Name: Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Scopri un saggio ad alto rendimento per valutare la tossicità germinale chimica nel nematode Caenorhabditis elegans utilizzando reporter fluorescenti. Questo metodo consente di analizzare rapidamente l'impatto di composti chimici sulla funzione germinale in un modello animale completo.

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Gli autori desiderano ringraziare le seguenti fonti di finanziamento: NIH ES020353 e il premio Colgate-Palmolive Alternative Research Grant per aver reso possibile questo lavoro.

1. Preparazione di batteri alimentazione NOTA: Questa sezione descrive la preparazione di batteri alimentazione (ceppo di E. coli OP50). <ol><li> Isolare una singola colonia di E. coli ceppo OP50 da un brodo lisogenia (LB) piastra di agar e asetticamente inoculare in 300 ml di brodo LB autoclavato. </li><li> Lasciare la coltura inoculata a crescere durante la notte in un agitatore a 200 rpm e 37 ° C, fino a saturazione. </li><li> Trasferire il OP50 in 6 50 ml provette coniche sterili, pre-pesati. Pellet i batteri per centrifugazione per 5 min a 6.000 giri (5.000 xg). </li><li> Eliminare il surnatante e lavare i batteri con 50 ml di sterile M9. Ripetere due volte. </li><li> Dopo il secondo lavaggio rimuovere il rimanente M9, assicurando che nessun M9 è lasciato nel tubo. </li><li> Determinare il peso del pellet pesando il tubo contenente il pellet batteri e sottrarre il peso del tubo conico 50 ml. </li><li> Risospendere il pellet in M9 ad una concentrazione di 100 mg / ml. </li><li> Conservare la soluzione OP50 a 4 ° C fino al suo utilizzo per la cultura verme. </li></ol> 2. Preparazione del nematode crescita a medio Piastre (NGM) Petri NOTA: Questa sezione descrive la preparazione di piatti NGM Petri, che sono i piatti in cui il C. vermi elegans sono normalmente mantenute in laboratorio. <ol><li> Sterilizzare l&#39;agar NGM. </li><li> Utilizzando procedure sterili, erogare 17 ml di soluzione di agar NGM in sei centimetri piastre Petri utilizzando una pompa peristaltica. NOTA: una quantità costante di agar-agar in piastre riduce la necessità di rifocalizzare il microscopio quando si passa da un piatto all&#39;altro. </li><li> Lasciare le piastre a temperatura ambiente per 2-3 giorni prima dell&#39;uso per consentire l&#39;agar solidificare e permettere l&#39;umidità in eccesso di evaporare. </li><li> Seed le piastre NGM utilizzando una tecnica sterile. Applicare 1-2 gocce di liquido OP50 cultura e diffondere con una bacchetta di vetro. Assicurarsi di nonper diffondere il prato batteri fino ai bordi delle piastre. </li><li> Lasciare che il prato OP50 a crescere per 1-2 giorni a temperatura ambiente prima di usare le piastre per crescere vermi. </li></ol> 3. Preparazione di un sincrono Worm Popolazione NOTA: Il ciclo di vita di C. elegans comprende la fase embrionale, quattro stadi larvali (L1-L4) e l&#39;età adulta. Questa sezione descrive la preparazione di una popolazione in età-sincrona di vermi. Tutti i materiali che entrano in contatto con C.elegans dopo il trattamento candeggiante devono essere sterili. <ol><li> 1 ° giorno - Preparazione di Gravid Worm Popolazione <ol><li> Utilizzare piastre NGM in cui la maggioranza della popolazione è costituito da verme affamato L1 larve. </li><li> Raccogliere le larve L1 con un verme sterilizzato raccogliere e trasferirli freschi 6 piatti cm NGM seminato con OP50. Incubare per circa 65 ore a 20 ° C fino a quando la maggior parte dei vermi sono adulti gravide. Aevitare la piastra di sovraffollamento e permettere ai vermi di crescere senza esaurire i batteri, non trasferire più di uno o due gruppi di L1 larve di ogni piatto NGM fresco. </li></ol></li><li> Giorno 4 - Istituzione di un Synchronized L1 Larve Popolazione <ol><li> Raccogliere i vermi gravide dalle piastre NGM lavandoli con 1-2 ml di M9 e trasferirli in un tubo conico da 15 ml. </li><li> Che i vermi gravide sedimentare sul fondo della provetta conica da 15 ml per circa 5-10 minuti. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet verme. </li><li> Trasferire il pellet verme di 2-4 tubi microcentrifuga e aggiungere 1 ml di candeggina / NaOH. Incubare per 2-3 minuti a temperatura ambiente. Monitorare l&#39;avanzamento della reazione allo stereomicroscopio per confermare tutti i vermi sono morti. Non candeggiare più di 5 minuti come gli embrioni potrebbero morire. </li><li> Raccogliere i vermi per centrifugazione per 1 min a 3000 rpm (900 xg). Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di sterile M9 aneutralizzare la reazione. </li><li> Lavare i vermi due volte mediante centrifugazione per 1 min a 3000 rpm (900 xg). </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere M9 fino a 100-200 ml. </li><li> Usando una pipetta Pasteur di vetro aggiungere una goccia del verme / M9 miscela per cancellare piastre NGM e incubate per almeno 24 ore a 20 ° C per consentire gli embrioni alla schiusa. NOTA: Senza cibo crescita del larve sarà interrotta nella fase L1. </li></ol></li><li> Giorno 5 - Istituzione di un Synchronized L4 Popolazione <ol><li> Raccogliere le larve L1 dalle piastre NGM chiare lavando i piatti con 1-2 ml di M9 e trasferirli in un tubo conico da 15 ml. </li><li> Lasciare morti vermi adulti sedimenti sul fondo del tubo da 15 ml per circa 5 min. </li><li> Raccogliere il surnatante, in