Utilizzando virus adeno-associati come strumento per studiare le barriere della retina nella malattia

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la permeabilità della barriera emato-retinica e l'integrità della membrana limitante interna in modelli animali di malattia retinica. Questo viene ottenuto innanzitutto iniettando particelle AAV contenenti un transgene GFP nel vitreo o nel circolo sanguigno. Il secondo passaggio consiste nel prelevare campioni di sangue in diversi momenti successivi alle iniezioni.

Il prelievo di sangue è integrato da un'immagine settimanale in vivo del fondo oculare. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire un'immunocitochimica su preparati retinici piatti e su sezioni crio-retiniche. Infine, la microscopia confocale e la PCR vengono utilizzate per mostrare l'indicatore del modello di trasduzione dell'integrità della membrana limitante interna (ILM) e per rilevare le particelle di AAV nel torrente sanguigno, dimostrando così la permeabilità della barriera emato-retinica.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai nostri metodi esistenti è che il metodo AAV paste fornisce informazioni sulla permeabilità della barriera emato-retinica che non sono ottenibili con altre cellule. Le implicazioni di questa tecnica riguardano la terapia genica mediata da AAV, poiché contribuisce a garantire la permeabilità della barriera emato-retinica nei confronti delle particelle AAV, evitando così eventuali effetti collaterali indesiderati. Questo metodo può fornire indicazioni sull'integrità della membrana limitante interna in modelli animali di altre malattie retiniche, come nei ratti diabetici.

L'idea per questo metodo è nata quando abbiamo osservato che la retina del nostro modello di topo null per DP 71, che mostra la rottura della barriera emato-retinica, veniva transdotta in modo più efficiente rispetto alla retina di tipo selvatico.

Iniziare anestetizzando i topi C-57 black-six J. Verificare la perdita di tre riflessi: il riflesso di raddrizzamento, il riflesso di ritrazione e la risposta alla compressione della coda.

La perdita di questi riflessi conferma l'anestesia. Successivamente dilatare le pupille applicando 5% di neosinfrina e 0,5% di midriatico sulla cornea mediante goccia. Poi utilizzare un unguento veterinario per lubrificare gli occhi in modo che non si secchino eccessivamente. A questo punto caricare un ago monouso ultrasottile da 30 gauge con una soluzione madre contenente da uno a quattro volte 10 alla 11a particelle di AAV-GFP.

Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà perché devono eseguire un'iniezione intravitreale in tutta sicurezza senza toccare il cristallino né la retina. Successivamente, inserire un ago monouso ultrasottile da 30 gauge attraverso l'equatore e vicino al limbo fino alla cavità vitrea. Dopo aver introdotto l'ago nell'occhio, iniettare un microlitro di soluzione osservando l'ago al centro della cavità vitrea.

Utilizzare un occhio come controllo per gli esperimenti sulla membrana limitante interna e iniettare entrambi gli occhi per gli esperimenti sulla barriera emato-retinica. Dopo l'iniezione, applicare un trattamento topico anti-infiammatorio e antibatterico a ciascun occhio iniettato. Una settimana dopo, dilatare le pupille con neosinefrina e miodriatico ed eseguire esami del fondo oculare mediante una fotocamera per il fondo oculare.

Monitorare l'espressione di GFP effettuando osservazioni a una settimana, due settimane, un mese e due mesi dopo l'iniezione. Dopo aver prelevato gli occhi da un animale iniettato e sacrificato, dissezionare gli occhi per rimuovere il cristallino e la cornea. Successivamente, fissare per immersione l'occhio dissezionato in paraformaldeide al 4% per un'ora. Trascorsa un'ora, crioproteggere gli occhi in saccarosio al 10% per un'altra ora a temperatura ambiente. Quindi, immergere gli occhi in saccarosio al 20% per un terzo di ora a temperatura ambiente.

Infine, lasciare gli occhi in soluzione di saccarosio al 30% durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, incorporare e congelare le coppette oculari in una resina per inclusione come la matrice criogenica. Quindi, utilizzando il criostato, effettuare sezioni di 10 micron e montarle su vetrini preparati per tessuti congelati.

Ora permeabilizzare le sezioni sui vetrini con un detergente per cinque minuti. Procedere con due brevi lavaggi in PBS. Quindi bloccare gli occhi per un'ora a temperatura ambiente.

