Name: Utilizzando virus adeno-associati come strumento per studiare le barriere della retina nella malattia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Scopri come utilizzare i virus adeno-associati per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica e l'integrità della membrana limitante interna in modelli animali di malattia retinica.

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Ringraziamo la piattaforma di imaging dell'Institut de la Vision. Ringraziamo l'Associazione Francese per la Distrofia Muscolare (AFM) per una borsa di dottorato a O.V. e Allergan INC. Questo lavoro svolto nell'ambito del LABEX LIFESENSES [riferimento ANR-10-LABX-65] è stato sostenuto da fondi statali francesi gestiti dall'ANR. Ringraziamo Peggy Barbe e Mélissa Desrosiers per l'assistenza tecnica nella preparazione dell'AAV. Siamo grati a Stéphane Fouquet per l'eccellente assistenza tecnica nella microscopia confocale e per il suo contributo esperto nell'interpretazione dei risultati.

Tutti gli animali utilizzati in questo studio sono stati curati e trattati secondo la dichiarazione ARVO per l&#39;uso di animali in Oftalmica e Vision Research. 1. Produzione di ricombinante AAV (rAAV) per Transient trasfezione di cellule HEK-293 17,18 NOTA: Vedere McClure C, JoVE (2011) 19. <ol><li> Purificare larga scala Miniprep (almeno 1 mg / ml) dei plasmidi vettore AAV. Utilizzare 3 plasmidi. Il plasmide AAV helper trasportano i geni del capside replica e senza terminale invertita AAV ripete ITR, la cassetta di espressione del transgene trasporta la AAV ITR denominato plasmide di trasferimento, e il plasmide fornendo i geni adenovirus helper E2, E4, e VA geni RNA contemplato come pHELPER. </li><li> Trasfezione 293 cellule con questi 3 plasmidi usano polietilenimina (o altro reagente trasfezione). Sopra 80% di efficienza di trasfezione è necessario per una buona vii rendimenti RAL. </li><li> Purificare AAV ricombinante da 293 lisati cellulari su una pendenza iodixanolo. 15%, 25%, 40% e 60% iodixanolo viene utilizzato per ottenere il gradiente. Colleziona 40% frazione iodixanolo contenente particelle AAV, concentrare la frazione dopo ultracentrifugazione a 500.000 xg per 1 ora e buffer di scambio contro PBS (tampone fosfato salino) con il 0,001% Pluronic. </li><li> Per determinare virale titolo genomico 20, eseguire un DNAse ProteinaseK digest seguito da QPCR. I primer avanti e invertire amplificano la regione 62 bp situata nel AAV2 ITR. Per lo standard plasmide, la sonda è marcato con FAM e ha un buco nero quencher (BHQ). </li><li> Eseguire qPCR (reazione a catena della polimerasi quantitativa) in un volume finale di 25 ml con 340 Nm invertire ITR fondo, 100 nM ITR avanti fondo, 100 nM sonda AAV2 ITR, 0.4 dNTPs mm, 2 mM MgCl2, 1x Platinum Taq Buffer, 1U Platinum Taq e mascherina 5 microlitri (standard, campione e nessun controllo modello). </li><li> Perlo standard, utilizzare il plasmide per la trasfezione in 7 x 10 diluizioni seriali (5 ml ciascuno di 2 x 10 9 2 x 10 3 genomi / ml risultanti in una concentrazione finale 10 ottobre-4 ottobre genomi / ml). </li><li> Iniziare il programma da una fase di denaturazione iniziale a 95 ° C per 15 min seguita da 40 cicli di denaturazione a a 95 ° C per 1 min e ricottura / estensione a 60 ° C per 1 min. Conservare a 4 ° C per una conservazione a breve termine oa -20 ° C per lunghi periodi di stoccaggio. </li></ol> 2. iniezione intravitreale di AAV <ol><li> Anestetizzare topi C57BL6J con ketamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e verifica la perdita del riflesso di raddrizzamento, il ritiro e la coda reflex pinch risposta che indica il corretto anestesia. Dilatare gli alunni per l&#39;applicazione della cornea del neosynephrine 5% e il 0,5% mydriaticum collirio. Utilizzare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Passare un ultrafine 30 G disposable ago attraverso l&#39;equatore e vicino al limbus, in camera vitreale (vedi Chiu K, JoVE (2007) 21). Iniettare 1 ml magazzino contenente da 1 a 4 x 10 11 vp di ShH10-GFP o AAV5-GFP con l&#39;osservazione diretta dell&#39;ago al centro della cavità vitreale (Figura 1). Utilizzare un occhio come controllo per esperimenti ILM. Iniettare entrambi gli occhi per esperimenti BRB. Applicare un trattamento topico antinfiammatoria e antibatterica sugli occhi iniettati. </li><li> Dilatare alunni neosynephrine e mydriaticum collirio per l&#39;imaging. Eseguire l&#39;esame