Name: Transposon Mediated Integrazione di DNA plasmide nella zona subventricolare di topi neonati a generare modelli Novel di Glioblastoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Scopri come indurre glioblastomi in topi neonati mediante iniezione intraventricolare di plasmidi transposon. Questo protocollo consente di monitorare la progressione tumorale con bioluminescenza e analizzare le alterazioni genetiche specifiche.

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Ringraziamo il Dr. John Ohlfest e la Dr. Stacey Decker13 per il generoso dono dei plasmidi e per la formazione fornita per padroneggiare questo metodo. Ringraziamo Marta Dzaman per l'aiuto nella standardizzazione della procedura di colorazione con ematossilina-eosina delle sezioni incluse in paraffina. Ringraziamo anche Molly Dahlgren per aver esaminato attentamente questo manoscritto e per aver fornito utili suggerimenti. Questo lavoro è supportato da sovvenzioni NIH/NINDS a MGC e PRL, da sovvenzioni della Leah's Happy Hearts Foundation a MCG e PRL. Premio per giovani investigatori della Alex's Lemonade Foundation e la borsa di studio della St. Baldrick's Foundation a CK.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo articolo, abbiamo dettaglio un metodo versatile e riproducibile per la generazione di nuovi modelli di GBM utilizzando integrazione SB transposase- mediata oncogeno DNA plasmide nelle cellule che circondano la zona subventricolare di topi neonati. Vi presentiamo un protocollo per generare plasmidi trasposoni nuovi geni di interesse, illustreremo come monitorare la progressione dei tumori negli animali vivi, e come caratterizzare caratteristiche isto-patologico e immunoistochimiche di questi tumori. <p clas...