cui i vermi sono L1, in un nuovo tubo da 15 ml, e precipitare i vermi per centrifugazione per 2 min a 2600 rpm (1000 xg). </li><li> Rimuovere il surnatante leaving circa 500 ml. </li><li> Determinare la concentrazione di vermi nella soluzione M9 contando il numero di vermi in 10 microlitri gocce utilizzando uno stereomicroscopio. Contare almeno 5 gocce. </li><li> Regolare la concentrazione dei vermi per 20-25 vermi / ml e aggiungere 50 ml di worm / mix M9 a piastre NGM seminato con OP50. </li><li> Incubare per 65 ore a 15 ° C (per l&#39;incubazione con il week-end), per consentire alla popolazione sincronizzato L1 a crescere fino a raggiungere lo stadio L4. </li></ol></li></ol> 4. L&#39;esposizione di Worms per sostanze chimiche in piastre con 96 pozzetti NOTA: Questa sezione descrive l&#39;uso di Pxol1 :: giornalista trascrizionale GFP contenenti C. ceppo elegans allo schermo per l&#39;induzione di aneuploidie. <ol><li> Raccogliere le larve L4 dalle piastre NGM chiare lavando i piatti con 1-2 ml di M9 e trasferirli in un tubo conico da 15 ml. </li><li> Lasciare L4 vermi sedimenti sul fondo dellaTubo da 15 ml per circa 5-10 minuti. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet verme. </li><li> Aggiungere 3-5 ml di M9 e determinare la concentrazione di vermi nella soluzione M9 contando il numero di vermi in 10 microlitri gocce utilizzando uno stereomicroscopio. Contare almeno 5 gocce per ogni campione. </li><li> Risospendere i vermi ad una concentrazione di 1.000 vermi / ml in M9. </li><li> Diluire i batteri OP50 dalla sezione 1 10 volte con M9. Assicurarsi che i batteri risospeso temperatura ambiente a causa della temperatura più bassa influisce sviluppo verme. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, prima aggiungere 100 ml di worm mix / M9 (dal punto 4.4) e poi aggiungere 400 ml di batteri OP50 diluito (dal punto 4.5) in ciascun pozzetto di una profonda rotonda 2 ml bottom piastra da 96 pozzetti. Alla fine, ogni pozzetto avrà 100 vermi in 500 microlitri. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di ciascuna sostanza chimica di prova o il controllo appropriato ai pozzetti desiderati, per ottenere un Conc finale suggeritozione di 100 micron, una concentrazione comunemente usato in schermi chimici in C. elegans 12. Esporre etanolo o DMSO controlli con solvente ad una concentrazione finale di 0,1%. NOTA: Si consiglia l&#39;uso di nocodazole (100 micron) come controllo positivo. </li><li> Sigillare la piastra con pellicola adesiva. Accertarsi di sigillare la piastra bene per evitare la contaminazione incrociata tra i pozzetti. </li><li> Avvolgere la piastra con un foglio di alluminio. </li><li> Trasferire la piastra ad un agitatore (170-180 rpm) della temperatura appropriata per la lunghezza adeguata di tempo (24 o 65 ore). La temperatura della camera colpisce la crescita dei vermi; mantenere la temperatura intorno ai 20 ° C. </li></ol> 5. Acquisizione di immagini di gravide Worms in un piatto da 384 pozzetti NOTA: Questa sezione descrive l&#39;uso di un microscopio ad alto contenuto di all&#39;immagine Pxol1 esposta :: vermi GFP, di visualizzare l&#39;espressione di GFP in embrioni all&#39;interno dell&#39;utero di ermafroditi adulti. Perogni piatto 384-bene proiettato, utilizzare i vermi da lastre 4 x 96 pozzetti. <ol><li> Dopo esposizione chimica nello shaker, lasciare che la piastra a 96 pozzetti riposo per 10-15 minuti per consentire i vermi adulti per sedimentare sul fondo della piastra. </li><li> Usando una pipetta multicanale, rimuovere 350 microlitri della M9, ​​facendo molta attenzione a non disturbare i vermi sul fondo della piastra. </li><li> Lavare i vermi con 1 ml di M9 e ripetere il punto 5.1. </li><li> Usando una pipetta multicanale, rimuovere 1 ml di M9, essendo vey attenzione a non disturbare i vermi sul fondo della piastra. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, risospendere i vermi nel restante M9 e raccogliere 100 ml di worm / mix M9 dalle piastre a 96 pozzetti e caricarlo nei pozzetti di una parete nera / chiara fondo piatto 384-bene. Ripetere il processo con i vermi da lastre 4 x 96 pozzetti, finché non sono stati caricati tutti i pozzetti della piastra a 384 pozzetti. NOTA: È importante per tutti i pozzetti di avere lo stesso volume per aumentare laefficienza e velocità del autofocus durante il processo di acquisizione dell&#39;immagine. Ogni pozzetto dovrebbe contenere da 80 a 100 vermi. </li><li> Aggiungere 1 ml di levamisolo (100 micron) in ogni pozzetto e lasciare che i vermi incubare per circa 30 min. NOTA: Levamisole agisce come un agonista del recettore dell&#39;acetilcolina e immobilizza i vermi. </li><li> Trasferire la piastra per un widefield elevato contenuto di microscopio in grado di fornire immagini automatizzata. </li><li> Per l&#39;acquisizione delle immagini, utilizzare un alto contenuto di software di acquisizione e analisi delle immagini secondo le linee guida del produttore. Selezionare l&#39;obiettivo 4X per acquisire 1 immagine al bene. </li><li> Prima di avviare l&#39;acquisizione delle immagini, regolare i parametri di imaging GFP a 45 msec di esposizione e risoluzione di 2.160 x 2.160. </li><li> Raccogliere i dati come il numero di GFP vermi positivi divisa per il numero totale di vermi nel pozzo, quest&#39;ultima misura essendo relativamente costante tra i pozzetti. </li></ol>