del fondo con una fotocamera fundus dell&#39;occhio di seguire GFP (Green Fluorescent Protein) espressione 1 settimana, 2 settimane, 1 mese e 2 mesi dopo l&#39;iniezione intravitreale (Figura 1). Sacrificio topi da CO 2 inalazione 1 a 2 mesi dopo l&#39;iniezione. </li></ol> 3. Immunoistochimica <ol><li> Per criosezioni retina (Figura 1), sezionare occhi enucleati per rimuovere lens e della cornea, e l&#39;immersione correzione in 4% paraformaldeide per 1 ora. <ol><li> Cryoprotect gli occhi fissi precedentemente a 10% di saccarosio per 1 ora a temperatura ambiente, 20% di saccarosio per un&#39;altra ora a temperatura ambiente. Cryoprotect in soluzione di saccarosio al 30%, overnight a 4 ° C. Congelare e paraocchi incorporare in embedding resina, come Cryo-matrix. Fare 10 micron criosezioni e montare su vetrini appositamente trattati per sezioni di tessuto congelato e che migliorano l&#39;aderenza del tessuto durante la colorazione. </li><li> Permeabilize sezioni con 0,1% Triton X100 in PBS pH 7,4 per 5 min. Lavare 2x in PBS e blocco per 1 ora a temperatura ambiente in PBS con 1% BSA, 0,1% Tween 20. </li></ol></li><li> Per flatmounts retina (Figura 1), fissare gli occhi enucleati in 4% paraformaldeide per 15 min per facilitare la dissezione. <ol><li> In 15-30 min, sezionare gli occhi per rimuovere la cornea e la lente. Separare la retina da dell&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) e sclera tagliando intorno alla serrata eil nervo ottico. Immergere in 4% paraformaldeide per altri 30 minuti per fissare la retina e la proteina fluorescente in cellule retiniche trasdotte (fissaggio non deve superare 24 ore). Lavare 5 min in PBS sterile, pH 7.4. </li><li> Cambiare il PBS al tampone di bloccaggio (PBS con 1% BSA, 2% di capra normale o siero asino, 0,5% Triton X-100), e incubare in tampone di bloccaggio sia per 4 ore a temperatura ambiente oa 4 ° C durante la notte. </li></ol></li><li> Incubare tessuti con anticorpi primari in tampone di bloccaggio sia per 4 ore a temperatura ambiente o in una notte a 4 ° C. Lavare 3x con PBS. NOTA: Gli anticorpi utilizzati sono i seguenti: anti-laminina (1 / 1.000) etichettatura della ILM, clone anti-rodopsina 4D2 (1/500) aste di etichettatura, anti-glutammina sintetasi clone GS-6 (1 / 1.500) di etichettatura cellule Müller , PNA Lectin (1/40) coni di etichettatura. </li><li> Incubare tessuti con diluizione 1: 500 di anticorpi secondari coniugati fluoro Alexa in tampone di bloccaggio per 1 ora (criosezioni) o 2 ore (flatmounts) presso la sala tempetura e al riparo dalla luce. Lavare 3x con PBS. </li><li> Effettuare tagli alleviare alla retina e flatmount è su un vetrino o con il fotoricettore o cellule gangliari della retina (RGC) lato rivolto verso l&#39;alto. Aggiungi mountingmedium acquosa, applicare il coprioggetto e conservare a 4 ° C. </li><li> Eseguire microscopia confocale a scansione laser confocale. Acquisire le immagini in sequenza, riga per riga, per ridurre l&#39;eccitazione e crosstalk emissione. Definire passo secondo il teorema del campionamento di Nyquist-Shannon. Utilizzare le impostazioni di esposizione che riducono al minimo i pixel troppo saturi nelle immagini finali. Elaborare immagini a 12 bit con le Figi, progetto Z-sezioni su un unico piano con la massima intensità in funzione Z-progetto ed infine convertire in modalità colore RGB a 8 bit. </li></ol> 4. PCR analisi di campioni di sangue del mouse <ol><li> Iniettare 100 microlitri magazzino contenente da 1 a 4 x 10 11 particelle di un AAV-GFP nella vena del pene di topi anestetizzati C57BL6J (5% di isofluranoper l&#39;induzione in una camera stretta e 2,5% di isoflurano attraverso un cono naso durante l&#39;intervento chirurgico) utilizzando una siringa da insulina con un ultra-fine ago 6 millimetri. Questo animale servirà come controllo positivo di far circolare le particelle AAV. </li><li> Campione di sangue dalla coda di topo prima dell&#39;iniezione e 3 ore, 24 ore, 2 giorni e 3 giorni dopo l&#39;iniezione intravitreale ShH10 o dopo l&#39;iniezione intrapenile (Figura 1). Circa il 10-20 microlitri è raccolto in tubi eparina. Sacrificio topi da CO 2 inalazione dopo il completamento della procedura. </li><li> Estratto DNA genomico da campioni di sangue con il kit di estrazione di vostra scelta. </li><li> Eseguire PCR amplificazione del DNA genomico. Per questo protocollo utilizzare la seguente coppia di primer: GFP, senso 