Transposon Mediated Integrazione di DNA plasmide nella zona subventricolare di topi neonati a generare modelli Novel di Glioblastoma

L'obiettivo di questa procedura è quello di creare nuovi modelli per i glioblastomi e, infine, sviluppare nuovi approcci terapeutici inducendo la formazione di glioblastomi che ospitano specifiche mutazioni genetiche nei topi. Ciò si ottiene creando prima plasmidi trasposoni, codificando i geni specifici di interesse. I prossimi passi sono preparare i plasmidi con un reagente di trasfezione e iniettarli nel ventricolo laterale dei topi neonati.

L'assorbimento della progressione tumorale viene quindi monitorato mediante luminescenza. Quando gli animali diventano più abbondanti, vengono sacrificati per l'analisi istologica e immunoistochimica. Pertanto, nuovi glioblastomi con specifiche alterazioni genetiche sono indotti in background genetici wild type o mirati.

Questi tumori possono essere studiati in vivo o utilizzati in vitro per generare nuove linee cellulari suscettibili di analisi biochimiche ed esperimenti di citotossicità utilizzando agenti chemioterapici. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come ad esempio le iniezioni ortotopiche di una linea cellulare di glioblastoma, è che i tumori sono indotti dalla trasformazione maligna di cellule endogene in un animale immunocompetente utilizzando alterazioni genetiche scelte in modo molto specifico. Questo processo riproduce più fedelmente l'eziologia della malattia umana e ricapitola le caratteristiche istopatologiche salienti del GBM umano.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neuro-oncologia, come ad esempio quali sono le mutazioni driver responsabili dell'induzione di diversi tipi di glioblastoma multiforme, classico, preneurale, neurale negli adulti o nei tumori pediatrici. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della GPM a partire dai nuovi chemioterapici. Le radioterapie immunitarie o una loro combinazione possono essere testate in modo relativamente rapido in vivo o in vitro utilizzando questo modello.

Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando ho discusso con il mio collega, il Dr.John dell'Università del Minnesota, che aveva sviluppato il modello iniziale di tumore cerebrale utilizzando la bella addormentata nel sonno traspone l'integrazione mediata di oncogeni, un inibitore dei geni oncosoppressori nel DNA genomico dell'ospite. Ho pensato che questa metodologia sarebbe stata molto potente per studiare l'impatto delle nuove mutazioni nella progressione del tumore e aiutare nello sviluppo di terapie mirate per il cancro al cervello Tre o quattro settimane prima dell'esperimento, allestire una gabbia per l'allevamento di topi con un maschio e una femmina, includere un igloo di plastica colorata per arricchire l'ambiente e aumentare le possibilità di accoppiamento. Rimuovi il maschio una volta che la gravidanza è stata confermata e, 18 giorni dopo il giorno dell'accoppiamento, inizia a monitorare la femmina per il parto.

Assicurati che una madre surrogata sia disponibile al momento del parto. Il primo giorno postnatale, eseguire le iniezioni intraventricolari. Preparare la soluzione iniettabile con il primo Ali, citando 20 microlitri della miscela di DNA contenente la trasposizione sui plasmidi ad una concentrazione finale di 0,5 microgrammi di DNA per microlitro.

Successivamente, a un'aliquota di 20 microlitri di soluzione di PEI, alla soluzione di DNA e lasciarli incubare a temperatura ambiente per 20 minuti a un'ora, dopodiché la miscela deve essere conservata in ghiaccio. Per l'ago da iniezione, collegare una siringa da 10 microlitri a un ago ipodermico da 30 gauge, smussato a 12,5 gradi. Quindi collegare la siringa a una micropompa con iniezione automatica.

Testare la configurazione con 10 microlitri di acqua e assicurarsi di svuotare la siringa. Ora, rinfresca lo stadio stereotassico neonatale con un impasto di ghiaccio secco e alcol. Quando si è raffreddato tra i due e gli otto gradi Celsius, procedere con le iniezioni.

Per prima cosa anestetizza un cucciolo mettendolo sul ghiaccio per due minuti. Mentre il cucciolo è in ghiaccio, caricare la siringa con la soluzione iniettabile. Una volta anestetizzato, trasferisci il cucciolo sul telaio e immobilizza la testa tra le barre auricolari ricoperte di garza.

Verificare che il lato dorsale del cranio sia orizzontale e parallelo alla superficie della montatura. Inoltre, le suture craniche dovrebbero essere chiaramente visibili. Se la testa del cucciolo non è immobilizzata abbastanza saldamente, si muoverà durante l'iniezione.

Mentre se viene schiacciato troppo saldamente tra le barre auricolari del telaio, la lambda non sarà visibile e la pressione all'interno della testa costringerà la soluzione iniettata a fuoriuscire Con il cucciolo afferrato saldamente dal telaio, pulire la testa con etanolo al 70%, quindi abbassare l'ago e regolare la sua posizione in modo che tocchi la lambda. Quindi, solleva l'ago e spostalo di 0,8 millimetri lateralmente e 1,5 millimetri di conteggio. Quindi abbassalo di nuovo fino a quando non increspa leggermente la pelle.