<ol><li>Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T">http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T</a> (2009).</li>
<li>Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+abnormalities+in+the+human+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosome abnormalities in the human oocyte.</a> Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).</li>
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<li>Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deaths%3A+final+data+for+2006%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Vital+Stat+Rep%22%5BJournal%5D)">Deaths: final data for 2006.</a> Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).</li>
<li>Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+mammals%3A+recombination%2C+non-disjunction+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).</li>
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<li>Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome-counting+mechanisms+that+determine+nematode+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex.</a> Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).</li>
<li>Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+msh-5+is+required+for+both+normal+and+radiation-induced+meiotic+crossing+over+but+not+for+completion+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis.</a> Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).</li>
<li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Screening+Platform+for+the+Rapid+Assessment+of+Chemical+Disruption+of+Germline+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function.</a> Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxicity+Testing+in+the+21st+Century%3A+A+Vision+and+a+Strategy%22">Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy</a>. , The National Academies Press. (2007).</li>
<li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium-+and+high-throughput+screening+of+neurotoxicants+using+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il metodo qui descritto costituisce la prima strategia larga scala per l&#39;identificazione di sostanze tossiche germinali. Si richiede l&#39;uso di un transgenico GFP Pxol-1 :: GFP contenente ceppo che riporta fedelmente l&#39;induzione di aneuploidie in embrioni precoci che viene utilizzato come proxy per la disfunzione linea germinale. Il metodo prevede l&#39;accurata sincronizzazione di un C. popolazione verme elegans e l&#39;esposizione a sostanze chimiche worm &#39;in formato a 96 pozze...

