciferasi rivestita in combinazione con plasmidi NRA S e SV40 grande T Inod trasposoni con DNA oncogenico. In alternativa, è stato iniettato un plasmide che codifica per un corto hairpin P53 con PDGF beta e un reporter GFP, in combinazione con NRAS. È risultata evidente una necrosi pseudopalissadica, così come una distribuzione perivascolare e diffusa nel cervello.I glioblastomi parenchimali sono stati inoltre monitorati mediante bioluminescenza. Gli animali di solito muoiono a causa del carico tumorale. Quando l'intensità della luminescenza raggiunge un valore compreso tra 10 alla settima e 10 alla nona unità calibrate.La sopravvivenza mediana degli animali dipendeva prevedibilmente dalle combinazioni di trasposoni oncogeni iniettati nel cervello neonatale. I tumori più aggressivi sono stati indotti con NRS e l'antigene T grande del SV40; i tumori de novo sono stati caratterizzati dall'espressione di molecole caratteristiche. I tumori nascenti indotti a esprimere GFP mediante SHP53 e nras esprimevano il marcatore delle cellule staminali neurali nestina e alcuni esprimevano anche la proteina acida fibrillare gliale.Dopo 56 giorni, è stato riscontrato un tumore circondato da numerose astrociti positivi per GFAP. Queste cellule tumorali esprimevano nein ma non GFAP. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre la formazione di glioblastomi, portatori di specifiche mutazioni genetiche, mediante iniezioni intraventricolari in topi neonati, e di come monitorare l'evoluzione della malattia mediante bioluminescenza.Nell'articolo troverete i dettagli su come clonare facilmente un nuovo plasmide trans pro, codificante geni di interesse, e anche su come monitorare i tumori e analizzarli mediante istologia e immunohistochemia. Inoltre, troverete un metodo dettagliato su come generare nuove linee cellulari di glioblastoma da animali con tumori ingegnerizzati geneticamente. Speriamo che questo articolo possa contribuire ad accelerare la scoperta di nuove terapie per questa devastante malattia umana.

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Transposon Mediated Integrazione di DNA plasmide nella zona subventricolare di topi neonati a generare modelli Novel di Glioblastoma (Video) | JoVE Journal

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