Glioblastoma multiforme (GBM) è il (60%) tumore cerebrale primario più comune negli adulti, con una sopravvivenza mediana di 15-21 mesi, quando trattati con la chirurgia, la radioterapia e la chemioterapia 1. Nuove terapie per GBM sono indispensabili. Terapie sperimentali richiedono test su modelli animali che riproducono in maniera adeguata le caratteristiche salienti della malattia umana. Strategie per indurre GBM nei roditori sono mutagenesi chimica con agenti alchilanti, linea germinale o alterazioni genetiche somatiche, o il trapianto utilizzando linee cellulari di glioma 2. I modelli più utilizzati impiegano l&#39;impianto di linee cellulari di glioma, sia ortotopicamente, nel cervello o sottocutanea utilizzando cellule singeniche negli animali con genotipo identico; o xenogeniche, linee più comunemente umani cellule GBM, impiantati in topi immunocompromessi 3. Xenotrapianti offrono molti vantaggi per lo studio dei tumori intracranici: comodità di riproducibilità, standatassi di crescita rdized, tempo di morte e di tumore localizzazione. Tuttavia, questi modelli hanno dei limiti a causa l&#39;approccio chirurgico artificiale, invasivo utilizzato per implantologia e limitata capacità di riprodurre accuratamente istologica tratti caratteristici di GBM umano (grado IV): pseudo-pallisading necrosi, atipie nucleari, invasione diffusa, la proliferazione di micro-vascolare e la formazione di anomalie vascolari glomeruloid 4-7. Induzione di GBM alterando il genoma delle cellule somatiche con il DNA oncogeno, sia con vettori virali 8-12, o con transposon mediata integrazione 13, riproduce più da vicino l&#39;eziologia delle malattie umane e ricapitola le caratteristiche isto-patologici di GBM umana. Storicamente, i tumori del SNC sono stati classificati in base alla cella percepita di origine, che è stato osservato, sarebbe un fattore predittivo per la sopravvivenza 14. GBM sono classificati in primaria e secondaria. Emergenti prove today punti per la natura altamente eterogenea di glioblastoma primario 15. GBM secondaria (15%), il risultato della trasformazione maligna di astrocitoma di grado basso (grado I) e astrocitoma anaplasic (grado II), sono associati con insorgenza più precoce della malattia, una migliore prognosi e un modello &quot;proneurale&quot; di espressione genica , considerando primaria GBM (85%) mostrano un esordio tardivo, cattiva prognosi e gliali (classica), neurale o pattern di espressione mesenchimali. Se questi pattern di espressione genica in correlazione con la cella effettiva di origine del tumore è ancora indagato attivamente. Accumulare dati mostrano che la combinazione di mutazioni genetiche associate con GBM è predittivo per la sopravvivenza. Ad esempio, la perdita di eterozigoticità (LOH) di cromosomi 1p / 19q, mutazioni IDH1, PDGFRα amplificazioni, sono associati con GBM secondarie, proneurale modello di espressione e una migliore prognosi, mentre EGFR sovraespressione, Notch e Sonic hedgehog attivazione via, Nf1 e PTEN perdita e le mutazioni di p53 sono correlati con neurale, classica, o mesenchimali GBM primario e prognosi peggiore 16,17. L&#39;avvento di progetti di sequenziamento su larga scala e l&#39;accumulo di numerosi campioni dei pazienti disponibili per il test porta una ricchezza di nuove informazioni per quanto riguarda le mutazioni genetiche e percorsi implicati in GBM patogenesi e nella progressione e la possibilità della medicina individualizzata, dove le terapie possono essere specificamente adattati alle le anomalie genetiche del paziente. In ultima analisi, per valutare il valore predittivo di tali mutazioni e percorsi in modo sistematico, e per testare possibili trattamenti in ogni caso, richiede modelli animali di GBM con alterazioni genetiche pre-determinati. Transposon mediata integrazione di DNA genomico offre un approccio praticabile. The Sleeping Beauty sistema trasposoni, membro del / classe di mariner Tc1 di trasposoni, è stato &quot;svegliato&quot; (costruzione) in un proce multi-stepss di mutagenesi sito specifica di un gene trasposasi salmonidi, che divenne in sospeso più di 10 milioni di anni fa 18,19. In sostanza, i trasposoni DNA fiancheggiate da sequenze specifiche (ripetizioni invertite / ripetizioni diretti: IR / DR) possono essere integrate nel genoma in maniera &quot;taglia e incolla&quot;, mediante l&#39;attività della Bella Addormentata trasposasi. Il trasposasi riconosce le estremità dei siti IR, accise il trasposone e integra in modo casuale in un altro sito DNA tra le basi T e A, basi che vengono duplicati ad ogni estremità del trasposone durante trasposizione (Figura 1a). La Bella Addormentata trasposasi è composto da tre domini, un dominio di legame trasposone, una sequenza di localizzazione nucleare e un dominio catalitico. Quattro molecole trasposasi sono tenuti a portare le due estremità del trasposone insieme e consentire trasposizione, tuttavia, se sono presenti troppe molecole di trasposasi, possono dimerize e tetramerize di inibirela reazione di recepimento 20. Una reazione trasposizione efficiente richiede un rapporto ottimale di trasposasi di trasposoni. Il DNA codificante la trasposasi può essere spedito sullo stesso plasmide con il trasposone (in cis) o su un plasmide diverso (in trans). Per assicurare il rapporto ottimale tra la trasposasi e trasposoni, un promotore di attività adeguata può essere scelta per l&#39;espressione della trasposasi (per il modello &quot;cis&quot;) o il rapporto dei plasmidi nella soluzione iniettabile possono essere ottimizzati (per la modello di &quot;trans&quot;). The Sleeping Beauty transposon sistema può essere utilizzato con successo per la genomica funzionale, mutagenesi inserzionale, transgenesi e la terapia genica somatica 21. Essendo un costrutto sintetico riprogettato per una molecola funzionale da una variante salmonide dormiente, la Bella Addormentata trasposasi non si lega ad altri trasposoni in esseri umani o di altri mammiferi 20. Fin dalla sua scoperta, l&#39;ingegneria molecolare ha Enhanced l&#39;efficacia trasposizione del sistema di trasposoni SB attraverso variazioni nelle sequenze IR e l&#39;aggiunta di dinucleotidi TATA fiancheggia la trasposone, causando i trasposoni pT2. Questi trasposoni hanno ottimizzato vincolante della SB al sito IR e una maggiore efficacia di escissione. Il trasposasi SB anche subito un significativo miglioramento; la trasposasi utilizzato negli esperimenti qui presentati è la SB100X, una trasposasi iperattivo generato da una strategia di rimescolamento DNA seguito da uno screening genetico su larga scala in cellule di mammifero 22. In questo rapporto presentiamo un metodo rapido, versatile e riproducibile per indurre intrinseca GBM in topi con non-virale, l&#39;integrazione transposon mediata di plasmide DNA nelle cellule della zona sub-ventricolare di topi neonati 23. Vi presentiamo un modo semplice per creare trasposoni con nuovi geni suscettibili di integrazione genomica utilizzando la Bella Addormentata trasposasi e dimostrare come monitorare plasmide assorbimento eprogressione della malattia con bioluminescenza. Si caratterizzano anche caratteristiche istologiche e immunoistochimiche del GBM riprodotto con questo modello. Inoltre, vi presentiamo un metodo rapido per generare linee di cellule GBM primari di questi tumori. Il Modello di bellezza di sonno, in cui i tumori sono indotti da cellule originali dell&#39;animale, permette la valutazione funzionale del ruolo dei geni candidati GBM nell&#39;induzione e progressione dei tumori. Questo sistema è anche adatto per la sperimentazione di trattamenti GBM nuove, tra cui terapie immunitarie in topi immuno-competente, senza la necessità di interventi chirurgici infiammatorie invasive, che possono alterare il microambiente locale.