Ci sono circa 87.000 sostanze chimiche registrate per il commercio negli Stati Uniti, ma solo un piccolo numero di questi sono stati testati per i potenziali effetti sulla salute 1. Di quelli che sono stati testati, solo una parte è stata esaminata per effetti sulla salute riproduttiva dovuti in parte alla difficoltà di determinare alterazioni degli eventi riproduttivi primi nei mammiferi, in particolare durante lo sviluppo delle cellule germinali femminile e differenziazione. In effetti, i primi eventi meiotici hanno luogo durante le prime fasi dello sviluppo embrionale dei mammiferi di sesso femminile e sono quindi di difficile accesso e raccogliere in numero adeguato a fini di screening. La linea germinale fornisce il collegamento cruciale tra le generazioni, e la sua funzione appropriata dipende dalla precisa esecuzione del programma intricata di divisione cellulare e cromosomico chiamato meiosi. Disregolazione del processo meiotica può causare ridotta fertilità e la produzione digameti ed embrioni con un numero anormale di cromosomi, una condizione nota come aneuploidie. Errori segregazione cromosomiche in meiosi sono molto importanti per la salute umana. Anomalie cromosomiche sono comuni, con una frequenza di 1 a 150 nati vivi, Trisomia 21, 18 e 13, nonché X e Y errori cromosomiche che sono i tipi più diffusi 2,3. Inoltre, malformazioni congenite, incluse quelle di origini cromosomiche, sono la principale causa di morte infantile negli Stati Uniti 4 L&#39;idea che le influenze ambientali possono influenzare la segregazione e il comportamento cromosomico non è nuovo 5, ma è ancora poco conosciuta. E &#39;quindi fondamentale indagare quali delle sostanze chimiche introdotte nel nostro ambiente stanno interferendo con la fertilità umana, lo sviluppo della prima e della salute riproduttiva generale. Alla luce di queste limitazioni dei modelli mammiferi, abbiamo sviluppato un saggio schermo high-throughput per testare la tossicità riproduttiva nel verme &lt;em&gt; C. elegans. Abbiamo mobilitato diverse importanti caratteristiche offerte da questo sistema modello genetico di uso comune come le sue piccole dimensioni, a basso costo, ciclo di riproduzione breve, alta percentuale di cellule germinali e la facilità di manipolazione 6. Worms possono essere coltivate in piastre da 96 pozzetti o in volume di culture alte e liquidi a causa della loro trasparenza possono essere esposte direttamente su piastre per la rilevazione di giornalisti fluorescenti. Il test descritto di seguito sfrutta queste caratteristiche e si avvale di un ceppo verme contenente il reporter fluorescente Pxol-1 :: GFP per rilevare interruzioni germinale e induzione di aneuploidie embrionale. L&#39;uso di questo ceppo giornalista si basa sul generalmente scarsa incidenza maschi in una popolazione verme principalmente ermafrodita. Questi maschi (&lt;0,2%) naturalmente provengono da errore nella segregazione del cromosoma X 7. Tuttavia, come interruzione linea germinale porta spesso ad errori in segregazione di autosomie di eterocromosomi, si correla sia con una elevata incidenza di maschi fenotipo (X missegregation) e letalità embrionale (autosoma missegregation). Per rilevare facilmente l&#39;induzione dei maschi, mentre eludere la questione della letalità embrionale, un promotore maschio-specifica (Xol-1) è usato per guidare l&#39;espressione di GFP in embrioni precoci ancora contenuti all&#39;interno dell&#39;utero del worm. Come tale, la comparsa di embrioni-GFP esprimere viene utilizzato come proxy per la presenza di embrioni aneuploidi. Questo metodo è stato precedentemente utilizzato per identificare i geni implicati nella linea germinale manutenzione e meiosi 8,9. Adattato per lo screening chimico, questo ceppo è impiegato in un mezzo di schermo ad alta produttività. È importante sottolineare che il ceppo riporta fedelmente la aneugenicity di sostanze chimiche ed è quindi rilevante per endpoint riproduttivi dei mammiferi 10. Il test qui descritto sarà particolarmente utile per i tossicologi in ambienti dell&#39;industria chimica farmaceutica e ricercadi valutare rapidamente la tossicità delle sostanze chimiche verso endpoint riproduttivi. Inoltre, questo test allinea pienamente con le priorità governative evidenziati nella tossicità nel 21 ° rapporto secolo 11.

