Name: Caratterizzazione funzionale di Na + / H + Scambiatori di intracellulare compartimenti, utilizzando Proton-uccidere selezione di esprimerle livello della membrana plasmatica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Scopri la caratterizzazione funzionale degli scambiatori Na+/H+ intracellulari mediante selezione per uccisione protonica. Questo metodo consente di misurare direttamente l'attività dei trasportatori espressi sulla membrana plasmatica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori sono profondamente in debito con tutti i membri della comunità scientifica che lavorano sul pH e sul trasporto ionico, che hanno originato e migliorato le misure qui descritte. Ringraziano in particolare il Dr. Jacques Pouysségur che ha dato origine alla tecnica di selezione H+-killing qui utilizzata. Ringraziano l'Università di Nizza-Sophia Antipolis, il CNRS, l'ANR (JCJC SVSE1 NHEint) e l'ICST Labex per il loro sostegno.

1. H + Uccidere Selezione <ol><li> Linee cellulari <ol><li> Stabilmente trasfettare cellule NHE-deficienti (ad esempio, il PS120 linea cellulare CCL39-derivato 16) utilizzando qualsiasi combinazione di mammiferi vettore di espressione e di metodo di trasfezione che produrrà rendimenti trasfezione efficienti e selezione in una linea cellulare di fibroblasti. NOTA: Per molti anni fosfato di calcio precipitazioni 19 è stato utilizzato con buoni rendimenti trasfezione. Questo è stato sostituito più recentemente da reagenti commerciali come Lipofectamine2000, le trasfezioni essere eseguiti seguendo le istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Soluzioni <ol><li> Preparare tre soluzioni sterili descritti di seguito. Sterilizzare queste soluzioni per filtrazione (0,22 micron). <ol><li> Preparare una soluzione di NH 4 + Loading (pH 7,4) comprendente 50 mM NH 4 Cl, 70 mM di cloruro di colina, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, GL 5 mMucose e 15 MOPS mm a pH 7.4. </li><li> Preparare una soluzione di risciacquo (pH 7,0) composto da 120 mM di cloruro di colina, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, glucosio 5 mM e 15 mM HEPES a pH 7,0. </li><li> Preparare una soluzione di ripristino (pH 7,4) compreso di 120 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM di glucosio e 15 mM HEPES a pH 7,4. </li></ol></li></ol></li><li> Prima di iniziare la selezione, ottenere un incubatore di coltura cellulare che può essere utilizzato a 37 ° C senza ulteriore CO 2 dal serbatoio esterno (chiamato CO 2 - incubatore &quot;libero&quot;), il 5% di CO 2 si tradurrà in buffer che possono compromettere la acidificazione. Amplifica la linea cellulare che esprime la NHE di interesse fino a circa 2 x 10 8 cellule (in genere circa 20 confluenti 100 piastre mm). </li><li> H + uccidendo procedura: <ol><li> Incubare le cellule che esprimono la intracellulare NHE di interesse per 1 ora in soluzione di caricamento, a 37 ° C in CO 2 incubatore -free. </li><li> Aspirare la soluzione di carico e quindi risciacquare due volte nella soluzione descritta sopra risciacquo. Eseguire questo passaggio efficiente per eliminare il residuo extracellulare NH 4 Cl che compromettano la creazione di una ripida NH 4 + gradiente che genererà l&#39;acidificazione. </li><li> Eliminare il mezzo risciacquo mediante aspirazione e incubare le cellule per un&#39;ora in soluzione di recupero di nuovo a 37 ° C in incubatore CO 2 libera. </li><li> Sostituire il mezzo di recupero con terreno di coltura regolare (tipicamente DMEM con 7,5% FCS) e far crescere le cellule in condizioni di coltura standard (37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 e il 95% di aria). </li></ol></li><li> Ripetere questo ciclo di selezione due volte a settimana fino cloni stabili emergono. NOTA: Prestare particolare attenzione per quanto riguarda la coltura cellulare e condizioni di selezione. Mesi di lavoro può essere rovinato da qualsiasi contaminazione che è più incline a oCCur dopo un lungo periodo di cultura e di manipolazioni cellulari ripetuti. <ol><li> Qui, scegliere se amplificare i cloni e caratterizzare singolarmente come descritto nelle sezioni 2-3, o in piscina insieme per generare una popolazione cellulare prima di caratterizzazione. </li></ol></li><li> Applicare selezione occasionali (circa una volta ogni due settimane) per trattenere le cellule acidificazione resistente by-counter selezionando quelle che possono riversati fenotipo di acido sensibile parentale (Figura 1B). </li></ol> 2. intracellulare pH Misurazioni 2.1) fluorescenza pH Imaging <ol><li> Utilizzare il raziometrico pH sensibile colorante fluorescente BCECF / AM, che è sensibile al pH quando eccitato a 490 nm e 445 nm possiede un punto isosbestic, seguendo i protocolli del produttore. <ol><li> In alternativa, utilizzare altre sonde pH-sensibili, seguendo i protocolli del produttore. </li></ol></li><li> Utilizzare un set con immaginiCONSISTONO di un microscopio invertito accoppiato ad una videocamera ad alta sensibilità. Dotare questo set con 450 nm e 490 nm filtri interferenza a banda stretta in coppia con quarzo opportuni filtri densità neutra per l&#39;eccitazione. <ol><li> Se possibile, utilizzare l&#39;insieme appropriato di filtri e delle condizioni di illuminazione a fluorescenza di impostazione valori confrontabili per λ1 e λ2 in modo che il rapporto si avvicina a 1. Evitare anche valori di fluorescenza basali impostati o saturare o troppo bassa, sia per λ1 e / o λ2. Questo può cedere manufatti importanti come allora il rapporto non può essere rilevabile anche se il pH intracellulare sta cambiando. NOTA: Il sistema deve consentire di perfusione rapida, time-lapse eccitazione a due lunghezze d&#39;onda di cui sopra e di acquisizione alla lunghezza d&#39;onda di emissione corretta (535 nm per BCECF). Dotare il sistema con software che consente l&#39;acquisizione automatica dei dati e di stoccaggio. </li></ol></li></ol> 2.2) Misura della NHE Forward Activity (Estrusione diI protoni dal citoplasma) <ol><li> Acidificare cellule da una incubazione di 1 ora in soluzione di NH 4 + Loading (vedere il punto 1.4) in assenza di CO 2. </li><li> Aggiungere BCECF-AM (concentrazione finale 5 mM) alla soluzione per gli ultimi cinque minuti e quindi risciacquare con NH 4 + soluzione