5&#39;-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 &#39;, antisenso 5&#39;-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3&#39;. Il seguente programma PCR è stata effettuata: 95 ° C 2 min (1 ciclo); 95 ° C 45 sec, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 sec (30 cicli); 72 ° C 5 min (1 ciclo);4 ° C in attesa. </li></ol> 5. Opzionale Evans Metodo Blu NOTA: quantificare permeabilità vascolare misurando fuoriuscita di albumina dai vasi sanguigni nella retina con il metodo blu Evans 10. <ol><li> Preparare Evans blu colorante per dissoluzione in una soluzione salina normale (6 mg / ml), sonicazione per 5 minuti in un bagno ad ultrasuoni, e filtrazione attraverso un filtro 5 micron. </li><li> Anestetizzare topi C57BL6J (isoflurano inalazione, vedere il punto 4.1), controllare la perdita del riflesso di raddrizzamento, il riflesso di ritiro e la risposta coda pizzico indica una corretta anestesia, e iniettare Evans blu (45 mg / kg), attraverso la vena del pene (Figura 1). Verificare che le zampe, il muso e le orecchie di topi diventano chiaramente blu dopo l&#39;iniezione blu Evans, confermando l&#39;assorbimento e la distribuzione del colorante. </li><li> Anestetizzare topi C57BL6J 3 ore dopo l&#39;iniezione del colorante con ketamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e verifica la perdita di righting reflex indicando una corretta anestesia. Esempio intracardiaca circa 500 ml di sangue in tubi eparina e nei profumi topi per 2 min attraverso il ventricolo sinistro con un tampone citrato (0,05 M, pH 3,5 e sciogliere 7,8 g di acido citrico e 3,8 g di citrato di sodio in 1 L di acqua distillata) preriscaldata a 37 ° C per evitare vasocostrizione. I topi sono sacrificati tramite perfusione. </li><li> Dopo la perfusione, enucleate e con attenzione sezionare entrambi gli occhi sotto un microscopio operatorio per raccogliere le retine (vedi Sezione 3.2). Retine secco in un evaporatore centrifuga durante la notte, pesano, ed estrarre il colorante blu Evans incubando retine con 100 ml di formammide per 18 ore a 65 ° C con agitazione (100 xg). Campioni Centrifuga retina a 30K tubi filtranti omega a 20,798.5 xg per 2 ore a 4 ° C e campioni di sangue centrifugare a 20,798.5 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Usare entrambe surnatanti per misurare l&#39;assorbanza. Determinare l&#39;assorbanza di ciascun campione sottraendo il massimo assorbanza for Evans blu a 620 nm al minimo assorbanza a 740 nm. Calcola Evans concentrazione blu nel plasma e della retina di una curva standard di Evans blu in formammide. Esprimere BRB permeabilità in microlitro di Evans blu per grammo di retina secca per ora (ml di plasma / g retinica peso secco / hr). </li></ol> 6. Facoltativo Fluoresceina angiografia NOTA: Perdita dai vasi sanguigni della retina nei topi può essere visualizzato mediante iniezione intraperitoneale di fluoresceina sodica. <ol><li> Anestetizzare topi C57BL6J (isoflurano inalazione, vedere il punto 4.1) e dilatare gli alunni con collirio (neosynephrine e mydriaticum). Utilizzare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Iniettare intraperitoneale 0,01-0,02 ml 10% fluoresceina sodica in 0,1 ml di soluzione fisiologica sterile per fluorangiografia. </li><li> Raccogliere le immagini di entrambi gli occhi dopo l&#39;iniezione utilizzando una telecamera fundus dell&#39;occhio. Sacrificio topi da CO 2 inalazione dopo la proprocedura. NOTA: 20 sec sono necessari per i vasi retinici a diventare visibile su angiografia. Le immagini devono essere catturato tra 3-10 min massimo dopo l&#39;iniezione di fluorescina. I punti di fuga (se presenti) sono osservabili dopo 2.5 min. Al più tardi momenti la qualità dell&#39;immagine è perso a causa di fluoresceina sodica diffusione nel vitreo, quindi solo immagini poco ottenuti dopo sono utilizzati per l&#39;analisi. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La BRB regola lo scambio di molecole tra sangue e retina. La sua composizione è associata a diverse malattie come la retinopatia diabetica o la degenerazione maculare legata all&#39;età (AMD). Abbiamo recentemente dimostrato che in un topo distrofina knock-out, che visualizza permeabile BRB, la retina diventa più permissiva di consegna del gene mediato da vettori virali adeno-associati (AAV). Tuttavia, nonostante BRB particelle permeabilità AAV iniettato intraoculare rimanere confinata al compartimento oculare in questo...

