Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode Caenorhabditis elegans

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di valutare in modo completo la tossicità chimica germinale utilizzando il nematode C No Haitis elgan. Ciò si ottiene sincronizzando prima i vermi aggiungendo una soluzione di candeggina diluita a una popolazione di vermi a stadio misto del ceppo C Elgan PXOL one GFP. Questa fase genera un gran numero di embrioni protetti dalla candeggina dal loro guscio d'uovo.

Il secondo passo consiste nel generare una popolazione sincronizzata di larve L one lasciando che gli embrioni si schiudano in un liquido senza cibo. Successivamente, i vermi crescono fino al loro quarto stadio larvale o L quattro, a quel punto sono esposti alle sostanze chimiche di interesse in liquido per 65 ore. La fase finale è la visualizzazione al microscopio a fluorescenza dell'espressione dei reporter GFP negli embrioni all'interno dell'utero dei vermi.

In definitiva, la percentuale di embrioni positivi alla GFP rispetto al controllo DMSO riflette l'antigenicità dei composti testati. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i modelli di Rodin o i saggi di coltura cellulare, è che possiamo valutare la genicità e la tossicità germinale delle sostanze chimiche in un intero modello animale, eseguendo allo stesso tempo un saggio ad alto rendimento eseguendo la procedura. Oggi sarà la volta della dottoressa Daniella Perotti, assegnista di dottorato.

I vermi grafici per questa procedura sono stati precedentemente preparati come descritto nel testo del protocollo allegato, raccolgono i vermi GR dal terreno di crescita dei nematodi o piastre NGM lavandoli con uno o due millilitri di M nove e trasferendoli in un tubo conico da 15 millilitri. Lasciare sedimentare il verme GR sul fondo del tubo conico da 15 millilitri per circa 5-10 minuti. Quindi, rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet del verme.

Trasferire il pellet di verme in due o quattro provette da microcentrifuga e aggiungere un millilitro di soluzione di candeggina diluita a ciascuna provetta. Incubare per due o tre minuti a temperatura ambiente. Monitora l'andamento della reazione sotto lo stereomicroscopio per confermare che tutti i vermi sono morti.

Non candeggiare per più di cinque minuti poiché gli embrioni potrebbero morire. Raccogli i vermi con centrifusion per un minuto. A 3000 giri/min.

Rimuovere il supernat e aggiungere un millilitro di M nine sterile per neutralizzare la reazione. Assicurarsi che tutti i materiali che entrano in contatto con i vermi dopo il trattamento con candeggina siano sterili. Lavare i vermi due volte con il mezzo M nine.

Rimuovere il surnatante e aggiungere M nove a 100-200 microlitri. Usando una pipetta di vetro per pascoli, aggiungi una goccia della miscela di vermi M nine per pulire le piastre NGM e incubarle per almeno 24 ore a 20 gradi Celsius per consentire agli embrioni di schiudersi senza cibo. La crescita delle larve verrà arrestata al L uno stadio Due fasi di sincronizzazione.

Lo sbiancamento e la fame di parole L vengono utilizzati perché è fondamentale ottenere una popolazione calda altamente sincrona per massimizzare il numero di larve di L quattro che verranno utilizzate per l'esposizione. Un giorno dopo la creazione di una popolazione sincronizzata di larve L uno, raccogliere le larve L uno dalle lastre trasparenti NGM. Lavare le piastre con uno o due millilitri di M nove e trasferire le larve di L uno in un tubo conico da 15 millilitri.

Lascia che i vermi adulti morti sedimentino sul fondo del tubo conico da 15 millilitri per circa cinque minuti. Raccogli il surnatante dove si trovano i vermi L one in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Far precipitare i vermi mediante centrifusione per due minuti a 2, 600 giri/min.

Rimuovere il surnatante lasciando circa 500 microlitri. Determinare la concentrazione di vermi nella soluzione M nine contando il numero di vermi in gocce da 10 microlitri. Utilizzando uno stereomicroscopio contare almeno cinque gocce.

Regolare la concentrazione dei vermi da 20 a 25 vermi per microlitro in M nove, quindi aggiungere 50 microlitri della miscela di vermi M nove alle piastre NGM. Seduti con OP 50, i batteri che si nutrono incubano per 65 ore a 15 gradi Celsius per consentire alla popolazione sincronizzata L one di crescere fino a raggiungere lo stadio L quattro. Questo screening utilizza un CL contro il ceppo che contiene un reporter trascrizionale fluorescente per rilevare l'interruzione della linea germinale e l'induzione dell'aneuploidia embrionale.

Raccogliere le larve L quattro dalle piastre NGM trasparenti lavando le piastre con uno o due millilitri di M nove e trasferendole in un tubo conico da 15 millilitri. Lasciare sedimentare il verme L four sul fondo del tubo conico da 15 millilitri per circa 5-10 minuti. Quindi rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet del verme.