<table><tbody><tr><td>Standard da laboratorio di Stoelting con adattatori per ratti e topi</td><td>Stoelting</td><td>51670</td><td>Altre aziende producono telai simili, ognuno di loro con piccoli adattatori per mouse è adatto.</td></tr><tr><td>Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>Le iniezioni possono essere effettuate senza di esso, ma&nbsp; &nbsp; &nbsp; L'iniettore automatico consente una maggiore riproducibilità e praticità</td></tr><tr><td>10 &mu; l Siringa MICROLITER montata a mano serie 700</td><td>Hamilton</td><td>Modello 701</td><td>Questo modello di siringa eroga da 0,5 a 500 ul di soluzione in modo affidabile. Possono essere utilizzati anche altri syrnges (ad esempio 5 ul, modello 75)</td></tr><tr><td>ago ipodermico calibro 30 (1,25", 15o smusso)&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>S/O# 197462</td><td>Questo ago è ideale per perforare la pelle e il cranio di un topo neonatale senza la necessità di altre procedure invasive. Se diventa opaco (non entra facilmente nella pelle), deve essere sostituito.</td></tr><tr><td>in vivo-jetPEI</td><td>Polyplus Transfection</td><td>201-10G</td><td>Aliquot in piccoli volumi e mantenere a -20 oC&nbsp;</td></tr><tr><td>D-luciferina, sale di potassio</td><td>Goldbio.com</td><td>LuckK-1g</td><td>Altre fonti di lucifierasi di lucciola sono altrettanto adeguate</td></tr><tr><td>Soluzione di ematossilina, Harris Modified</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HHS128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62550-01</td><td>Per l'inclusione di cervelli per criosezione e immunoistovaglia</td></tr><tr><td>DMEM / F-12 avanzato, senza glutammina</td><td>Life Tecnologie</td><td>12634-010</td><td>Per la coltura delle neurosfere</td></tr><tr><td>B-27&uml; Integratore (50X), senza siero</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Integratore senza siero per la coltura delle neurosfere</td></tr><tr><td>Integratore N2 (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Integratore senza siero per la coltura delle neurosfere</td></tr><tr><td>Normocyn</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-1</td><td>Agente anti-micoplasma per la coltura delle neurosfere</td></tr><tr><td>EGF umano ricombinante</td><td>PEPROTECH</td><td>AF-100-15</td><td>Integratore di fattore di crescita per la cultura di&nbsp; neurosfere</td></tr><tr><td>FGF-basico umano ricombinante</td><td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td>Integratore di fattore di crescita per la coltura di neurosfere</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase&nbsp; Reagente per il distacco cellulare&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3003001</td><td>Per la dissociazione delle neurosfere</td></tr><tr><td>Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749510-0590</td><td>Per la dissociazione di tumori appena sezionati Falcon</td></tr><tr><td>Cell Strainers mesh size 70 um</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Per la generazione di sospensioni di singole cellule di neurosfere dissociate</td></tr><tr><td>Xileni Grado istologico</td><td>Fisher Scientific</td><td>Protocollo C8H10</td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina Harris Senza mercurio (acidificato)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245-678</td><td></td></tr><tr><td>Protocollo Eosyn Y Solution (intensificato)</td><td>Fisher Scientific</td><td>314-631</td><td></td></tr></tbody></table>

transposon mediated integrazione di dna plasmide nella zona subventricolare di topi neonati a generare modelli novel di glioblastoma

Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma

Esiste un urgente bisogno di testare il contributo di nuovi geni alla patogenesi e alla progressione dei glioblastomi umani (GBM), il tumore cerebrale primario più comune negli adulti con prognosi infausta. Nuove potenziali terapie stanno rapidamente emergendo dal banco e richiedono test sistematici in modelli sperimentali che riproducono fedelmente le caratteristiche salienti della malattia umana. Qui descriviamo in dettaglio un metodo per indurre nuovi modelli di GBM con l'integrazione mediata da trasposoni di DNA plasmidico in cellule della zona subventricolare di topi neonatali. Presentiamo un modo semplice per clonare nuovi trasposoni suscettibili di integrazione genomica utilizzando il sistema di trasposoni Sleeping Beauty e illustriamo come monitorare l'assorbimento dei plasmidi e la progressione della malattia utilizzando la bioluminescenza, l'istologia e l'immuno-istochimica. Descriviamo anche un metodo per creare nuove linee cellulari primarie di GBM. Idealmente, questo rapporto consentirà un'ulteriore diffusione del sistema di trasposoni della Bella Addormentata tra i ricercatori di tumori cerebrali, portando a una comprensione approfondita della patogenesi e della progressione del GBM e alla progettazione e alla sperimentazione tempestiva di terapie efficaci per i pazienti.

Per caratterizzare caratteristiche isto-patologici di glioblastomi SB-indotte, C57 / BL6 topi neonati sono stati iniettati in P1 con luciferasi plasmide codificante (pT2 / SB100x-Luc) in combinazione con plasmidi codifica trasposoni con DNA oncogeno, cioè, NRAS (Pt / CAGGS -NRASV12) e SV40 LGT (PT / CMVSV40-LGT) (Figura 3c) o un plasmide codificante una breve p53 tornante con PDGFβ e un reporter GFP (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) in combinazione con NRAS (Figura 3d). Gli animali so...

Qui descriviamo un protocollo efficiente e versatile per indurre, monitorare e analizzare nuovi glioblastomi (GBM) utilizzando DNA trasposone iniettato nei ventricoli di topi neonatali. Le cellule della zona subventricolare, che assorbono il plasmide, trasformano, proliferano e generano tumori con caratteristiche isto-patologiche del GBM umano.

Transposon Mediated Integrazione di DNA plasmide nella zona subventricolare di topi neonati a generare modelli Novel di Glioblastoma

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary ...

L'obiettivo di questa procedura è creare nuovi modelli per i glioblastomi e, in ultima analisi, sviluppare nuovi approcci terapeutici inducendo la formazione di glioblastomi che presentano specifiche mutazioni genetiche nei topi. Questo viene ottenuto innanzitutto creando plasmidi transposonici che codificano per i geni di interesse specifici. I passaggi successivi consistono nel preparare i plasmidi con un reagente di trasfezione e iniettarli nel ventricolo laterale di topi neonati.L'assorbimento durante la progressione tumorale viene quindi monitorato mediante luminescenza. Quando gli animali mostrano un aumento della massa tumorale, vengono sacrificati per analisi istologiche e immunoistochimiche. In questo modo, nuovi glioblastomi con alterazioni genetiche specifiche vengono indotti in ceppi selvatici o con modificazioni genetiche mirate.Questi tumori possono essere studiati in vivo oppure utilizzati in vitro per generare nuove linee cellulari suscettibili di analisi biochimiche e di esperimenti di citotossicit&agrave; mediante l'uso di agenti chemioterapici. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come ad esempio le iniezioni ortotopiche di linee cellulari

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Questo video descrive una tecnica efficace per indurre glioblastomi (GBM) utilizzando il DNA trasposone iniettato nei ventricoli di topi neonati. Le cellule della zona subventricolare, che assorbono il plasmide, trasformano, proliferano e generano tumori con caratteristiche istopatologiche del GBM umano.

Induzione del glioblastoma mediante trasposizione mediata da SB: una tecnica per generare un nuovo modello murino utilizzando l'integrazione mediata da trasposoni del plasmide SB nel cervello di topo neonatale

Migrazione neuroblasti è un evento fondamentale nella neurogenesi postnatale. Descriviamo un protocollo per l'etichettatura efficiente dei neuroblasti di elettroporazione in vivo postnatale e la successiva visualizzazione della loro migrazione utilizzando time-lapse imaging di fette di cervello acuto. Includiamo una descrizione per l'analisi quantitativa delle dinamiche neuroblasti di monitoraggio video.