Müller cellule sono il principale componente gliale della retina. Morfologicamente, che abbracciano la retina radiale e la loro endfeet, in contatto con il vitreo, affrontano la ILM e componenti segreti di quest&#39;ultima. La ILM è una membrana basale composta da una decina di diverse proteine ​​della matrice extracellulare (laminina, agrin, perlecan, nidogen, collagene e proteoglicani diversi solfato eparina). Durante lo sviluppo, la sua presenza è indispensabile per istogenesi retinica, la navigazione di assoni ottica, e la sopravvivenza delle cellule gangliari 1-3. Tuttavia, ILM è inessenziale in retina adulta e può essere rimosso chirurgicamente in alcune patologie, senza causare danni alla retina 4. Nella terapia genica, questa membrana diventa una barriera fisica per la trasduzione efficiente della retina mediante AAV per iniezione intravitreale 5. Attraverso l&#39;ampia arborizzazione dei loro processi, le cellule Müller forniscono Suppo nutrizionale e regolamentarert per entrambi i neuroni della retina e cellule vascolari. Cellule Müller sono anche coinvolti nella regolazione dell&#39;omeostasi retinica, nella formazione e mantenimento del BRB 6. Giunzioni strette tra le cellule endoteliali dei capillari della retina, Müller cellule, astrociti e periciti formano la BRB. BRB previene alcuni sostanze di entrare i retina.In molte malattie come la retinopatia diabetica, occlusione venosa retinica e malattie respiratorie, ipossia della retina provoca perdita attraverso la BRB 7-9. Questa rottura è associato ad un aumento della permeabilità vascolare che porta a edema vasogenico, distacco della retina e danni alla retina. Cellule Müller sono strettamente associati con i vasi sanguigni e la membrana basale, svolgendo un ruolo importante sia l&#39;integrità BRB e ILM. Di conseguenza, l&#39;etichettatura cellule gliali Müller è particolarmente rilevante per lo studio dello stato fisico di queste barriere retiniche. Classicoalleato, BRB permeabilità viene misurata usando il saggio blu Evans costituito da iniezione sistemica di Evans colorante blu, che lega non covalente all&#39;albumina plasmatica. Questo test misura la perdita di albumina (proteine ​​di dimensioni intermedie, ~ 66 kDa) dai vasi sanguigni nella retina (vedi Protocolli sezione 5) 10. In alternativa, la perdita vascolare può essere visualizzato con la fluorescenza angiografia retinica attestante l&#39;assenza di perdite di fluoresceina (piccola molecola, ~ 359 Da, vedere Protocolli sezione 6) 11. Tuttavia, entrambi i metodi consentono la valutazione della permeabilità BRB di piccole molecole e proteine, ma non forniscono informazioni circa l&#39;integrità ILM. Quindi, a studiare BRB permeabilità, abbiamo usato un metodo basato AAV che fornisce informazioni sulla permeabilità BRB di molecole più grandi (ad esempio, le particelle di AAV, 25 di diametro nm). In effetti, il nostro metodo in grado di rilevare la presenza di AAV transgene nel sangue, il che suggerisce che le particelle ~ 25 nm di diametro farebberoessere in grado di infiltrarsi nel flusso sanguigno. Questo metodo fornisce anche informazioni sulla struttura del ILM e proteine ​​della matrice extracellulare in condizioni patologiche. Due varianti di AAV sono utili per tale studio: AAV5 e ShH10. Subretinally iniettato, AAV5 ha un tropismo naturale per fotorecettori della retina e dell&#39;epitelio pigmentato 12, ma non si può ottenere attraverso la retina esterna quando somministrato nel vitreo in wild-type retine con ILM intatto 5,13. ShH10 è una variante AAV che è stato progettato per indirizzare specificamente cellule gliali oltre neuroni 14,15. ShH10 etichette selettivamente le cellule Müller sia retine sani e malati con maggiore efficienza in retine con barriere compromesse 16. Questi strumenti virali accoppiato con immuhistochemistry e analisi del sangue-DNA forniscono informazioni sullo stato degli ostacoli retiniche e il loro coinvolgimento nella malattia (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>C57BL6J topi ceppo</td><td>JANVIER LABS topi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 500</td><td>Virbac France</td><td></td><td>anestetico</td></tr><tr><td>Xilazina Rompun 2%</td><td>Bayer Healthcare</td><td></td><td>anestetico</td></tr><tr><td>Neosynephrine 5% Faure</td><td>Europhta</td><td></td><td>dilatante</td></tr><tr><td>Mydriaticum 0,5%</td><td>Thea</td><td></td><td>dilatante</td></tr><tr><td>Sterdex</td><td>Novartis</td><td></td><td>resina per</td></tr><tr><td>inclusione di Cryomatrix</td> antinfiammatoria <td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini di adesione Superfrost Plus</td><td>Vetrini</td>per <td>10143352</td><td>Thermo Scientific</td></tr><tr><td>anti-laminina</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>anti-rodopsina 4D2</td><td>Millipore</td><td>MABN15</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>anti-glutammina sintetasi clone GS-6</td><td>Anticorpo Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-gliale, proteina acida fibrillare gliale</td>, <td>anticorpo Dako</td><td>334</td><td></td></tr>, <tr><td>PNA, lectina</td>, <td>sonda</td><td>Invitrogen</td><td>L32459</td>, Alexa</tr>, <tr><td>anticorpi secondari coniugati al fluor, anticorpo Invitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, reagente Fluorsave,</td><td>terreno di montaggio</td><td>Calbiochem</td><td>, 345789</td></tr>, <tr><td>kit QIAmp DNA Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq DNA polimerasi</td><td>Promega</td><td>M3001</td><td></td></tr><tr><td>Evans Colorante blu</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td>colorante</td></tr><tr><td>5 &micro; m filtro</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Sigma</td><td>C1909-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Formamide spettrofotometrica</td><td>Sigma</td><td>295876-2L</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina</td><td>Sigma</td><td>F2456</td><td>colorante</td></tr><tr><td>Micron III</td><td>Phoenix Research Labs</td><td></td><td>Il sistema di microscopia basato su una fotocamera a colori a 3 CCD, un frame grabber e un software standard consente ai ricercatori di visualizzare le retine dei topi.</td></tr><tr><td>Siringhe da insulina</td><td>Terumo</td><td>SS30M3109</td><td></td></tr><tr><td>siringa 10 &micro; l Hamilton</td><td>Dutscher</td><td>74487</td><td>Seringue 1701</td></tr><tr><td>Ago RN G33, 25 mm, PST 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>11530332</td><td>Iniezione intravitreale</td></tr><tr><td>UltraMicroPump UMP3</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td>Iniettore versatile utilizza microsiringhe per erogare volumi di picolitri</td></tr><tr><td>UltraMicroPump (UMP3) (uno) con controller SYS-Micro4</td><td>UMP3-1</td><td>Controller</td><td></td> digitale</tr><tr><td>Lente d'ingrandimento binoculare SZ76</td><td>ADVILAB</td><td>ADV-76B2</td><td>Zoom 0,66 x 5 x LED con supporto epi e dia / Dissezione retine</td></tr><tr><td>Forbici a molla dritte - 8,5 cm</td><td>Bionic France S.a.r.l</td><td>15003-08</td><td>Dissezione retine</td></tr><tr><td>forbice Vanna curva</td><td>15004-08</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont 5</td><td>11254-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-Well Thermal Cycler</td><td>Life tecnologie</td><td>4375786</td><td>Termociclatore</td></tr><tr><td>Pulitore ad ultrasuoni</td><td>Forniture da laboratorio</td><td>G1125P1T</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 30k tubi omega</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedvac</td><td>Fisher Scientific</td><td>SC 110 A</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofluorimetro</td><td>TECAN</td><td>infinito M1000</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando virus adeno-associati come strumento per studiare le barriere della retina nella malattia