tampone per eliminare la sonda extracellulare. </li><li> Montare le celle del microscopio e prendere più immagini per registrare una linea di base stabile. Profumato soluzione di risciacquo (vedi sopra). Ciò si traduce in una diminuzione della fluorescenza corrispondente al acidificazione. </li><li> Dopo la stabilizzazione del pH, profumato una delle soluzioni indicate qui di seguito per misurare i tassi di recupero pH mediati da Li + / H +, Na + / H + o K + / H + scambio. Ogni soluzione contiene un potenziale cationico accoppiamento da testare per H + scambio. Se uno di questi è trasportata, questo si tradurrà in un aumento della fluorescenza a 495 nm che correspond ad un aumento del pH intracellulare: , Glucosio LiCl 120 mM, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2 5 mM e 15 mM HEPES a pH 7.4 , Glucosio 120 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2 5 mM e 15 mM HEPES a pH 7.4 , Glucosio 125 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2 5 mM e 15 mM HEPES a pH 7.4 </li></ol> 2.3) Misura della NHE Activity Reverse NOTA: Il principio è quello di invertire i gradienti ionici transmembrana. <ol><li> Prima della misura, caricare le cellule con il catione intracellulare di interesse (vedi sotto). </li><li> Incubare per 5 minuti con BCECF / AM (vedi punto 2.2.2); sciacquarle, montarli sul microscopio video. </li><li> Profumato la soluzione di carico e prendere più immagini per registrare una linea di base stabile. </li><li> Dopo la stabilizzazione della linea di base, immagine le variazioni di pH quando le cellule vengono perfusi con soluzione acida extracellulare contenente 120 mM cloruro di colina, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, il glucosio 5 mm e 15 mm a MES pH 6.5. </li><li> Per LiCl carico, incubare le cellule per 2 ore in una soluzione composta di 120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM di glucosio e 15 mM HEPES a pH 7,4. Litio intracellulare misurata mediante spettroscopia ad assorbimento atomico produce un valore di circa 60 mM. </li><li> Per Na + carico, incubare le cellule, per due ore in una soluzione composta di 120 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM di glucosio e 15 mM HEPES a pH 7,4 in presenza di 1 mM ouabain per bloccare la Na / K ATPasi. In queste condizioni, la concentrazione intracellulare Na + è nella gamma di 40 mM. NOTA: K + caricamento non è necessaria in quanto K + citosolico concentrazione nell&#39;intervallo 140 mM e un gradiente K + verso l&#39;esterno diretto è quindi facile da realizzare. </li></ol> 2.4) Il trattamento dei dati e calibrazione: NOTA: Questo passaggio si applica sia alle misure avanti e retromarcia. <ol><li> Al termine di ogni esperimento, profumato cellule con una soluzione di 140 mM KCl, 20 mM HEPES e 5 mM nigericin regolata a valori di pH tra 6,5 ​​e 7,4. </li><li> Raccogliere dati come misure di fluorescenza dalle immagini (livelli di grigio che rappresentano i livelli di intensità) e l&#39;esportazione in formato testo e trattare come spiegato di seguito con un programma di foglio di calcolo. </li><li> Calcolare i valori di pH intracellulare per ogni singola cella o regione di interesse utilizzando la seguente equazione: pH = pKa + (Log (R-Rmin) / (R max -R)) x F min (λ2) / F max (λ2) </li><li> Utilizzare l&#39;min F (λ2) / F ma x (λ2) rapporto se c&#39;è sonda sbianca o perdite, con conseguente diminuzione della fluorescenza a 450 nm durante gli esperimenti. Questo è comunque molto raramente osservata nelle condizioni utilizzate nel desEsperimenti Cribed. </li><li> Poiché sono presenti alla fine di ogni misurazione pH i dati di calibrazione, verificare se i corrispondenti valori calcolati differiscono dai valori di pH utilizzati per la calibrazione. Se è il caso, quindi regolare tutti i valori di pH sperimentalmente determinato alla calibrazione utilizzando la seguente procedura: <ol><li> Calcolare il seguente quoziente (Q, la differenza tra il valore misurato / differenza tra i valori di calibrazione). Moltiplicare l&#39;intero set di dati da Q. Effettuare la regolazione finale per addizione o sottrazione in modo che i valori calcolati saranno pari ai valori di taratura corrispondenti. </li></ol></li></ol> 3. Misurazioni di iniziali Tassi di NHE7 di veloce Li + assorbimento <ol><li> Cellule seme su lastre multiple e (da 6 a 24 pozzetti) e acidificare loro utilizzando la tecnica di NH 4 + carico descritto sopra o alternativamente la Nigericina / albumina di siero bovino (BSA) acidificazione descritto in 20. </li><li&gt; piastre Sciacquare due volte rapidamente utilizzando la soluzione di risciacquo sopra descritta e poi incubare le cellule in soluzioni di assorbimento contenenti 1-10 litio mm (leggermente al di sotto dei valori Km) e le concentrazioni desiderate di cationi e / o inibitori di interesse per l&#39;importo desiderato di tempo. </li><li> Mantenere brevi e coerenti durata di assorbimento (in genere un minuto o anche oltre) per garantire che il trasporto opera in tassi di condizioni iniziali. Assicurarsi inoltre che tutte le soluzioni utilizzate per l&#39;assorbimento è isotonico. </li><li> Alla fine del tempo di assorbimento, eliminare accuratamente il mezzo assorbimento e lavare le cellule quattro volte con soluzione salina fosfato ghiacciato tamponata (PBS). Eseguire questi lavaggi più velocemente possibile (meno di 10 sec per quattro di essi è ideale) per impedire litio efflusso. </li><li> Lyse le cellule del 25% di acido nitrico. Applicare 250 microlitri per pozzetto di 25% di acido nitrico e lasciate riposare per almeno 1 ora, poi rottami ogni pozzetto con l&#39;estremità della punta della pipetta e trasferire l&#39;intera sospensione bene in una nuova mitubo crocentrifuge. </li><li> Trasferire il lisato in provette da 1,5 ml microcentrifuga, li centrifugare per 5 minuti a 15.000 xg (temperatura ambiente) per rimuovere i detriti cellulari. </li><li> Misurare il contenuto di litio dei sopranatanti mediante spettroscopia ad assorbimento atomico 21. NOTA: Diverse aziende forniscono spettrometri di assorbimento atomico, che devono essere dotati di una batteria agli lampada a catodo cavo. Seguire le istruzioni del produttore in quanto queste macchine sono molto precise, ma anche molto delicato. </li></ol>