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

Abbiamo stabilito un modello glioblastoma ortotopico corticale nei topi per intravital microscopia a due fotoni che ricapitola i vincoli biofisici normalmente in gioco durante la crescita del tumore. Una finestra di vetro cronica sostituzione del cranio sopra il tumore consente il seguito della progressione tumorale nel tempo mediante microscopia a due fotoni.

Un ortotopico Glioblastoma modello di mouse mantenimento di vincoli Cervello parenchimale fisiche e adatto per intravitale due fotoni Microscopia

Questa procedura mostra come indirizzare gli interneuroni nel prosencefalo del topo in via di sviluppo per mezzo dell'elettroporazione in utero. Questa tecnica è stata particolarmente efficace per ottenere l'espressione genica selettiva nei sottotipi di interneuroni destinati agli strati superficiali della corteccia.

Sottotipo-selettivo elettroporazione della corticale interneuroni

Qui dimostriamo una tecnica per la trasduzione neuronale diffusa mediante iniezione intraventricolare di virus adeno-associato nel cervello del topo neonatale.  Questo metodo fornisce un modo rapido e semplice per ottenere l'espressione permanente dei transgeni veicolati viralmente.

Intracerebroventricular Iniezione virale del cervello neonatale mouse per persistente e diffusa trasduzione neuronale

Presentato ecco un metodo semplice per l'isolamento e il flusso citometria di cellule mononucleate del sangue periferico gliomi infiltranti che produce dati quantitativi dipendenti dal tempo sul numero e l'attivazione dello stato di cellule immunitarie che entrano presto microambiente tumorale al cervello.

Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule

Cella-autonome funzioni dei geni nel cervello possono essere studiate inducendo perdita o guadagno di funzione in popolazioni sparse delle cellule. Qui, descriviamo in utero elettroporazione per consegnare la Cre ricombinasi nelle popolazioni sparse di sviluppare neuroni corticali con floxed geni per causare la perdita di funzione in vivo.

Induzione della ricombinazione di Cre-lox nella corteccia cerebrale del Mouse attraverso elettroporazione In Utero

La microdissezione laser (LMD) è una tecnica sensibile e altamente riproducibile che può essere utilizzata per scoprire percorsi che mediano l'eterogeneità e l'invasione del glioma. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per isolare le aree discrete dal tessuto glioma utilizzando LMD laser seguito da analisi trascrittomica.

Microdissezione di cattura laser delle sottoregioni del Glioma per la caratterizzazione spaziale e molecolare dell'eterogeneità intratutuale, dell'Oncoflusso e dell'invasione

L'utilizzo di un modello tumorale autoctono immunocompetente guidato da mutazioni comuni dei pazienti per i test preclinici è fondamentale per i test immunoterapici. Questo protocollo descrive un metodo per generare modelli murini di tumore cerebrale utilizzando la somministrazione basata sull'elettroporazione di DNA plasmidico che rappresenta le mutazioni comuni dei pazienti, fornendo così un modello murino accurato, riproducibile e coerente.

Modellazione di tumori cerebrali in vivo utilizzando la somministrazione basata sull'elettroporazione di DNA plasmidico che rappresenta le firme di mutazione del paziente

Sepsi si riferisce ad una sindrome da risposta infiammatoria sistemica risultante da una infezione microbica, e può essere simulato da una tecnica chirurgica denominata legatura cecale e puntura (CLP). Qui si descrive un metodo per utilizzare CLP-indotta modello animale per lo screening erbe medicinali per gli agenti terapeutici.

Uso di un modello animale di sepsi per valutare nuove terapie a base di erbe

Scopri come indurre glioblastomi in topi neonati mediante iniezione intraventricolare di plasmidi transposon. Questo protocollo consente di monitorare la progressione tumorale con bioluminescenza e analizzare le alterazioni genetiche specifiche.

Transposon Mediated Integrazione di DNA plasmide nella zona subventricolare di topi neonati a generare modelli Novel di Glioblastoma (Video) | JoVE Journal

Transposon Mediated Integrazione di DNA plasmide nella zona subventricolare di topi neonati a generare modelli Novel di Glioblastoma

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