Name: Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Scopri un saggio ad alto rendimento per valutare la tossicità germinale chimica nel nematode Caenorhabditis elegans utilizzando reporter fluorescenti. Questo metodo consente di analizzare rapidamente l'impatto di composti chimici sulla funzione germinale in un modello animale completo.

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Gli autori desiderano ringraziare le seguenti fonti di finanziamento: NIH ES020353 e il premio Colgate-Palmolive Alternative Research Grant per aver reso possibile questo lavoro.

1. Preparazione di batteri alimentazione NOTA: Questa sezione descrive la preparazione di batteri alimentazione (ceppo di E. coli OP50). <ol><li> Isolare una singola colonia di E. coli ceppo OP50 da un brodo lisogenia (LB) piastra di agar e asetticamente inoculare in 300 ml di brodo LB autoclavato. </li><li> Lasciare la coltura inoculata a crescere durante la notte in un agitatore a 200 rpm e 37 ° C, fino a saturazione. </li><li> Trasferire il OP50 in 6 50 ml provette coniche sterili, pre-pesati. Pellet i batteri per centrifugazione per 5 min a 6.000 giri (5.000 xg). </li><li> Eliminare il surnatante e lavare i batteri con 50 ml di sterile M9. Ripetere due volte. </li><li> Dopo il secondo lavaggio rimuovere il rimanente M9, assicurando che nessun M9 è lasciato nel tubo. </li><li> Determinare il peso del pellet pesando il tubo contenente il pellet batteri e sottrarre il peso del tubo conico 50 ml. </li><li> Risospendere il pellet in M9 ad una concentrazione di 100 mg / ml. </li><li> Conservare la soluzione OP50 a 4 ° C fino al suo utilizzo per la cultura verme. </li></ol> 2. Preparazione del nematode crescita a medio Piastre (NGM) Petri NOTA: Questa sezione descrive la preparazione di piatti NGM Petri, che sono i piatti in cui il C. vermi elegans sono normalmente mantenute in laboratorio. <ol><li> Sterilizzare l&#39;agar NGM. </li><li> Utilizzando procedure sterili, erogare 17 ml di soluzione di agar NGM in sei centimetri piastre Petri utilizzando una pompa peristaltica. NOTA: una quantità costante di agar-agar in piastre riduce la necessità di rifocalizzare il microscopio quando si passa da un piatto all&#39;altro. </li><li> Lasciare le piastre a temperatura ambiente per 2-3 giorni prima dell&#39;uso per consentire l&#39;agar solidificare e permettere l&#39;umidità in eccesso di evaporare. </li><li> Seed le piastre NGM utilizzando una tecnica sterile. Applicare 1-2 gocce di liquido OP50 cultura e diffondere con una bacchetta di vetro. Assicurarsi di nonper diffondere il prato batteri fino ai bordi delle piastre. </li><li> Lasciare che il prato OP50 a crescere per 1-2 giorni a temperatura ambiente prima di usare le piastre per crescere vermi. </li></ol> 3. Preparazione di un sincrono Worm Popolazione NOTA: Il ciclo di vita di C. elegans comprende la fase embrionale, quattro stadi larvali (L1-L4) e l&#39;età adulta. Questa sezione descrive la preparazione di una popolazione in età-sincrona di vermi. Tutti i materiali che entrano in contatto con C.elegans dopo il trattamento candeggiante devono essere sterili. <ol><li> 1 ° giorno - Preparazione di Gravid Worm Popolazione <ol><li> Utilizzare piastre NGM in cui la maggioranza della popolazione è costituito da verme affamato L1 larve. </li><li> Raccogliere le larve L1 con un verme sterilizzato raccogliere e trasferirli freschi 6 piatti cm NGM seminato con OP50. Incubare per circa 65 ore a 20 ° C fino a quando la maggior parte dei vermi sono adulti gravide. Aevitare la piastra di sovraffollamento e permettere ai vermi di crescere senza esaurire i batteri, non trasferire più di uno o due gruppi di L1 larve di ogni piatto NGM fresco. </li></ol></li><li> Giorno 4 - Istituzione di un Synchronized L1 Larve Popolazione <ol><li> Raccogliere i vermi gravide dalle piastre NGM lavandoli con 1-2 ml di M9 e trasferirli in un tubo conico da 15 ml. </li><li> Che i vermi gravide sedimentare sul fondo della provetta conica da 15 ml per circa 5-10 minuti. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet verme. </li><li> Trasferire il pellet verme di 2-4 tubi microcentrifuga e aggiungere 1 ml di candeggina / NaOH. Incubare per 2-3 minuti a temperatura ambiente. Monitorare l&#39;avanzamento della reazione allo stereomicroscopio per confermare tutti i vermi sono morti. Non candeggiare più di 5 minuti come gli embrioni potrebbero morire. </li><li> Raccogliere i vermi per centrifugazione per 1 min a 3000 rpm (900 xg). Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di sterile M9 aneutralizzare la reazione. </li><li> Lavare i vermi due volte mediante centrifugazione per 1 min a 3000 rpm (900 xg). </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere M9 fino a 100-200 ml. </li><li> Usando una pipetta Pasteur di vetro aggiungere una goccia del verme / M9 miscela per cancellare piastre NGM e incubate per almeno 24 ore a 20 ° C per consentire gli embrioni alla schiusa. NOTA: Senza cibo crescita del larve sarà interrotta nella fase L1. </li></ol></li><li> Giorno 5 - Istituzione di un Synchronized L4 Popolazione <ol><li> Raccogliere le larve L1 dalle piastre NGM chiare lavando i piatti con 1-2 ml di M9 e trasferirli in un tubo conico da 15 ml. </li><li> Lasciare morti vermi adulti sedimenti sul fondo del tubo da 15 ml per circa 5 min. </li><li> Raccogliere il surnatante, in cui i vermi sono L1, in un nuovo tubo da 15 ml, e precipitare i vermi per centrifugazione per 2 min a 2600 rpm (1000 xg). </li><li> Rimuovere il surnatante leaving circa 500 ml. </li><li> Determinare la concentrazione di vermi nella soluzione M9 contando il numero di vermi in 10 microlitri gocce utilizzando uno stereomicroscopio. Contare almeno 5 gocce. </li><li> Regolare la concentrazione dei vermi per 20-25 vermi / ml e aggiungere 50 ml di worm / mix M9 a piastre NGM seminato con OP50. </li><li> Incubare per 65 ore a 15 ° C (per l&#39;incubazione con il week-end), per consentire alla popolazione sincronizzato L1 a crescere fino a raggiungere lo stadio L4. </li></ol></li></ol> 4. L&#39;esposizione di Worms per sostanze chimiche in piastre con 96 pozzetti NOTA: Questa sezione descrive l&#39;uso di Pxol1 :: giornalista trascrizionale GFP contenenti C. ceppo elegans allo schermo per l&#39;induzione di aneuploidie. <ol><li> Raccogliere le larve L4 dalle piastre NGM chiare lavando i piatti con 1-2 ml di M9 e trasferirli in un tubo conico da 15 ml. </li><li> Lasciare L4 vermi sedimenti sul fondo dellaTubo da 15 ml per circa 5-10 minuti. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet verme. </li><li> Aggiungere 3-5 ml di M9 e determinare la concentrazione di vermi nella soluzione M9 contando il numero di vermi in 10 microlitri gocce utilizzando uno stereomicroscopio. Contare almeno 5 gocce per ogni campione. </li><li> Risospendere i vermi ad una concentrazione di 1.000 vermi / ml in M9. </li><li> Diluire i batteri OP50 dalla sezione 1 10 volte con M9. Assicurarsi che i batteri risospeso temperatura ambiente a causa della temperatura più bassa influisce sviluppo verme. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, prima aggiungere 100 ml di worm mix / M9 (dal punto 4.4) e poi aggiungere 400 ml di batteri OP50 diluito (dal punto 4.5) in ciascun pozzetto di una profonda rotonda 2 ml bottom piastra da 96 pozzetti. Alla fine, ogni pozzetto avrà 100 vermi in 500 microlitri. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di ciascuna sostanza chimica di prova o il controllo appropriato ai pozzetti desiderati, per ottenere un Conc finale suggeritozione di 100 micron, una concentrazione comunemente usato in schermi chimici in C. elegans 12. Esporre etanolo o DMSO controlli con solvente ad una concentrazione finale di 0,1%. NOTA: Si consiglia l&#39;uso di nocodazole (100 micron) come controllo positivo. </li><li> Sigillare la piastra con pellicola adesiva. Accertarsi di sigillare la piastra bene per evitare la contaminazione incrociata tra i pozzetti. </li><li> Avvolgere la piastra con un foglio di alluminio. </li><li> Trasferire la piastra ad un agitatore (170-180 rpm) della temperatura appropriata per la lunghezza adeguata di tempo (24 o 65 ore). La temperatura della camera colpisce la crescita dei vermi; mantenere la temperatura intorno ai 20 ° C. </li></ol> 5. Acquisizione di immagini di gravide Worms in un piatto da 384 pozzetti NOTA: Questa sezione descrive l&#39;uso di un microscopio ad alto contenuto di all&#39;immagine Pxol1 esposta :: vermi GFP, di visualizzare l&#39;espressione di GFP in embrioni all&#39;interno dell&#39;utero di ermafroditi adulti. Perogni piatto 384-bene proiettato, utilizzare i vermi da lastre 4 x 96 pozzetti. <ol><li> Dopo esposizione chimica nello shaker, lasciare che la piastra a 96 pozzetti riposo per 10-15 minuti per consentire i vermi adulti per sedimentare sul fondo della piastra. </li><li> Usando una pipetta multicanale, rimuovere 350 microlitri della M9, ​​facendo molta attenzione a non disturbare i vermi sul fondo della piastra. </li><li> Lavare i vermi con 1 ml di M9 e ripetere il punto 5.1. </li><li> Usando una pipetta multicanale, rimuovere 1 ml di M9, essendo vey attenzione a non disturbare i vermi sul fondo della piastra. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, risospendere i vermi nel restante M9 e raccogliere 100 ml di worm / mix M9 dalle piastre a 96 pozzetti e caricarlo nei pozzetti di una parete nera / chiara fondo piatto 384-bene. Ripetere il processo con i vermi da lastre 4 x 96 pozzetti, finché non sono stati caricati tutti i pozzetti della piastra a 384 pozzetti. NOTA: È importante per tutti i pozzetti di avere lo stesso volume per aumentare laefficienza e velocità del autofocus durante il processo di acquisizione dell&#39;immagine. Ogni pozzetto dovrebbe contenere da 80 a 100 vermi. </li><li> Aggiungere 1 ml di levamisolo (100 micron) in ogni pozzetto e lasciare che i vermi incubare per circa 30 min. NOTA: Levamisole agisce come un agonista del recettore dell&#39;acetilcolina e immobilizza i vermi. </li><li> Trasferire la piastra per un widefield elevato contenuto di microscopio in grado di fornire immagini automatizzata. </li><li> Per l&#39;acquisizione delle immagini, utilizzare un alto contenuto di software di acquisizione e analisi delle immagini secondo le linee guida del produttore. Selezionare l&#39;obiettivo 4X per acquisire 1 immagine al bene. </li><li> Prima di avviare l&#39;acquisizione delle immagini, regolare i parametri di imaging GFP a 45 msec di esposizione e risoluzione di 2.160 x 2.160. </li><li> Raccogliere i dati come il numero di GFP vermi positivi divisa per il numero totale di vermi nel pozzo, quest&#39;ultima misura essendo relativamente costante tra i pozzetti. </li></ol>

<ol><li>Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T">http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T</a> (2009).</li>
<li>Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+abnormalities+in+the+human+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosome abnormalities in the human oocyte.</a> Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trisomy+in+humans%3A+incidence%2C+origin+and+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Trisomy in humans: incidence, origin and etiology.</a> Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).</li>
<li>Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deaths%3A+final+data+for+2006%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Vital+Stat+Rep%22%5BJournal%5D)">Deaths: final data for 2006.</a> Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).</li>
<li>Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+mammals%3A+recombination%2C+non-disjunction+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li>
<li>Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome-counting+mechanisms+that+determine+nematode+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex.</a> Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).</li>
<li>Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+msh-5+is+required+for+both+normal+and+radiation-induced+meiotic+crossing+over+but+not+for+completion+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis.</a> Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).</li>
<li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Screening+Platform+for+the+Rapid+Assessment+of+Chemical+Disruption+of+Germline+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function.</a> Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxicity+Testing+in+the+21st+Century%3A+A+Vision+and+a+Strategy%22">Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy</a>. , The National Academies Press. (2007).</li>