<ol><li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V-type+H%2B-ATPase+in+vesicular+trafficking%3A+targeting%2C+regulation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li>
<li>Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+and+the+endosomal-lysosomal+pathway%3A+emerging+roles+of+CLC+chloride+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters.</a> J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).</li>
<li>Kornak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+a3+subunit+of+the+vacuolar+H%28%2B%29-ATPase+cause+infantile+malignant+osteopetrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis.</a> Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).</li>
<li>Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ClC-5+chloride+channel+knock-out+mouse+-+an+animal+model+for+Dent%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease.</a> Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).</li>
<li>Kasper, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+chloride+channel+ClC-7+leads+to+lysosomal+storage+disease+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration.</a> Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).</li>
<li>Poet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+storage+disease+upon+disruption+of+the+neuronal+chloride+transport+protein+ClC-6%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).</li>
<li>Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+Na%2B%2FH%2B+exchanger+isoforms+are+distributed+to+Golgi+and+post-Golgi+compartments+and+are+involved+in+organelle+pH+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation.</a> J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC9A6+mutations+cause+X-linked+mental+retardation%2C+microcephaly%2C+epilepsy%2C+and+ataxia%2C+a+phenotype+mimicking+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome.</a> Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).</li>
<li>Mignot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mutation+in+SLC9A6+gene+in+a+patient+with+Christianson+syndrome+and+retinitis+pigmentosum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum.</a> Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).</li>
<li>Morrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+autism+loci+and+genes+by+tracing+recent+shared+ancestry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry.</a> Science. 321 (5886), 218-223 (2008).</li>
<li>Lasky-Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+scan+of+the+time+to+onset+of+attention+deficit+hyperactivity+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+B+Neuropsychiatr+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder.</a> Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).</li>
<li>Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+studies+in+ADHD%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association studies in ADHD.</a> Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).</li>
<li>Meda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+scale+multivariate+parallel+ICA+method+reveals+novel+imaging-genetic+relationships+for+Alzheimer%27s+disease+in+the+ADNI+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort.</a> Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microdeletion+in+Xp11.3+accounts+for+co-segregation+of+retinitis+pigmentosa+and+mental+retardation+in+a+large+kindred%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+A%22%5BJournal%5D)">A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred.</a> Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).</li>
<li>Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+primary+structure%2C+and+expression+of+the+human+growth+factor-activatable+Na%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter.</a> Cell. 56 (2), 271-280 (1989).</li>
<li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+mutation+abolishing+Na%2B%2FH%2B+antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li>
<li>Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+properties+of+fibroblast+mutants+overexpressing+an+altered+Na%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter.</a> J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).</li>
<li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intracellular+Na%2B%2FH%2B+Exchanger+NHE7+effects+a+Na%2B+coupled%2C+but+not+K%2B+coupled+proton-loading+mechanism+in+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis.</a> Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).</li>
<li>Wigler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+mammalian+cells+with+genes+from+procaryotes+and+eucaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes.</a> Cell. 16 (4), 777-785 (1979).</li>
<li>Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+the+activation+of+the+Na%2FH+exchanger+NHE-1+by+cytoplasmic+acidification+and+mitogens%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens.</a> EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).</li>
<li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenomic+Effects+of+Cisplatin%3A+Acute+Inhibition+of+Mechanosensitive+Transporters+and+Channels+without+Actin+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling.</a> Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).</li>
<li>Boron, W. F., De Weer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH+transients+in+squid+giant+axons+caused+by+CO2%2C+NH3%2C+and+metabolic+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors.</a> J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).</li>
<li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B-H%2B+exchange+in+gastric+glands+as+measured+with+a+cytoplasmic-trapped%2C+fluorescent+pH+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).</li>
<li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+image+processing+of+intracellular+pH+in+gastric+oxyntic+and+chief+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells.</a> Nature. 325, 447-450 (1987).</li>
<li>Quentin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhBG+and+RhCG%2C+the+putative+ammonia+transporters%2C+are+expressed+in+the+same+cells+in+the+distal+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).</li>
<li>Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+NH3+through+the+human+urea+transporter+B%3A+a+new+gas+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive come selezionare le cellule che esprimono intracellulare Na + / H + scambiatori a livello della membrana plasmatica, senza alterarne la sequenza primaria per mutagenesi sito-specifica. Questi scambiatori possono essere caratterizzati. Questo metodo si basa sulla tossicità cellulare di protoni intracellulari per selezionare linee cellulari che esprimono vescicolare Na + / H + scambiatori a livello della membrana plasmatica...