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Müller cellule sono le principali cellule gliali della retina. I loro finali piedi formano i limiti della retina alle membrane limitanti esterna ed interna (ILM), e in collegamento con astrociti, periciti e cellule endoteliali stabiliscono la barriera emato-retinica (BRB). BRB limita trasporto di materiale tra il flusso sanguigno e la retina mentre la ILM agisce come una membrana basale che definisce istologicamente il confine tra la retina e la cavità vitreo. Etichettatura cellule Müller è particolarmente rilevante per studiare lo stato fisico delle barriere della retina, in quanto queste cellule sono parte integrante della BRB e ILM. Sia BRB e ILM sono spesso alterati nelle malattie della retina e sono responsabili per i sintomi della malattia. Esistono diversi metodi ben stabiliti per studiare l&#39;integrità del BRB, quali il test blu Evans o fluorangiografia. Tuttavia questi metodi non forniscono informazioni sul grado di permeabilità BRB to molecole più grandi, in nanometri. Inoltre, essi non forniscono informazioni sullo stato di altri ostacoli retina, come la ILM. Per studiare BRB permeabilità al fianco della retina ILM, abbiamo usato un metodo basato AAV che fornisce informazioni sulla permeabilità della BRB di molecole più grandi, pur indicando lo stato dei ILM e della matrice extracellulare proteine ​​in stati di malattia. Due varianti di AAV sono utili per tale studio: AAV5 e ShH10. AAV5 ha un tropismo naturale fotorecettori, ma non si può ottenere attraverso la retina esterna quando somministrato nel vitreo quando l&#39;ILM è intatto (cioè, in wild-type retine). ShH10 ha un forte tropismo verso le cellule gliali e selettivamente etichettare glia Müller sia retine sani e malati. ShH10 fornisce consegna del gene più efficiente in retine dove ILM è compromessa. Questi strumenti virali accoppiato con immunoistochimica e sangue-DNA analisi hanno fatto luce sulla condizione delle barriere retina nella malattia.