<table><tbody><tr><td>Piastre Petri ventilate da 60 mm</td><td>Tritech</td><td>T3315</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Apex</td><td>20-274</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 96 pozzetti trasparenti fondo rotondo 2 ml di piastra profonda in polipropilene</td><td>Corning</td><td>P-DW-20-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone</td><td>Apex</td><td>20-261</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-triptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>Candeggina</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio (CaCl2)</td><td>VWR</td><td>AA12316-A1</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10138225</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>IC19018680</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td><a href="http://www.cbs.umn.edu/cgc" target="_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc</a></td></tr><tr><td>Etanolo 200 proof</td><td>VWR</td><td>EM-4455S</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384 piastre pozzetti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1937-32EA</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS System</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Levamisolo cloridrato</td><td>Fluka</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio anidro (MgSO4)</td><td>VWR</td><td>97061-438</td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress Acquisizione di immagini ad alto contenuto e Fosfato</td><td></td><td></td><td></td></tr> di <tr><td>potassio monobasico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Pellicole di rayon per colture biologiche</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td></td><td></td>Sidrossido di sodio (NaOH)Fisher <td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>BDH0316</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>Questo microscopio ha un ingrandimento totale da 3,35X a 300X. Qualsiasi microscopio con caratteristiche simili funzionerà.</td></tr><tr><td>TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP ceppo reporter</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td><a href="http://www.cbs.umn.edu/cgc" target="_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc</a></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione completa della linea germinale chemical tossicità utilizzando il nematode<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identificare la tossicità riproduttiva delle migliaia di sostanze chimiche presenti nel nostro ambiente è stata una delle sfide più allettanti nel campo della salute ambientale. Ciò è dovuto in parte alla scarsità di sistemi modello che può (1) ricapitolare accuratamente chiavi caratteristiche dei processi riproduttivi e (2) lo fanno in un medio di moda high-throughput, senza la necessità di un elevato numero di animali vertebrati. Descriviamo qui un test nel nematode C. elegans che permette la rapida identificazione delle sostanze tossiche linea germinale monitorando l&#39;induzione di embrioni aneuploidi. Facendo uso di una linea di GFP giornalista, errori nella segregazione dei cromosomi derivanti da interruzioni germinale sono facilmente visualizzati e quantificati al microscopio a fluorescenza automatizzata. Così la proiezione di un particolare insieme di composti per la sua tossicità può essere eseguita in un formato di piastra da 96 a 384 pozzetti in pochi giorni. Analisi secondaria di h positivola sua può essere eseguita per stabilire se le anomalie cromosomiche originati da interruzioni meiotic o dai primi errori segregazione dei cromosomi embrionali. Complessivamente, questo test rappresenta una veloce strategia di primo passaggio per la rapida valutazione della disfunzione linea germinale dopo l&#39;esposizione chimica.

L&#39;esposizione della Pxol-1 :: GFP giornalista ceppo ad agenti chimici quali microtubulo veleno nocodazole (Figura 1) porta alla induzione di una elevata percentuale di embrioni-GFP esprimere nell&#39;utero di ermafroditi adulti esposti rispetto al controllo DMSO. Gli embrioni GFP-positive sono significativamente più luminoso sfondo debole fluorescenza osservato in altri embrioni nonché l&#39;auto-fluorescenza osservato nell&#39;intestino degli animali. Vermi sono direttamente esposte ripres...

Descriviamo le fasi dettagliate di un test chimico ad alto rendimento nel nematode Caenorhabditis elegans utilizzato per valutare la tossicità germinale. In questo test, l'interruzione della funzione germinale a seguito di esposizione chimica viene monitorata utilizzando un reporter fluorescente specifico per embrioni aneuploidi.

Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare in modo completo la tossicità chimica della linea germinale utilizzando il nematode C No Haitis elgan. Questo viene ottenuto innanzitutto sincronizzando i vermi aggiungendo una soluzione di ipoclorito diluita a una popolazione mista di vermi della ceppia C Elgan PXOL one GFP. Questo passaggio genera un elevato numero di embrioni protetti dall'ipoclorito grazie al loro guscio uovo.Il secondo passaggio consiste nel generare una popolazione sincronizzata di larve di primo stadio (L1) facendo schiudere gli embrioni in un liquido privo di cibo. Successivamente, i vermi vengono fatti crescere fino allo stadio larvale quarto (L4), momento in cui vengono esposti ai composti di interesse in soluzione liquida per 65 ore. L'ultimo passaggio prevede la visualizzazione, mediante microscopia a fluorescenza, dell'espressione dei reporter GFP negli embrioni all'interno dell'utero dei vermi.In definitiva, la proporzione di embrioni positivi per GFP rispetto al controllo con DMSO riflette l'antigenicit&agrave; dei composti testati. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i modelli di Rodin o i saggi su colture cellular

