Caratterizzazione funzionale di Na ⁺ / H ⁺ Scambiatori di intracellulare compartimenti, utilizzando Proton-uccidere selezione di esprimerle livello della membrana plasmatica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare l'attività degli scambiatori di protoni di sodio espressi intracellularemente. Ciò si ottiene selezionando prima le cellule che esprimono gli scambiatori intracellulari di protoni di sodio sulla membrana plasmatica mediante la selezione dell'uccisione del protone. In una seconda fase, le cellule selezionate vengono acidificate e quindi viene misurato il recupero del pH intracellulare per confermare l'attività di scambio protonico del sodio delle cellule.

La cinetica veloce del trasporto ionico viene quindi misurata per determinare le costanti di affinità per il catione trasportato e gli inibitori. In definitiva, il monitoraggio delle variazioni del pH intracellulare e della cinetica veloce delle cellule somatiche selezionate consente la caratterizzazione funzionale dello scambio proteico intracellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'espressione di trasportatori mutanti o l'utilizzo di per cellule, è che consente l'espressione di trasportatori intracellulari di tipo bianco sulla membrana plasmatica, rendendo possibile misurare direttamente la loro funzione.

A dimostrare la procedura sarà il Dr.Mallory poet, uno scienziato ricercatore del mio laboratorio per iniziare la procedura di uccisione dei protoni. In primo luogo, incubare le cellule che esprimono lo scambiatore intracellulare di protoni di sodio di interesse per caricare la soluzione a 37 gradi Celsius e un incubatore privo di anidride carbonica per un'ora. Quindi, aspirare la soluzione di carico e lavare le celle due volte con terreno fresco.

Dopo il secondo lavaggio, aspirare il terreno e incubare le cellule in soluzione di recupero in un incubatore privo di anidride carbonica. Dopo un'altra ora, sostituire il terreno di recupero con un normale terreno di coltura e far crescere le cellule in condizioni di coltura standard. Ripetere questo ciclo di selezione due volte alla settimana fino a quando emergono cloni stabili per visualizzare il pH della fluorescenza intracellulare delle cellule.

Per prima cosa è stato equipaggiato un set di imaging costituito da un microscopio invertito accoppiato a una videocamera ad alta sensibilità con filtri di interferenza a banda stretta da 450 nanometri e 490 nanometri abbinati agli appropriati filtri a densità neutra al quarzo per l'eccitazione. Se possibile, utilizzare il set appropriato di filtri e condizioni di illuminazione per impostare valori di fluorescenza comparabili per i canali uno e due in modo che il rapporto si avvicini a uno per misurare l'attività diretta dello scambiatore protonico di sodio. Successivamente, acidificare le cellule con un'incubazione di un'ora in una soluzione di carico di ammonio.

In assenza di anidride carbonica, durante gli ultimi cinque minuti dell'incubazione, colorare le cellule con un rapporto metrico pH sensibile alla fluorescenza muoiono. Al termine del periodo di incubazione, rin le cellule con soluzione di carico di ammonio per eliminare la sonda extracellulare e montare le cellule colorate sul microscopio. Selezionare le regioni di interesse in cui verranno misurati i valori di fluorescenza in modo appropriato.

Quindi registrare diverse immagini per stabilire una linea di base e perfondere le cellule con la soluzione RIN per avviare un calo della fluorescenza. Dopo che il pH si è stabilizzato, esaminare le cellule con la soluzione di interesse per misurare i tassi di recupero del pH mediati dallo scambio di idrogeno di litio, idrogeno di sodio o idrogeno di potassio. Ora esamina le cellule con la soluzione di hippie integrata con cloruro di potassio e gerin.

Quindi raccogli le misurazioni della fluorescenza dalle immagini ed esporta i dati in un foglio di calcolo in formato testo per misurare la velocità iniziale dello scambiatore di protoni di sodio. Sette, mediante un rapido assorbimento del litio, acidificano le celle e le piastre multipozzetto con la tecnica di caricamento Imodium, come appena dimostrato. Quindi, sciacquare le piastre due volte rapidamente come appena dimostrato.

Quindi incubare le cellule in soluzioni di assorbimento contenenti da uno a 10 micromolari di litio e le concentrazioni desiderate del catione o degli inibitori di interesse per circa un minuto o meno alla fine del periodo di assorbimento, rimuovere con cura il mezzo di assorbimento e lavare rapidamente le cellule quattro volte con PBS ghiacciato in meno di 10 secondi in totale per prevenire l'efflusso di litio, quindi lisare le cellule in 250 microlitri di acido nitrico al 25% per bene per almeno un'ora. Raschiando ogni pozzetto con l'estremità del puntale della pipetta al termine dell'incubazione e trasferendo le sospensioni da ciascun pozzetto in nuove provette per microcentrifuga. Infine, centrifugare i campioni per cinque minuti a 15.000 G a temperatura ambiente per rimuovere i detriti cellulari e quindi misurare il contenuto di litio della snat mediante spettroscopia di assorbimento atomico.

Secondo le istruzioni del produttore, la selezione dell'uccisione protonica si basa sulla diffusione della base debole dell'ammonio. Ad esempio, le cellule che non esprimono uno scambiatore di protoni di sodio funzionale sulla membrana plasmatica non possono recuperare un valore di pH neutro e quindi mostrano un tipico aspetto acidificato con una forma piatta e un citosol granulare come si vede in questa immagine rappresentativa dopo ripetuti cicli di selezione, cellule che sopravvivono completamente e stabilmente. L'acidificazione, tuttavia, forma singoli cloni cellulari come si vede qui, come dimostrato l'attività e la selettività ionica degli scambiatori intracellulari di protoni di sodio espressi sulla membrana plasmatica possono essere caratterizzate misurando le variazioni del pH intracellulare indotte in varie condizioni sperimentali, come osservato in questi grafici dopo l'acidificazione del carico di Imodium.

Per quanto riguarda la cinetica enzimatica, la dose-risposta per i tassi di assorbimento iniziale può essere ulteriormente utilizzata per derivare i valori della costante di affinità per i substrati e per i valori della costante di inibizione degli inibitori. Infatti, una caratteristica interessante dei trasportatori è che diversi cationi di accoppiamento competeranno per il trasporto, dando la possibilità di misurare la costante di affinità per il sodio in competizione con l'assorbimento di litio come dimostrato in questa figura Seguendo questa procedura. Altri esperimenti come la bioinnovazione sulla superficie cellulare accoppiata al silenziamento dell'RNA possono essere eseguiti per verificare che il trasportatore di interesse sia effettivamente espresso sulla membrana plasmatica.