Probabilmente incrementata trasduzione retinica Müller cellule gliali utilizzando ShH10 se il modello animale mostra perturbazioni nella struttura del ILM (Figura 2A - B). Ad esempio, abbiamo dimostrato che, in assenza di DP71, obiettivi ShH10 particolare, ma in modo più efficiente Müller cellule gliali di iniezione intravitreale, indicando un aumento della permeabilità della ILM in questa linea di topi rispetto ai topi wild-type 16 (Figura 2C - F).</...

Per studiare la permeabilità della barriera emato-retinica e l'integrità della membrana limitante interna in modelli animali di malattia retinica, abbiamo utilizzato diverse varianti di virus adeno-associati (AAV) come strumenti per marcare i neuroni retinici e la glia. L'espressione genica reporter mediata da virus viene quindi utilizzata come indicatore della permeabilità della barriera retinica.

Utilizzando virus adeno-associati come strumento per studiare le barriere della retina nella malattia

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la permeabilità della barriera emato-retinica e l'integrità della membrana limitante interna in modelli animali di malattia retinica. Questo viene ottenuto innanzitutto iniettando particelle AAV contenenti un transgene GFP nel vitreo o nel circolo sanguigno. Il secondo passaggio consiste nel prelevare campioni di sangue in diversi momenti successivi alle iniezioni.Il prelievo di sangue è integrato da un'immagine settimanale in vivo del fondo oculare. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire un'immunocitochimica su preparati retinici piatti e su sezioni crio-retiniche. Infine, la microscopia confocale e la PCR vengono utilizzate per mostrare l'indicatore del modello di trasduzione dell'integrità della membrana limitante interna (ILM) e per rilevare le particelle di AAV nel torrente sanguigno, dimostrando così la permeabilità della barriera emato-retinica.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai nostri metodi esistenti è che il metodo AAV paste fornisce informazioni sulla permeabilità della barriera emato-retinica che non sono ottenibili con altre cellule. Le implicazioni di questa tecnica riguardano la terapia genica mediata da AAV, poiché contribuisce a garantire la permeabilità della barriera emato-retinica nei confronti delle particelle AAV, evitando così eventuali effetti collaterali indesiderati. Questo metodo può fornire indicazioni sull'integrità della membrana limitante interna in modelli animali di altre malattie retiniche, come nei ratti diabetici.L'idea per questo metodo è nata quando abbiamo osservato che la retina del nostro modello di topo null per DP 71, che mostra la rottura della barriera emato-retinica, veniva transdotta in modo più efficiente rispetto alla retina di tipo selvatico.Iniziare anestetizzando i topi C-57 black-six J. Verificare la perdita di tre riflessi: il riflesso di raddrizzamento, il riflesso di ritrazione e la risposta alla compressione della coda.La perdita di questi riflessi conferma l'anestesia. Successivamente dilatare le pupille applicando 5% di neosinfrina e 0,5% di midriatico sulla cornea mediante goccia. Poi utilizzare un unguento veterinario per lubrificare gli occhi in modo che non si secchino eccessivamente. A questo punto caricare un ago monouso ultrasottile da 30 gauge con una soluzione madre contenente da uno a quattro volte 10 alla 11a particelle di AAV-GFP.Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà perché devono eseguire un'iniezione intravitreale in tutta sicurezza senza toccare il cristallino né la retina. Successivamente, inserire un ago monouso ultrasottile da 30 gauge attraverso l'equatore e vicino al limbo fino alla cavità vitrea. Dopo aver introdotto l'ago nell'occhio, iniettare un microlitro di soluzione osservando l'ago al centro della cavità vitrea.Utilizzare un occhio come controllo per gli esperimenti sulla membrana limitante interna e iniettare entrambi gli occhi per gli esperimenti sulla barriera emato-retinica. Dopo l'iniezione, applicare un trattamento topico anti-infiammatorio e antibatterico a ciascun occhio iniettato. Una settimana dopo, dilatare le pupille con neosinefrina e miodriatico ed eseguire esami del fondo oculare mediante una fotocamera per il fondo oculare.Monitorare l'espressione di GFP effettuando osservazioni a una settimana, due settimane, un mese e due mesi dopo l'iniezione. Dopo aver prelevato gli occhi da un animale iniettato e sacrificato, dissezionare gli occhi per rimuovere il cristallino e la cornea. Successivamente, fissare per immersione l'occhio dissezionato in paraformaldeide al 4% per un'ora. Trascorsa un'ora, crioproteggere gli occhi in saccarosio al 10% per un'altra ora a temperatura ambiente. Quindi, immergere gli occhi in saccarosio al 20% per un terzo