<li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium-+and+high-throughput+screening+of+neurotoxicants+using+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il metodo qui descritto costituisce la prima strategia larga scala per l&#39;identificazione di sostanze tossiche germinali. Si richiede l&#39;uso di un transgenico GFP Pxol-1 :: GFP contenente ceppo che riporta fedelmente l&#39;induzione di aneuploidie in embrioni precoci che viene utilizzato come proxy per la disfunzione linea germinale. Il metodo prevede l&#39;accurata sincronizzazione di un C. popolazione verme elegans e l&#39;esposizione a sostanze chimiche worm &#39;in formato a 96 pozze...

Ci sono circa 87.000 sostanze chimiche registrate per il commercio negli Stati Uniti, ma solo un piccolo numero di questi sono stati testati per i potenziali effetti sulla salute 1. Di quelli che sono stati testati, solo una parte è stata esaminata per effetti sulla salute riproduttiva dovuti in parte alla difficoltà di determinare alterazioni degli eventi riproduttivi primi nei mammiferi, in particolare durante lo sviluppo delle cellule germinali femminile e differenziazione. In effetti, i primi eventi meiotici hanno luogo durante le prime fasi dello sviluppo embrionale dei mammiferi di sesso femminile e sono quindi di difficile accesso e raccogliere in numero adeguato a fini di screening. La linea germinale fornisce il collegamento cruciale tra le generazioni, e la sua funzione appropriata dipende dalla precisa esecuzione del programma intricata di divisione cellulare e cromosomico chiamato meiosi. Disregolazione del processo meiotica può causare ridotta fertilità e la produzione digameti ed embrioni con un numero anormale di cromosomi, una condizione nota come aneuploidie. Errori segregazione cromosomiche in meiosi sono molto importanti per la salute umana. Anomalie cromosomiche sono comuni, con una frequenza di 1 a 150 nati vivi, Trisomia 21, 18 e 13, nonché X e Y errori cromosomiche che sono i tipi più diffusi 2,3. Inoltre, malformazioni congenite, incluse quelle di origini cromosomiche, sono la principale causa di morte infantile negli Stati Uniti 4 L&#39;idea che le influenze ambientali possono influenzare la segregazione e il comportamento cromosomico non è nuovo 5, ma è ancora poco conosciuta. E &#39;quindi fondamentale indagare quali delle sostanze chimiche introdotte nel nostro ambiente stanno interferendo con la fertilità umana, lo sviluppo della prima e della salute riproduttiva generale. Alla luce di queste limitazioni dei modelli mammiferi, abbiamo sviluppato un saggio schermo high-throughput per testare la tossicità riproduttiva nel verme &lt;em&gt; C. elegans. Abbiamo mobilitato diverse importanti caratteristiche offerte da questo sistema modello genetico di uso comune come le sue piccole dimensioni, a basso costo, ciclo di riproduzione breve, alta percentuale di cellule germinali e la facilità di manipolazione 6. Worms possono essere coltivate in piastre da 96 pozzetti o in volume di culture alte e liquidi a causa della loro trasparenza possono essere esposte direttamente su piastre per la rilevazione di giornalisti fluorescenti. Il test descritto di seguito sfrutta queste caratteristiche e si avvale di un ceppo verme contenente il reporter fluorescente Pxol-1 :: GFP per rilevare interruzioni germinale e induzione di aneuploidie embrionale. L&#39;uso di questo ceppo giornalista si basa sul generalmente scarsa incidenza maschi in una popolazione verme principalmente ermafrodita. Questi maschi (&lt;0,2%) naturalmente provengono da errore nella segregazione del cromosoma X 7. Tuttavia, come interruzione linea germinale porta spesso ad errori in segregazione di autosomie di eterocromosomi, si correla sia con una elevata incidenza di maschi fenotipo (X missegregation) e letalità embrionale (autosoma missegregation). Per rilevare facilmente l&#39;induzione dei maschi, mentre eludere la questione della letalità embrionale, un promotore maschio-specifica (Xol-1) è usato per guidare l&#39;espressione di GFP in embrioni precoci ancora contenuti all&#39;interno dell&#39;utero del worm. Come tale, la comparsa di embrioni-GFP esprimere viene utilizzato come proxy per la presenza di embrioni aneuploidi. Questo metodo è stato precedentemente utilizzato per identificare i geni implicati nella linea germinale manutenzione e meiosi 8,9. Adattato per lo screening chimico, questo ceppo è impiegato in un mezzo di schermo ad alta produttività. È importante sottolineare che il ceppo riporta fedelmente la aneugenicity di sostanze chimiche ed è quindi rilevante per endpoint riproduttivi dei mammiferi 10. Il test qui descritto sarà particolarmente utile per i tossicologi in ambienti dell&#39;industria chimica farmaceutica e ricercadi valutare rapidamente la tossicità delle sostanze chimiche verso endpoint riproduttivi. Inoltre, questo test allinea pienamente con le priorità governative evidenziati nella tossicità nel 21 ° rapporto secolo 11.