La maggior parte dei compartimenti intracellulari mostrano un pH luminale acido, che è un parametro fondamentale per la maturazione, il traffico, il riciclaggio di proteine ​​o ormoni e neurotrasmettitori loading. E &#39;stato dimostrato che il gradiente di pH tra contenuto citosol e vescicolare è generato da vacuolar H + ATPasi 1, accoppiato ad vescicolari trasportatori cloruro ClC 2. Sia in knock-out (KO) topi e pazienti umani, l&#39;importanza di questi trasportatori è stata evidenziata dai fenotipi pesanti causate da mutazioni nei loro geni 3-6. I membri della famiglia SLC9A scambiatori sodio-idrogeno, anche chiamati NHEs per Na + / H + scambiatori, hanno dimostrato di essere effettori chiave pH intracellulare e regolazione del volume cellulare, così come nel trasporto vettoriale di equivalenti acido-base di tutti gli epiteli . Oltre alle NHEs membrana plasmatica, tre altamente conservati Na + / H + scambiatori, NHE 6, 7e 9 sono espressi in rete trans-Golgi e in endosomi precoci 7. Le mutazioni nei loro geni sono stati associati con l&#39;autismo basato sulla famiglia 10 e Attention Deficit Hyperactivity Disorder Angelman-like o Christianson Sindromi 8-9 11-12. Questi scambiatori sono stati coinvolti in problemi neurodegenerative quali la malattia di Alzheimer suscettibilità 13 e collegata a X ritardo mentale geni contigui SINDROMI 14. Presi insieme, questi studi sottolineano l&#39;importanza di questi NHEs intracellulari di sviluppo e / o la funzione del cervello. La localizzazione intracellulare di questi scambiatori impedisce misurazioni accurate delle loro selettività ionica, direzione di trasporto, i parametri cinetici e regolazione. Come è il caso per tutti i trasportatori espressi in compartimenti intracellulari, è estremamente difficile valutare le loro attività biochimiche e quindi di comprendere appieno i loro ruoli fisiologici e meccanismi sottostanti le loro implicazioni patologiche. Sulla base della concentrazione citosolica K +, l&#39;ipotesi più comunemente accettata era che stavano lavorando come K + accoppiati protoni trasportatori di efflusso. L&#39;esistenza di tale perdita protonica era stato ipotizzato, come può controbilanciare protonica pompaggio dalle V-ATPasi al fine di mantenere uno stato stazionario vescicolare pH. Lo scopo di questo articolo visiva è (i) un metodo per dimostrare che permette la selezione genetica di linee cellulari che esprimono tali trasportatori vescicolari al loro membrana plasmatica, e (ii) mostrano due approcci indipendenti per misurare le funzioni di questi trasportatori. Tre decenni fa, Pouysségur e Franchi hanno sperimentato un approccio genetico che ha permesso la clonazione molecolare e la caratterizzazione dei membri della famiglia NHE 15. Questa era basata sulla tossicità di protoni intracellulari come metodo di screening. Il primo passo è stato quello di ottenere linee di cellule deficientiin qualsiasi / H scambio Na + + espresso a livello della membrana plasmatica, utilizzando la reversibilità di questo trasportatore. I fibroblasti (linea cellulare CCL39) sono stati precaricati con Na + o Li + e poi poste in un mezzo extracellulare acido (pH 6,5) per 2 ore. Ciò ha portato alla morte di cellule esprimenti un funzionale Na + / H + scambio e la selezione di celle antiporter-deficienti (linea cellulare PS120) 16. Quando coltivate in terreno privo di bicarbonato, queste cellule sono molto sensibili all&#39;acidificazione intracellulare acuta. Di conseguenza, l&#39;espressione di un meccanismo di protoni efflusso funzionale a livello della membrana plasmatica sarà selezionato positivamente (vedi 17) se tali cellule sono sottoposte a acidificazioni intracellulari acute. Tali tecniche acidificazione possono essere utilizzati per isolare linee cellulari con traffico difetti che consentono l&#39;espressione forzata di NHEs intracellulari WT a livello della membrana plasmatica. Come eucarioti Na + / H+ Scambiatori sono elettricamente neutro, non sono misurabili dagli approcci elettrofisiologici che sono stati utilizzati con successo per misurare canali. Questo manoscritto dimostra quindi come misurare l&#39;attività di questo scambiatore per misure di pH intracellulari e rapidi cinetica di assorbimento di litio. Poiché i concetti di base sono gli stessi, è interessante notare che molti dei processi sviluppati per la sezione di selezione vengono anche utilizzate direttamente per misurazioni funzionali. È interessante notare, abbiamo osservato che il difetto traffico presente nelle linee cellulari selezionate utilizzando l&#39;approccio descritto in questo manoscritto porta ad una maggiore espressione di altre proteine ​​vescicolari alla membrana plasmatica, come il canale del potassio vescicolare TWIK1 18. Questo indica verso la selezione di un meccanismo di ritenzione difetto generale per proteine ​​transmembrana vescicolari. Quindi questa procedura di selezione e le cellule che genera maggiocostituiscono uno strumento promettente per la comunità scientifica lavorare sulle proteine ​​di membrana di compartimenti intracellulari. Come pure le tecniche di misurazione qui presentate potrebbero essere applicabili per studiare altri trasportatori non elettrogeniche.