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Questo video presenta un test di sopravvivenza a breve termine che verifica la tossicità acuta di un trattamento o la resistenza di un ceppo genetico a una condizione tossica. Il protocollo di esempio mostra un esempio di test di sopravvivenza in cui i vermi vengono testati per la loro capacità di resistere allo stress ossidativo indotto dal paraquat (PQ).

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UN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Analisi di Aversione di rame basata sullo stato nutrizionale

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Un protocollo di base per valutare la tossicità delle sostanze chimiche in un animale di modello, elegans di Caenorhabditis, è descritto. Il metodo è conveniente ed utile per lo sviluppo di prodotti farmaceutici anche per quanto riguarda la valutazione del rischio di vari inquinanti ambientali.

Misurare l'effetto delle sostanze chimiche sulla crescita e sulla riproduzione di Caenorhabditis elegans

L'esposizione a sostanze tossiche ambientali possa avere un impatto acutamente sviluppo con effetti a lungo termine. Protocolli dettagliati sono forniti per illustrare una strategia utilizzando un modello di laboratorio efficace per studiare l'effetto di embrionale precoce esposizione al bisfenolo A. Forniamo analisi comportamentale per monitorare l'efficacia della nostra esposizione tossico bio-saggi e fecondità.

Conseguenze a lungo termine del comportamento e riproduttive di embrionale esposizione alle sostanze tossiche della basso-dose

Un metodo quantitativo è stato sviluppato per identificare e prevedere la tossicità acuta dei prodotti chimici analizzando automaticamente l'analisi fenotipica dei Caenorhabditis elegans. Questo protocollo descrive come trattare vermi con prodotti chimici in una piastra 384 pozzetti, catturare video e quantificare tossicologici fenotipi correlati.

Un saggio di High-throughput per la previsione di tossicità chimica di Automated fenotipica profilatura di Caenorhabditis elegans

Gli effetti trans e multigenerazionali delle sostanze chimiche persistenti sono essenziali per giudicare le loro conseguenze a lungo termine nell'ambiente e sulla salute umana. Forniamo nuovi metodi dettagliati per studiare gli effetti trans e multigenerazionali utilizzando il nematode free-living Caenorhabditis elegans.

Utilizzo di Caenorhabditis elegans per studiare gli effetti trans e multigenerazionali dei tossici

Qui, presentiamo un protocollo per valutare le attività neuroprotettive dei composti di prova in Caenorhabditis elegans, tra cui l'aggregazione di poliglutammine, la morte neuronale e il comportamento di chemioavoidance, nonché un'integrazione esemplare di più fenotipi.

Caenorhabditis elegans come sistema modello per la scoperta di composti bioattivi contro la neurotossicità mediata dalla poliglutammina

I nematodi caenorhabditis elegans giovani adulti sono esposti a diverse concentrazioni di pesticidi commerciali o altre sostanze tossiche per 2-24 ore. Quindi, diversi neuroni possono essere visualizzati utilizzando ceppi che esprimono fluorescenza. Questo documento dimostra come esporre i nematodi ai pesticidi e valutare il danno ai neuroni.

Esaminare l'effetto dei pesticidi sui neuroni caenorhabditis elegans

Questo protocollo fornisce una procedura semplice e a basso costo per quantificare il tasso di letalità embrionale in Caenorhabditis elegans. Consente una semplice rilevazione di anomalie embrionali tra le popolazioni senza attrezzature specializzate o competenze nel picking di vermi. Il protocollo può essere utilizzato per quantificare gli effetti delle mutazioni genetiche, delle eliminazioni genetiche mediate dall'interferenza dell'RNA e della dieta.

Quantificazione del tasso di letalità embrionale in Caenorhabditis elegans

Scopri un saggio ad alto rendimento per valutare la tossicità germinale chimica nel nematode Caenorhabditis elegans utilizzando reporter fluorescenti. Questo metodo consente di analizzare rapidamente l'impatto di composti chimici sulla funzione germinale in un modello animale completo.

Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode

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