<table><tbody><tr><td>Piastre Petri ventilate da 60 mm</td><td>Tritech</td><td>T3315</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Apex</td><td>20-274</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 96 pozzetti trasparenti fondo rotondo 2 ml di piastra profonda in polipropilene</td><td>Corning</td><td>P-DW-20-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone</td><td>Apex</td><td>20-261</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-triptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>Candeggina</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio (CaCl2)</td><td>VWR</td><td>AA12316-A1</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10138225</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>IC19018680</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td><a href="http://www.cbs.umn.edu/cgc" target="_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc</a></td></tr><tr><td>Etanolo 200 proof</td><td>VWR</td><td>EM-4455S</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384 piastre pozzetti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1937-32EA</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS System</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Levamisolo cloridrato</td><td>Fluka</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio anidro (MgSO4)</td><td>VWR</td><td>97061-438</td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress Acquisizione di immagini ad alto contenuto e Fosfato</td><td></td><td></td><td></td></tr> di <tr><td>potassio monobasico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Pellicole di rayon per colture biologiche</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td></td><td></td>Sidrossido di sodio (NaOH)Fisher <td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>BDH0316</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>Questo microscopio ha un ingrandimento totale da 3,35X a 300X. Qualsiasi microscopio con caratteristiche simili funzionerà.</td></tr><tr><td>TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP ceppo reporter</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td><a href="http://www.cbs.umn.edu/cgc" target="_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc</a></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione completa della linea germinale chemical tossicità utilizzando il nematode<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identificare la tossicità riproduttiva delle migliaia di sostanze chimiche presenti nel nostro ambiente è stata una delle sfide più allettanti nel campo della salute ambientale. Ciò è dovuto in parte alla scarsità di sistemi modello che può (1) ricapitolare accuratamente chiavi caratteristiche dei processi riproduttivi e (2) lo fanno in un medio di moda high-throughput, senza la necessità di un elevato numero di animali vertebrati. Descriviamo qui un test nel nematode C. elegans che permette la rapida identificazione delle sostanze tossiche linea germinale monitorando l&#39;induzione di embrioni aneuploidi. Facendo uso di una linea di GFP giornalista, errori nella segregazione dei cromosomi derivanti da interruzioni germinale sono facilmente visualizzati e quantificati al microscopio a fluorescenza automatizzata. Così la proiezione di un particolare insieme di composti per la sua tossicità può essere eseguita in un formato di piastra da 96 a 384 pozzetti in pochi giorni. Analisi secondaria di h positivola sua può essere eseguita per stabilire se le anomalie cromosomiche originati da interruzioni meiotic o dai primi errori segregazione dei cromosomi embrionali. Complessivamente, questo test rappresenta una veloce strategia di primo passaggio per la rapida valutazione della disfunzione linea germinale dopo l&#39;esposizione chimica.