Aggiungere da tre a cinque millilitri di M nove e determinare la concentrazione di vermi nella soluzione di M nove contando il numero di vermi in gocce da 10 microlitri. Utilizzando uno stereomicroscopio, contare almeno cinque gocce per ogni campione. Risospendere i vermi a una concentrazione di un verme per millilitro in M nove.

Diluire dieci volte i batteri OP 50 precedentemente preparati con M nine. Assicurarsi che i batteri risospesi raggiungano la temperatura ambiente perché le temperature più basse influenzano lo sviluppo dei vermi, utilizzando prima una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri della miscela M nine di vermi a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a fondo rotondo profonda due millilitri. Quindi, aggiungere 400 microlitri di batteri OP 50 diluiti a ciascun pozzetto alla fine.

Ogni pozzetto avrà 100 vermi in 500 microlitri. Aggiungere 0,5 microlitri della sostanza chimica in esame ai pozzetti desiderati per ottenere una concentrazione finale di 100 micromolari. Una concentrazione comunemente utilizzata negli schermi chimici in CL elgan espone i controlli di solvente etanolo o DMSO a una concentrazione finale dello 0,1% come controllo positivo.

Utilizzare 100 micromolari senza cosol. Sigillare la piastra con pellicola adesiva. Assicurarsi di sigillare bene la piastra per evitare la contaminazione incrociata tra i pozzetti.

Avvolgere il piatto con un foglio di alluminio. Trasferire la piastra in uno shaker della temperatura appropriata per un periodo di tempo adeguato. Mantenere la temperatura della stanza intorno ai 20 gradi Celsius poiché la temperatura influisce sulla crescita dei vermi al termine dell'esposizione chimica nello shaker.

Lasciare riposare le piastre da 96 pozzetti per 10-15 minuti per consentire ai vermi adulti di sedimentare sul fondo della piastra utilizzando una pipetta multicanale. Rimuovere 350 microlitri di M nine da ogni pozzetto facendo attenzione a non disturbare i vermi sul fondo della piastra. Lavare i vermi con un millilitro di M nove e lasciare riposare nuovamente la piastra per 10-15 minuti per consentire ai vermi adulti di sedimentare sul fondo.

Rimuovere un millilitro di M nove da ogni pozzetto facendo molta attenzione a non disturbare i vermi sul fondo della piastra. Resus, sospendi i vermi nel restante M nove. Raccogliere 100 microlitri della miscela di vermi M nine dalla piastra a 96 pozzetti e caricarla nei pozzetti di una piastra a 384 pozzetti con fondo trasparente a parete nera.

Ripetere il processo utilizzando le viti senza fine da 4 piastre da 96 pozzetti fino a quando tutti i pozzetti della piastra da 384 pozzetti sono stati caricati. È importante che tutti i pozzetti abbiano lo stesso volume per aumentare l'efficienza e la velocità dell'autofocus durante il processo di acquisizione dell'immagine. Quindi, aggiungi un microlitro di lale a ciascun pozzetto e lascia incubare i vermi per circa 30 minuti.

Lale agisce come agonista del recettore dell'acetilcolina e immobilizza i vermi, trasferendo la piastra su un microscopio ad alto contenuto ad ampio campo in grado di fornire immagini automatizzate. Utilizzare un software di acquisizione e analisi delle immagini ad alto contenuto secondo le linee guida del produttore. Seleziona l'obiettivo quattro x per acquisire un'immagine per.

Regolare bene i parametri di imaging GFP a 45 millisecondi di esposizione e la risoluzione dell'immagine a 2160 entro il 2160. Inizia l'acquisizione dell'immagine I vermi esposti vengono ripresi direttamente su piastre a 384 pozzetti. Il numero di vermi contenenti almeno un embrione positivo alla GFP viene contato per ogni pozzetto e normalizzato dal numero totale di vermi in quel pozzetto, come mostrato qui.

L'esposizione ad agenti chimici come il veleno dei microtubuli no-code AOL porta all'induzione di un'alta percentuale di embrioni che esprimono GFP rispetto al controllo DMSO. Gli embrioni GFP positivi sono significativamente più luminosi della debole fluorescenza di fondo osservata in altri embrioni, così come dell'autofluorescenza osservata nell'intestino degli animali. La freccia rossa indica gli embrioni positivi alla GFP chiaramente visibili all'interno dell'utero di un verme trattato con AOL senza codice.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la colorazione del DNA dei vermi, al fine di ottenere uno sguardo più dettagliato sull'effetto delle sostanze chimiche sulla linea germinale. Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo della tossicologia di valutare rapidamente la tossicità riproduttiva e la tossicità germinale delle sostanze chimiche.