<table><tbody><tr><td>Attrezzatura</td><td></td><td></td> standard per colture cellulari <td>Utilizzato per la selezione dell'uccisione dell'H+ composta da molti dispositivi con diversi numeri di catalogo</td></tr><tr><td>Incubatore con CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore senza CO2</td><td>Heraeus Strumento</td><td>BB6220</td><td></td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare PSM1200NF</td><td>Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>52010120</tr><tr><td>DMEM medio</td><td>sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS oro</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/streptomicina</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro ad assorbimento atomico con sistema di forni Zeeman</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>Acido nitrico</td><td>sigma</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Set di videomicroscopia a fluorescenza</td><td>Leica</td><td></td><td>Composto da molti dispositivi con diversi numeri di catalogo</td></tr><tr><td>Microscopio automatizzato invertito</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>supporto per microscopio</td><td>leica</td><td>11888906</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> 11505180 <td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>fluorescenza incidente</td><td>Leica</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11504166</td><td></td></tr><tr><td>staffa motore</td><td>Leica</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>Luce di trasmissione a LED&nbsp;</td><td>Piastra motorizzata Leica</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521580</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>11522068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11531172</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>11888424</tr><tr><td>uscita telecamera</td><td>Leica</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>software di acquisizione/analisi immagini</td><td>Leica</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>ottica</td><td>leica</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243</td> 11506203 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fluorescenza lampada allo xeno</td><td>leica</td><td>telecamera DMI6000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>hamamatsu</td><td>8100601</td><td></td></tr><tr><td>software</td><td></td> metafluor/Mmfluor <td>11640905</td><td></td></tr><tr><td>sonda sensibile al pH, BCECF-AM</td><td>life technologies</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione funzionale di na<sup&gt; +</sup&gt; / h<sup&gt; +</sup&gt; scambiatori di intracellulare compartimenti, utilizzando proton-uccidere selezione di esprimerle livello della membrana plasmatica