Per facilitare la dissezione dei preparati piatti della retina, fissare gli occhi enucleati in paraformaldeide al 4% per 15-30 minuti. Questa fissazione e quella successiva alla dissezione devono essere eseguite correttamente poiché sono fondamentali per preservare la fluorescenza della GFP. Entro 15-30 minuti dal termine del periodo di fissazione, dissezionare gli occhi, rimuovendo la cornea e il cristallino.

Separare la retina dall'epitelio pigmentato retinico e dalla sclera tagliando intorno all'ora serrata e al nervo ottico. Dopo la dissezione, immergere le retine in paraformaldeide al 4% per altri 30 minuti per fissare il tessuto e la proteina fluorescente nelle cellule retiniche transdotte. Dopo la fissazione, lavare il campione per cinque minuti in PBS sterile a pH 7,4.

Quindi sostituire il PBS con il buffer di blocco e incubare le retine per quattro ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Iniziare il passaggio di marcatura incubando i campioni con gli anticorpi primari nel buffer di blocco per quattro ore a temperatura ambiente oppure durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'applicazione dell'anticorpo primario, lavare i tessuti tre volte con PBS, quindi incubare i tessuti in una diluizione 1:500 di anticorpi coniugati con Alexa Fluor nel buffer di blocco.

Incubare per un'ora per sezioni crioconservate o per due ore per preparati in toto. Eseguire a temperatura ambiente e proteggere dalla luce. Dopo l'applicazione dell'anticorpo secondario, rimuoverlo con tre lavaggi in PBS come in precedenza.

Ora, effettuare incisioni di scarico nella retina in modo che possa essere montata piatta su un vetrino, con i fotorecettori o le cellule gangliari della retina rivolte verso l'alto. Applicare un mezzo di montaggio acquoso e un coprioggetto. I vetrini possono essere conservati a quattro gradi Celsius prima dell'acquisizione delle immagini mediante microscopia confocale.

Iniziare generando un controllo positivo per le particelle di AAV circolanti. Prelevare innanzitutto un campione di sangue di 10-20 microlitri prima dell'iniezione dell'AAV. Successivamente, dopo aver anestetizzato l'animale, iniettare 100 microlitri della soluzione virale stock nel circolo sanguigno.

Il modo più semplice per iniettare sostanze nel torrente sanguigno è attraverso la vena peniena. In questa ripresa video, iniettiamo un colorante blu come controllo visivo dell'iniezione. Nei tre giorni successivi, continua a prelevare periodicamente un piccolo campione di sangue, quindi sopprimi il topo. Da un campione di tessuto, estrai il DNA genomico dai campioni utilizzando un kit commerciale; con il DNA ottenuto, effettua un'amplificazione PCR con una coppia di primer specifici per GFP. Esegui 30 cicli con estensioni di 45 secondi e un'annealing a 55 gradi Celsius. Ci si aspettava che il modello di trasduzione del vettore SHH 10 aumentasse nei topi nulli per DP 71. Se il modello animale mostrava alterazioni nella struttura della membrana limitante interna, i topi nulli per DP 71 presentano barriere retiniche compromesse e sono pertanto un confronto utile; nell'iniezione intravitreale di SHH 10 nei topi nulli per DP 71, le cellule gliali di Müller vengono bersagliate in modo più efficiente.

Ciò indica una destabilizzazione della membrana limitante interna in questa linea di topi transgenici rispetto ai controlli di tipo selvaggio. L'iniezione di AAV5-GFP ha dimostrato anche una permeabilità della membrana limitante interna. L'AAV5 si è rivelato inefficace per iniezione intravitreale nei topi di tipo selvaggio, ma è diventato altamente efficace nel trasferimento genico ai fotorecettori nei topi con barriere retiniche compromesse, come nei topi null per DP71.

Mediante analisi PCR, la barriera emato-retinica nei topi privi di DP71 rimane selettiva nei confronti delle particelle AAV, poiché nessuna traccia di AAV è stata rilevata nei loro campioni ematici dopo iniezione intravitreale. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il virus adeno-associato per valutare l'integrità della membrana limitante interna o la permeabilità della barriera emato-retinica, analizzando il profilo di trasduzione della retina o la presenza di particelle AAV nel circolo ematico.