L&#39;esposizione della Pxol-1 :: GFP giornalista ceppo ad agenti chimici quali microtubulo veleno nocodazole (Figura 1) porta alla induzione di una elevata percentuale di embrioni-GFP esprimere nell&#39;utero di ermafroditi adulti esposti rispetto al controllo DMSO. Gli embrioni GFP-positive sono significativamente più luminoso sfondo debole fluorescenza osservato in altri embrioni nonché l&#39;auto-fluorescenza osservato nell&#39;intestino degli animali. Vermi sono direttamente esposte ripres...

Descriviamo le fasi dettagliate di un test chimico ad alto rendimento nel nematode Caenorhabditis elegans utilizzato per valutare la tossicità germinale. In questo test, l'interruzione della funzione germinale a seguito di esposizione chimica viene monitorata utilizzando un reporter fluorescente specifico per embrioni aneuploidi.

Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare in modo completo la tossicità chimica della linea germinale utilizzando il nematode C No Haitis elgan. Questo viene ottenuto innanzitutto sincronizzando i vermi aggiungendo una soluzione di ipoclorito diluita a una popolazione mista di vermi della ceppia C Elgan PXOL one GFP. Questo passaggio genera un elevato numero di embrioni protetti dall'ipoclorito grazie al loro guscio uovo.Il secondo passaggio consiste nel generare una popolazione sincronizzata di larve di primo stadio (L1) facendo schiudere gli embrioni in un liquido privo di cibo. Successivamente, i vermi vengono fatti crescere fino allo stadio larvale quarto (L4), momento in cui vengono esposti ai composti di interesse in soluzione liquida per 65 ore. L'ultimo passaggio prevede la visualizzazione, mediante microscopia a fluorescenza, dell'espressione dei reporter GFP negli embrioni all'interno dell'utero dei vermi.In definitiva, la proporzione di embrioni positivi per GFP rispetto al controllo con DMSO riflette l'antigenicit&agrave; dei composti testati. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i modelli di Rodin o i saggi su colture cellulari, &egrave; che possiamo valutare la genicit&agrave; e la tossicit&agrave; germinale delle sostanze chimiche in un modello animale completo, eseguendo contemporaneamente un saggio ad alto rendimento. Oggi il ricercatore post-dottorato sar&agrave; la dott.ssa Daniella Perotti.I vermi grafici per questa procedura sono stati precedentemente preparati come descritto nel testo del protocollo allegato; raccogliere i vermi GR dal mezzo di crescita per nematodi o dalle piastre NGM lavandoli con uno o due millilitri di M nine e trasferendoli in un tubo conico da 15 millilitri. Lasciare sedimentare i vermi GR sul fondo del tubo conico da 15 millilitri per circa cinque-dieci minuti. Successivamente, rimuovere il soprannatante senza disturbare il pellet di vermi.Trasferire il pellet di vermi in due o quattro provette da microcentrifuga e aggiungere un millilitro di soluzione di ipoclorito diluita a ciascuna provetta. Incubare per due o tre minuti a temperatura ambiente. Monitorare l'andamento della reazione al microscopio stereoscopico per verificare che tutti i vermi siano morti.Non effettuare un'azione sbiancante superiore a cinque minuti poiché gli embrioni potrebbero morire. Raccogliere i vermi mediante centrifugazione per un minuto a 3000 giri al minuto.Rimuovere il soprannatante ed aggiungere un millilitro di M nove sterile per neutralizzare la reazione. Assicurarsi che tutti i materiali che vengono a contatto con i vermi dopo il trattamento con candeggina siano sterili. Lavare