di ora a temperatura ambiente.Infine, lasciare gli occhi in soluzione di saccarosio al 30% durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, incorporare e congelare le coppette oculari in una resina per inclusione come la matrice criogenica. Quindi, utilizzando il criostato, effettuare sezioni di 10 micron e montarle su vetrini preparati per tessuti congelati.Ora permeabilizzare le sezioni sui vetrini con un detergente per cinque minuti. Procedere con due brevi lavaggi in PBS. Quindi bloccare gli occhi per un'ora a temperatura ambiente.Per facilitare la dissezione dei preparati piatti della retina, fissare gli occhi enucleati in paraformaldeide al 4% per 15-30 minuti. Questa fissazione e quella successiva alla dissezione devono essere eseguite correttamente poiché sono fondamentali per preservare la fluorescenza della GFP. Entro 15-30 minuti dal termine del periodo di fissazione, dissezionare gli occhi, rimuovendo la cornea e il cristallino.Separare la retina dall'epitelio pigmentato retinico e dalla sclera tagliando intorno all'ora serrata e al nervo ottico. Dopo la dissezione, immergere le retine in paraformaldeide al 4% per altri 30 minuti per fissare il tessuto e la proteina fluorescente nelle cellule retiniche transdotte. Dopo la fissazione, lavare il campione per cinque minuti in PBS sterile a pH 7,4.Quindi sostituire il PBS con il buffer di blocco e incubare le retine per quattro ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Iniziare il passaggio di marcatura incubando i campioni con gli anticorpi primari nel buffer di blocco per quattro ore a temperatura ambiente oppure durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'applicazione dell'anticorpo primario, lavare i tessuti tre volte con PBS, quindi incubare i tessuti in una diluizione 1:500 di anticorpi coniugati con Alexa Fluor nel buffer di blocco.Incubare per un'ora per sezioni crioconservate o per due ore per preparati in toto. Eseguire a temperatura ambiente e proteggere dalla luce. Dopo l'applicazione dell'anticorpo secondario, rimuoverlo con tre lavaggi in PBS come in precedenza.Ora, effettuare incisioni di scarico nella retina in modo che possa essere montata piatta su un vetrino, con i fotorecettori o le cellule gangliari della retina rivolte verso l'alto. Applicare un mezzo di montaggio acquoso e un coprioggetto. I vetrini possono essere conservati a quattro gradi Celsius prima dell'acquisizione delle immagini mediante microscopia confocale.Iniziare generando un controllo positivo per le particelle di AAV circolanti. Prelevare innanzitutto un campione di sangue di 10-20 microlitri prima dell'iniezione dell'AAV. Successivamente, dopo aver anestetizzato l'animale, iniettare 100 microlitri della soluzione virale stock nel circolo sanguigno.Il modo più semplice per iniettare sostanze nel torrente sanguigno è attraverso la vena peniena. In questa ripresa video, iniettiamo un colorante blu come controllo visivo dell'iniezione. Nei tre giorni successivi, continua a prelevare periodicamente un piccolo campione di sangue, quindi sopprimi il topo. Da un campione di tessuto, estrai il DNA genomico dai campioni utilizzando un kit commerciale; con il DNA ottenuto, effettua un'amplificazione PCR con una coppia di primer specifici per GFP. Esegui 30 cicli con estensioni di 45 secondi e un'annealing a 55 gradi Celsius. Ci si aspettava che il modello di trasduzione del vettore SHH 10 aumentasse nei topi nulli per DP 71. Se il modello animale mostrava alterazioni nella struttura della membrana limitante interna, i topi nulli per DP 71 presentano barriere retiniche compromesse e sono pertanto un confronto utile; nell'iniezione intravitreale di SHH 10 nei topi nulli per DP 71, le cellule gliali di Müller vengono bersagliate in modo più efficiente.Ciò indica una destabilizzazione della membrana limitante interna in questa linea di topi transgenici rispetto ai controlli di tipo selvaggio. L'iniezione di AAV5-GFP ha dimostrato anche una permeabilità della membrana limitante interna. L'AAV5 si è rivelato inefficace per iniezione intravitreale nei topi di tipo selvaggio, ma è diventato altamente efficace nel trasferimento genico ai fotorecettori nei topi con barriere retiniche compromesse, come nei topi null per DP71.Mediante analisi PCR, la barriera emato-retinica nei topi privi di DP71 rimane selettiva nei confronti delle particelle AAV, poiché nessuna traccia di AAV è stata rilevata nei loro campioni ematici dopo iniezione intravitreale. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il virus adeno-associato per valutare l'integrità della membrana limitante interna o la permeabilità della barriera emato-retinica, analizzando il profilo di trasduzione della retina o la presenza di particelle AAV nel circolo ematico.