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Acidificazione endosomali è critica per una vasta gamma di processi, quali il riciclaggio proteica e la degradazione, desensibilizzazione del recettore, e neurotrasmettitore caricamento in vescicole sinaptiche. Questo acidificazione è descritto per essere mediato da ATPasi protonica, insieme ai trasportatori di cloruro CLC. Altamente conservata protoni elettricamente trasportatori, la Na + / H + scambiatori (NHE) 6, 7 e 9 sono espresse anche in questi comparti. Le mutazioni nei loro geni sono stati collegati con le malattie cognitive e neurodegenerative umane. Paradossalmente, i loro ruoli rimangono elusivi, come la loro localizzazione intracellulare ha impedito dettagliata caratterizzazione funzionale. Questo manoscritto mostra un metodo per risolvere questo problema. Questo consiste nella selezione di linee cellulari mutanti, capaci di sopravvivere acidificazione citosolica acuta mantenendo NHEs intracellulari alla membrana plasmatica. Quindi raffigura due protocolli complementari per misurare la selettività e attività ionicadi questi scambiatori: (i) una basata su misurazioni di pH intracellulare mediante videomicroscopia a fluorescenza, e (ii) uno basato sulla cinetica veloci di litio assorbimento. Tali protocolli possono essere estrapolati per misurare altri trasportatori non elettrogeniche. Inoltre, la procedura di selezione qui presentata genera cellule con fenotipo ritenzione intracellulare difettoso. Pertanto queste cellule esprimono anche altre proteine ​​di membrana vescicolare a livello della membrana plasmatica. La strategia sperimentale descritta qui può quindi costituire uno strumento potenzialmente efficace per studiare altre proteine ​​intracellulari che saranno poi espressi a livello della membrana plasmatica insieme con la vescicolare Na + / H + scambiatori usati per la selezione.

Selezione: La selezione + uccidendo H si basa sulla diffusione della ammonio base debole, come illustrato nella Figura 1A. L&#39;effetto di basi deboli e acidi diffusione sul pH intracellulare è stata introdotta da Walter Boron e collaboratori 22. L&#39;elegante idea di utilizzare questo fenomeno per la produzione di una acidificazione letale per la selezione genetica positiva è stata poi sviluppata da Jacques Pouysségur 17. Sotto tale protoc...

La prima parte di questo articolo mostra come selezionare linee cellulari mutanti che esprimono scambiatori vescicolari Na+/H+ sulla loro membrana plasmatica. La seconda parte fornisce protocolli basati su misure di pH intracellulare e rapido assorbimento di ioni, che vengono utilizzati per determinare la selettività ionica e i parametri cinetici di questi scambiatori.

Caratterizzazione funzionale di Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Scambiatori di intracellulare compartimenti, utilizzando Proton-uccidere selezione di esprimerle livello della membrana plasmatica