i vermi due volte con il mezzo M nove.Rimuovere il soprannatante e aggiungere da 100 a 200 microlitri di M nine. Utilizzando una pipetta Pasteur in vetro, aggiungere una goccia della sospensione di worm M nine su piastre NGM prive di batteri e incubarle per almeno 24 ore a 20 gradi Celsius per permettere l’eclosione delle uova in assenza di cibo. La crescita delle larve verrà arrestata allo stadio L1. Due passaggi di sincronizzazione.La schiaritura e la privazione del nutriente L sono utilizzate perché è fondamentale ottenere una popolazione altamente sincronizzata per massimizzare il numero di larve L4 che verranno utilizzate per l'esposizione. Un giorno dopo l'ottenimento di una popolazione sincronizzata di larve L1, raccogliere le larve L1 dalle piastre NGM trasparenti. Lavare le piastre con uno o due millilitri di M9 e trasferire le larve L1 in un tubo conico da 15 millilitri.Lasciare sedimentare i vermi adulti morti sul fondo del tubo conico da 15 millilitri per circa cinque minuti. Raccogliere il soprannatante in cui si trovano i vermi L1 in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Precipitare i vermi mediante centrifugazione per due minuti a 2.600 giri al minuto.Rimuovere il soprannatante lasciando circa 500 microlitri. Determinare la concentrazione di vermi nella soluzione M nove contando il numero di vermi in gocce da 10 microlitri. Utilizzando un microscopio stereoscopico, contare almeno cinque gocce.Regolare la concentrazione dei vermi a 20-25 vermi per microlitro in M nine, quindi aggiungere 50 microlitri della sospensione di vermi in M nine su piastre NGM. Seminate con OP50, i batteri per l'alimentazione, e incubare per 65 ore a 15 gradi Celsius per consentire alla popolazione sincronizzata di stadio L1 di svilupparsi fino allo stadio L4. Questo screening utilizza un ceppo CL contenente un reporter fluorescente transcrittivo per rilevare il disturbo della linea germinale e l'induzione di aneuploidia embrionale.Prelevare le larve L4 dalle piastre NGM trasparenti lavando le piastre con uno o due millilitri di M9 e trasferendole in un tubo conico da 15 millilitri. Lasciare sedimentare i vermi L4 sul fondo del tubo conico da 15 millilitri per circa cinque-dieci minuti. Quindi rimuovere il soprannatante senza disturbare il pellet di vermi.Aggiungere da tre a cinque millilitri di M nine e determinare la concentrazione di vermi nella soluzione M nine contando il numero di vermi in gocce da 10 microlitri. Utilizzando un microscopio stereoscopico, contare almeno cinque gocce per ogni campione. Risospendere i vermi a una concentrazione di un verme per millilitro in M nine.Diluire le batterie OP 50 precedentemente preparate di dieci volte con M nine. Assicurarsi che le batterie sospese raggiungano la temperatura ambiente poiché temperature più basse influiscono sullo sviluppo dei vermi; utilizzando prima una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri della miscela di vermi M nine in ogni pozzetto di una piastra 96 pozzetti da due millilitri con fondo rotondo profondo. Successivamente, aggiungere 400 microlitri delle batterie OP 50 diluite in ogni pozzetto alla fine.Ogni pozzetto conterrà 100 vermi in 500 microlitri. Aggiungere 0,5 microlitri del composto in esame ai pozzetti desiderati per ottenere una concentrazione finale di 100 micromolare. Una concentrazione comunemente utilizzata nei test chimici in CL elgan prevede l'esposizione a controlli con etanolo o DMSO come solvente a una concentrazione finale dello 0,1% come