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In questo video possiamo utilizzare un adenovirus che trasportano il gene Cre ricombinasi per infettare i fibroblasti di topo primario embrionale porta un allele floxed Rac1.

Adenovirus-mediata rimozione genetica di molecole di segnalazione in fibroblasti di topo coltivate primarie embrionali

Questo video mostra l'infezione di neuroni primari del mesencefalo di topo con virus adeno-associati che trasportano un indicatore di calcio fluorescente. La fluorescenza dell'indicatore conferma l'esito positivo dell'infezione e consente il monitoraggio in tempo reale dell'infezione neuronale.

Infezione dei neuroni primari del mesencefalo di topo con virus adeno-associati ingegnerizzati

Fonte: Grames, M. S., et al. Metodi e suggerimenti per la somministrazione endovenosa di virus adeno-associato ai ratti e valutazione della trasduzione del sistema nervoso centrale. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra l'iniezione nella vena caudale del virus adeno-associato ricombinante (AAV) nei ratti. Dopo l'iniezione nella vena laterale della coda, il virus entra nel flusso sanguigno, circola attraverso il cuore e raggiunge il cervello, dove entra nei neuroni e facilita la produzione di...

 Somministrazione endovenosa di vettori virali adeno-associati ricombinanti in un modello di ratto 

L'iniezione sottoretinica è una tecnica chirurgica per la consegna efficace di geni all'epitelio pigmentato retinico nell'occhio del topo.  Qui descriviamo un metodo semplice e replicabile per l'iniezione sottoretinica di vettori virali nell'epitelio pigmentato retinico in topi sperimentali.

Limbare Approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato

Metodi per una consegna del gene su larga scala del sistema nervoso centrale nel ratto sono coperti. In questo esempio, lo scopo è quello di imitare una malattia che colpisce l'intero midollo spinale. La trasduzione diffusa può essere utilizzata per fornire una proteina terapeutica al SNC da un'amministrazione periferica, una tantum.

Metodi e consigli per la somministrazione endovenosa di Virus Adeno-associato ai ratti e valutazione di trasduzione del sistema nervoso centrale

Qui, presentiamo un metodo per studiare la morfogenesi dei neuriti negli espianti retinici postnatali di topo mediante microscopia confocale time-lapse. Descriviamo un approccio per l'etichettatura sparsa e l'acquisizione di tipi di cellule retiniche e dei loro processi fini utilizzando vettori virali adeno-associati ricombinanti che esprimono proteine fluorescenti mirate alla membrana in modo Cre-dipendente.

Imaging time-lapse dell'arborizzazione neuronale utilizzando l'etichettatura del virus adeno-associato sparso di popolazioni di cellule retiniche geneticamente mirate

Questo protocollo presenta come quantificare l'efficienza di trasduzione AAV nella retina del topo utilizzando la PCR a goccia digitale (dd-PCR) insieme alla produzione di AAV su piccola scala, all'iniezione intravitreale, all'imaging retinico e all'isolamento del DNA genomico retinico.

Metodo Digital Droplet PCR per la quantificazione dell'efficienza di trasduzione AAV nella retina murina

In questo manoscritto, l'iniezione subcongiuntivale è dimostrata come un valido metodo di somministrazione vettoriale per i tessuti oculari nei topi utilizzando un sistema di iniezione costituito da una pompa a siringa per infusione/prelievo e una siringa rimovibile a tenuta di gas accoppiata con aghi di microiniezione. Questo sistema di iniezione è adattabile anche ad altre vie di somministrazione intraoculare.

Somministrazione subcongiuntivale di vettori virali adeno-associati in modelli di piccoli animali

Il virus adeno-associato viene prodotto in coltura cellulare in sospensione e purificato mediante centrifugazione a gradiente di densità a doppio iodixanolo. Sono incluse misure per aumentare la resa totale del virus, diminuire il rischio di precipitazione del virus e concentrare ulteriormente il prodotto finale del virus. I titoli finali attesi raggiungono10-12 particelle virali/mL e sono adatti per l'uso preclinico in vivo .

Produzione e purificazione in coltura in sospensione di virus adeno-associati mediante centrifugazione a gradiente di densità di iodixanolo per applicazioni in vivo

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la generazione e la purificazione di vettori virali adeno-associati utilizzando un metodo cromatografico di affinità ottimizzato a base di eparina. Presenta un approccio semplice, scalabile ed economico, eliminando la necessità di ultracentrifugazione. I vettori risultanti mostrano un'elevata purezza e attività biologica, dimostrando il loro valore negli studi preclinici.

Isolamento di vettori virali adeno-associati attraverso un protocollo cromatografico di affinità con eparina a passaggio singolo e semiautomatico

Scopri come utilizzare i virus adeno-associati per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica e l'integrità della membrana limitante interna in modelli animali di malattia retinica.

Utilizzando virus adeno-associati come strumento per studiare le barriere della retina nella malattia

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