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare l'attività degli scambiatori sodio-protona espressi all'interno della cellula. Questo viene ottenuto innanzitutto selezionando le cellule che esprimono gli scambiatori sodio-protona intracellulari a livello della membrana plasmatica mediante selezione per morte protonica. Come secondo passaggio, le cellule selezionate vengono acidificate e successivamente viene misurata la ripresa del pH intracellulare per confermare l'attività di scambio sodio-protona delle cellule.Le cinetiche rapide del trasporto ionico vengono quindi misurate per determinare le costanti di affinità per il catione trasportato e per gli inibitori. Alla fine, il monitoraggio delle variazioni del pH intracellulare e delle cinetiche rapide delle cellule somatiche selezionate consente la caratterizzazione funzionale dello scambio proteico intracellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'espressione di trasportatori mutanti o l'uso di cellule per, è che permette l'espressione di trasportatori intracellulari di tipo selvaggio sulla membrana plasmatica, rendendo possibile misurare direttamente la loro funzione.La procedura sarà dimostrata dal dottor Mallory Poet, scienziato ricercatore del mio laboratorio. Per iniziare la procedura di rilevamento del trasporto protonico, incubare prima le cellule che esprimono l'antiporto sodio-protonico intracellulare di interesse in soluzione di carico a 37 gradi Celsius e in un incubatore privo di anidride carbonica per un'ora. Successivamente, aspirare la soluzione di carico e lavare le cellule due volte con mezzo fresco.Dopo il secondo lavaggio, aspirare il mezzo e incubare le cellule in soluzione di recupero in un incubatore privo di anidride carbonica. Dopo un'ulteriore ora, sostituire il mezzo di recupero con mezzo di coltura normale e coltivare le cellule in condizioni di coltura standard. Ripetere questo ciclo di selezione due volte alla settimana fino a quando emergono cloni stabili per l'analisi della fluorescenza intracellulare del pH delle cellule.Prima di tutto, è stato allestito un sistema di imaging costituito da un microscopio invertito abbinato a una videocamera ad alta sensibilità, equipaggiato con filtri ad interferenza a banda stretta a 450 nanometri e 490 nanometri, abbinati ai corrispondenti filtri neutri in quarzo per la densità ottica per l'eccitazione. Se possibile, utilizzare l'apposito set di filtri e condizioni di illuminazione per impostare valori di fluorescenza comparabili per i canali uno e due, in modo che il rapporto si avvicini a uno, al fine di misurare l'attività diretta dello scambiatore sodio-protoni. Successivamente, acidificare le cellule mediante incubazione di un'ora in soluzione di carico con ammonio.In assenza di biossido di carbonio durante gli ultimi cinque minuti dell'incubazione, colorare le cellule con un colorante fluorescente sensibile al pH di tipo ratio metrico. Al termine del periodo di incubazione, risciacquare le cellule con soluzione di caricamento di ammonio per eliminare la sonda extracellulare e montare le cellule colorate sul microscopio. Selezionare le regioni di interesse dove verranno misurati i valori di fluorescenza in modo appropriato.Quindi acquisire diverse immagini per stabilire una linea di base e perfondere le cellule con la soluzione RIN per indurre una diminuzione della fluorescenza. Una volta che il pH si è stabilizzato, perfondere le cellule con la soluzione di interesse per misurare le velocità di recupero del pH mediate dagli scambiatori idrogeno-litio, idrogeno-sodio o idrogeno-potassio. Successivamente, perfondere le cellule con la soluzione di hippies integrata con cloruro di potassio e gerin.Quindi raccogliere le misurazioni della fluorescenza dalle immagini ed esportare i dati in un programma per fogli elettronici in formato testo per misurare la velocità iniziale dello scambiatore di sodio-protoni. Sette, mediante rapido assorbimento di litio, acidificare le cellule e le piastre a pozzetti multipli con la tecnica di carico di Imodium appena illustrata. Successivamente, risciacquare le piastre due volte rapidamente come appena dimostrato.Quindi incubare le cellule in soluzioni di assorbimento contenenti da uno a 10 micromolar di litio e le concentrazioni desiderate del catione o degli inibitori di interesse per circa un minuto o meno. Al termine del periodo di assorbimento, rimuovere con attenzione il mezzo di assorbimento e lavare rapidamente le cellule quattro volte con PBS freddo di ghiaccio in meno di 10 secondi complessivi per prevenire l'efflusso di litio; quindi lisare le cellule in 250 microlitri di acido nitrico al 25% per pozzetto per almeno un'ora. Raschiare ogni pozzetto con l'estremità della punta della pipetta al termine dell'incubazione e trasferire le sospensioni da ogni pozzetto in nuove provette microcentrifuga. Infine, centrifugare i campioni per cinque minuti a 15.000 G a temperatura ambiente per rimuovere i detriti cellulari, quindi misurare il contenuto di litio del surnatante mediante spettroscopia di assorbimento atomico.Secondo le istruzioni del produttore, la selezione per uccisione mediante protoni si basa sulla diffusione della base debole ammonio. Ad esempio, le cellule che non esprimono un eschiatore sodio-protoni funzionale a livello della membrana plasmatica non riescono a ripristinare un valore neutro di pH e mostrano quindi un aspetto tipicamente acidificato, con forma appiattita e citoplasma granulare, come visibile in questa immagine rappresentativa dopo cicli ripetuti di selezione. Le cellule che sopravvivono in modo completo e stabile, tuttavia, formano cloni cellulari individuali, come mostrato qui. L'attività e la selettività ionica degli scambiatori intracellulari sodio-protoni espressi a livello della membrana plasmatica possono essere caratterizzate misurando le variazioni del pH intracellulare indotte in diverse condizioni sperimentali, come osservato in questi grafici dopo l'acidificazione indotta dal carico con Imodium.Per quanto riguarda la cinetica enzimatica, la risposta dose-dipendente per i tassi iniziali di assorbimento può essere ulteriormente utilizzata per ricavare i valori della costante di affinità per i substrati e i valori della costanti di inibizione per gli inibitori. In effetti, una caratteristica interessante dei trasportatori è che diversi cationi accoppiati competono per il trasporto, permettendo così la misurazione della costante di affinità per il sodio mediante competizione con l'assorbimento di litio, come dimostrato in questa figura seguendo questa procedura. Altri esperimenti, come il BioInnovation della superficie cellulare abbinato all'interferenza dell'RNA, possono essere eseguiti per verificare che il trasportatore di interesse sia effettivamente espresso sulla membrana plasmatica.

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descriviamo un metodo per quantificare l'attività delle ATPasi di tipo P che controtrasportano K+ mediante l'espressione eterologa degli enzimi negli ovociti di Xenopus e misurando l'assorbimento di Rb+ o Li+ nelle singole cellule mediante spettrofotometria di assorbimento atomico. Il metodo è un'alternativa sensibile e sicura agli esperimenti di flusso di radioisotopi, facilitando studi cinetici complessi.