Registra le coordinate di questa posizione. Quindi abbassare l'ago, 1,5 millimetri attraverso la pelle e il cranio e nella corteccia al ventricolo laterale. Iniettare 0,75 microlitri in 90 secondi e attendere un minuto per far disperdere la soluzione durante l'attesa.

Il prossimo cucciolo da iniettare può essere anestetizzato. Dopo il peso, solleva lentamente l'ago, quindi trasferisci il cucciolo in un luogo di recupero sotto una lampada riscaldante. Il tempo che intercorre tra l'anestesia e il riscaldamento deve essere inferiore a 10 minuti.

Più veloce è, meglio è monitorare la sua respirazione e, se necessario, strofinare delicatamente gli arti per stimolare la respirazione. Una volta che il cucciolo si è riscaldato, ha un colore rosato e un respiro costante, restituiscilo alla madre. Questo di solito richiede da cinque a sette minuti dall'iniezione.

Se vengono iniettati più cuccioli, dovrebbero essere tutti recuperati prima di restituirli alla madre. Se dopo mezz'ora tutti i cuccioli non sono pronti, restituiscigliene metà e poi restituisci il resto più tardi alla fine della procedura, monitora la madre. Dopo aver restituito i cuccioli.

Se non risponde ai cuccioli, aggiungere la madre surrogata alla gabbia. Da 24 a 72 ore dopo l'iniezione, monitorare l'assorbimento del plasmide e trasferire tutti i cuccioli in piastre di coltura tissutale a sei pozzetti, un cucciolo per pozzetto. Quindi caricare una siringa da un millilitro con 30 milligrammi per millilitro di Lucifer in soluzione salina o PBS e collegare un ago ipodermico calibro 30.

Iniettare 30 microlitri di soluzione per via sottocutanea tra le scapole di ciascun cucciolo per evitare di ferire il cucciolo, iniettare la soluzione sotto una piccola piega di pelle. Trasferire immediatamente i cuccioli in un sistema di imaging a bioluminescenza in vivo. Imposta una sequenza per acquisire quattro immagini consecutive a intervalli di un minuto con esposizione automatica, ampio benning e un'apertura di uno. Dopo.

Dopo circa 17 giorni, gli animali potrebbero iniziare a formare tumori macroscopici rilevabili mediante bioluminescenza e istologia. Potrebbero anche essere necessarie fino a sei settimane per monitorare i tumori. Iniettare 100 microlitri di soluzione luciferina intraperitoneale con un ago calibro 26.

Dopo tre minuti, anestetizzare gli animali in una camera di anestesia con ossigeno al fluoro ISO e posizionare gli animali nella camera di imaging dotata di coni per disperdere il fluoro ISO. Acquisisci una serie di sei immagini a intervalli di due minuti con un tempo di esposizione automatico, binning medio e un F-stop ad apertura aperta di uno. La regione di interesse è tipicamente un ovale sopra la testa, misurato l'intensità della luminescenza in ciascun animale utilizzando le stesse impostazioni per caratterizzare le caratteristiche istopatologiche dei glioblastomi indotti da SB.

C 57 neri sei topi neonatali sono stati iniettati a P uno con un plasmide e luciferasi di rivestimento in combinazione con NRA S e SV 40 grandi plasmidi T trasposoni Inod con DNA oncogenico. In alternativa, un plasmide codificante una forcina corta P 53 con PDGF beta e un reporter GFP sono stati iniettati in combinazione con NRAS. La necrosi pseudo palis era evidente, perivascolare e diffusa nel cervello.

Anche i glioblastomi del parenchima sono stati monitorati con la bioluminescenza. Gli animali di solito soccombono al carico tumorale. Quando la luminescenza ha raggiunto un'intensità di 10 alla settima a 10 alla nona unità calibrate.

La sopravvivenza mediana degli animali era prevedibilmente dipendente dalle combinazioni di trasposoni oncogeni iniettati nel cervello neonatale. I tumori più aggressivi sono stati indotti con NRS e SV 40 I tumori de novo con l'antigene T grande sono stati caratterizzati dalla loro espressione di molecole caratteristiche. I tumori nascenti creati per esprimere GFP indotta con SHP 53 e nras esprimevano il marcatore delle cellule staminali neurali neston, e alcuni esprimevano anche la proteina acida fibrillare glio.

Dopo 56 giorni, è stato trovato un tumore circondato da numerosi astrociti positivi alla GFAP. Queste cellule tumorali esprimevano neina ma non GFAP. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre la formazione di glioblastomi, ospitando specifiche mutazioni genetiche attraverso iniezioni intraventricolari in topi neonatali e come monitorare la progressione della malattia con la bioluminescenza.

Nell'articolo troverai dettagli su come clonare facilmente nuovi plasmidi trans pro, codificando geni di interesse, e anche su come monitorare i tumori e analizzarli con istologia e immunoistochimica. Inoltre, troverai un metodo dettagliato su come generare nuove linee cellulari di glioblastoma da animali con tumori geneticamente modificati. Speriamo che questo articolo contribuisca ad accelerare la scoperta di nuove terapie per questa devastante malattia umana.