controllo positivo.Utilizzare 100 micromolar senza cosolvente. Sigillare la piastra con un film adesivo. Assicurarsi di sigillare bene la piastra per prevenire contaminazioni incrociate tra pozzetti.Avvolgere la piastra con della carta d'alluminio. Trasferire la piastra in uno shaker alla temperatura appropriata per un tempo adeguato. Mantenere la temperatura della stanza intorno ai 20 gradi Celsius, poiché la temperatura influisce sulla crescita dei vermi al termine dell'esposizione chimica nello shaker.Lasciare riposare le piastre a 96 pozzetti per 10-15 minuti, consentendo ai vermi adulti di sedimentare sul fondo della piastra mediante l'uso di una pipetta multicanale. Rimuovere 350 microlitri di M nine da ogni pozzetto, avendo cura di non disturbare i vermi sul fondo della piastra. Lavare i vermi con un millilitro di M nine e lasciare nuovamente riposare la piastra per 10-15 minuti, consentendo ai vermi adulti di sedimentare nuovamente sul fondo.Rimuovere un millilitro di M nove da ciascun pozzetto, avendo molta cura di non disturbare i vermi sul fondo della piastra. Ri-sospendere i vermi nell'M nove rimanente. Raccogliere 100 microlitri della sospensione di vermi in M nove dalla piastra a 96 pozzetti e trasferirli nei pozzetti di una piastra a 384 pozzetti con pareti nere e fondo trasparente.Ripetere il processo utilizzando vermi provenienti da 4 piastre a 96 pozzetti fino a quando tutti i pozzetti della piastra a 384 pozzetti non sono stati caricati. È importante che tutti i pozzetti abbiano lo stesso volume al fine di aumentare l'efficienza e la velocità dell'autofocus durante il processo di acquisizione delle immagini. Successivamente, aggiungere un microlitro di lale in ciascun pozzetto e lasciare incubare i vermi per circa 30 minuti.Lale agisce come agonista del recettore dell'acetilcolina e immobilizza i vermi; trasferire la piastra su un microscopio ad alto contenuto di campo ampio in grado di fornire imaging automatizzato. Utilizzare un software di acquisizione e analisi delle immagini ad alto contenuto seguendo le indicazioni del produttore. Selezionare l'obiettivo 4x per acquisire un'immagine per ogni.Regolare i parametri di acquisizione dell'immagine GFP su un tempo di esposizione di 45 millisecondi e una risoluzione di 2160 per 2160. Iniziare l'acquisizione delle immagini: i vermi esposti vengono immagini direttamente su piastre a 384 pozzetti. Per ogni pozzetto viene contato il numero di vermi contenenti almeno un embrione positivo per GFP e normalizzato rispetto al numero totale di vermi presenti in quel pozzetto, come mostrato qui.L'esposizione ad agenti chimici come il veleno dei microtubuli no-code AOL induce una percentuale elevata di embrioni esprimenti GFP rispetto al controllo con DMSO. Gli embrioni positivi per GFP sono significativamente più luminosi rispetto alla debole fluorescenza di fondo osservata in altri embrioni, nonché alla autofluorescenza osservata nell'intestino degli animali. La freccia rossa indica embrioni positivi per GFP chiaramente visibili all'interno dell'utero di un verme trattato con no-code AOL.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la colorazione del DNA dei vermi, al fine di analizzare in modo più dettagliato l'effetto dei composti chimici sulla linea germinale. Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo della tossicologia di valutare rapidamente la tossicità riproduttiva e la tossicità sulla linea germinale dei composti chimici.

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