Misurazione di trasporto cationico da Na, K e H, K-ATPasi<em&gt; Xenopus</em&gt; Gli oociti per spettrofotometria di assorbimento atomico: una alternativa a saggi radioisotopi

L'elettroporazione è stata utilizzata per inserire proteine effettrici di virulenza batterica purificate direttamente nelle cellule eucariotiche viventi. La localizzazione delle proteine è stata monitorata mediante microscopia confocale a immunofluorescenza. Questo metodo consente studi sul traffico, la funzione e le interazioni proteina-proteina utilizzando proteine esogene attive, evitando la necessità di espressione eterologa nelle cellule eucariotiche.

Elettroporazione di effettori batterici funzionali in cellule di mammifero

I proteoliposomi vengono utilizzati per studiare canali purificati e trasportatori ricostituiti in un ambiente biochimico ben definito. Viene illustrata una procedura sperimentale per misurare l'efflusso mediato da queste proteine. Vengono descritti i passaggi per preparare i proteoliposomi, eseguire le registrazioni e analizzare i dati per determinare quantitativamente le proprietà funzionali della proteina ricostituita.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay per determinare le proprietà singola molecola di Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canali e trasportatori

aritmie cardiache ereditarie sono spesso causate da mutazioni che alterano la consegna di superficie di uno o più canali ionici. Qui, ci adattiamo citometria a flusso saggi di fornire una quantificazione della espressione proteica totale e superficie cellulare relativa dei canali ionici ricombinanti espressi in TSA-201 cellule.

Determinazione del relativo cellulari di superficie e di espressione totale di canali ionici ricombinante in citometria a flusso

Questo manoscritto descrive le applicazioni di elettrodi selettivi protone e patch metodi di bloccaggio per misurare l'attività dei sistemi di trasporto di protoni. Questi metodi di superare alcuni limiti delle tecniche comunemente usate per studiare l'attività di trasporto di protoni, come moderata sensibilità, risoluzione temporale e controllo insufficiente milieu intracellulare.

Applicazione di misura di elettrofisiologia di studiare l'attività dei trasportatori di Electro-neutro

Qui presentiamo un protocollo per esprimere, solubilizzano e purificare diversi trasportatori eucariotiche borato con omologia alla famiglia del trasportatore del SLC4 usando lievito. Inoltre descriviamo un'analisi cross-linking chimica per valutare le proteine purificate homomeric per multimerici Assemblea. Questi protocolli possono essere adattati per altre proteine di membrana impegnativo.

Espressione, solubilizzazione e purificazione dei trasportatori eucariotiche borato

Descriviamo un metodo per la caratterizzazione dei trasportatori a membrana protonica in preparati a vescicolo a membrana prodotti dall'espressione etesologa in E. coli e lisi di cellule che utilizzano una pressa francese.

Caratterizzazione dei trasportatori a membrana di Eterologous Expression in E. coli e produzione di membrane

Questo protocollo presenta un metodo per misurare il legame dei nucleotidi adenina ai recettori in tempo reale in un ambiente cellulare. Il legame è misurato come trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) tra derivati del nucleotide trinitrofenile e proteine marcate con un amminoacido fluorescente non canonico.

Misurare il legame nucleotidico a proteine di membrana intatte e funzionali in tempo reale

I nanocorpi sono strumenti importanti in biologia strutturale e rappresentano un grande potenziale per lo sviluppo di terapie. Tuttavia, la selezione di nanocorpi con proprietà inibitorie può essere impegnativa. Qui dimostriamo l'uso dell'elettrofisiologia basata sulla membrana supportata da solidi (SSM) per la classificazione di nanocorpi inibitori e non inibitori che prendono di mira i trasportatori di membrana elettrogenici.

Selezione di nanocorpi inibitori mirati al trasportatore mediante elettrofisiologia basata su membrana supportata da solidi (SSM)

Questo articolo presenta un protocollo di isolamento della membrana plasmatica su piccola scala per la caratterizzazione della proteina Cdr1 della Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), sovraespressa in Saccharomyces cerevisiae. Un doppio tag mGFPHis C-terminale scisso con un linker a 16 residui tra Cdr1 e il tag è stato progettato per facilitare la purificazione e lo screening detergente di Cdr1.

Preparazione della membrana plasmatica su piccola scala per l'analisi di Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Questo protocollo descrive un metodo per lo studio delle proteine di membrana elettrogeniche misurando le variazioni del potenziale di membrana. Questo test fornisce una piattaforma per la lettura funzionale di più canali ionici espressi endogenamente in linee cellulari epiteliali.

Un saggio basato sulla fluorescenza del potenziale di membrana per lo studio funzionale ad alta produttività di due canali ionici endogeni in due linee cellulari epiteliali

Scopri la caratterizzazione funzionale degli scambiatori Na+/H+ intracellulari mediante selezione per uccisione protonica. Questo metodo consente di misurare direttamente l'attività dei trasportatori espressi sulla membrana plasmatica.

Caratterizzazione funzionale di Na + / H + Scambiatori di intracellulare compartimenti, utilizzando Proton-uccidere selezione di esprimerle livello della membrana plasmatica (Video) | JoVE Journal

Caratterizzazione funzionale di Na

Esplora altri video