Generazione di Murine Cardiac pacemaker aggregati di cellule Sulla base ES-Cell-programmazione in combinazione con MYH6-Promoter-Selection

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule linfonodali sinusali altamente pure. Ciò si ottiene inducendo prima la differenziazione cellulare modificando il mezzo e creando gocce pendenti che provocano la formazione di corpi embrionali di dimensioni definite. Successivamente, i corpi embrionali vengono posizionati su un piatto rivestito di gelatina in modo da formare uno strato cellulare.

Quindi viene avviata la selezione degli antibiotici e sopravvivono solo i cardiomiociti. Infine, lo strato cellulare viene dissociato per ottenere cellule nodali a singolo seno a battimento rapido o piccoli corpi nodali del seno. In definitiva, l'imaging di cellule vive viene utilizzato per mostrare alte frequenze di battimento delle cellule linfonodali del seno.

Il vantaggio principale di questo metodo è che è possibile produrre cellule linfonodali sinusali altamente pure, ad esempio, per i test antidroga. Il metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nella malattia del nodo del seno perché le cellule ci daranno informazioni sui meccanismi sottostanti. La tecnologia sarà presentata in laboratorio da Julia Yung, la nostra dottoranda che ha sviluppato il metodo, a partire da una linea cellulare ES e cellule staminali pluripotenti co-coltivate con cellule feeder irradiate come delineato nel protocollo di testo due giorni prima che la procedura di differenziazione rimuovesse le PSC dalle cellule feeder aspirando prima il terreno.

Utilizzare 10 millilitri di PBS per lavare le cellule. Quindi aggiungere sette millilitri di soluzione di collagenasi quattro e incubare le cellule per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi posizionare un filtro sterile da 40 micrometri in una provetta da 50 millilitri.

Quindi sciacquare accuratamente le colonie di PSC pipettando la soluzione di collagenasi su e giù cinque volte. Trasferire la sospensione cellulare nel filtro e utilizzare otto millilitri di PBS per risciacquare il filtro tre volte. Quindi capovolgere il filtro e metterlo a testa in giù in una capsula di Petri e pipettare 10 millilitri di PBS sul fondo del filtro.

Per rimuovere le colonie di PSC, trasferire ora la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri e centrifugare per cinque minuti a 300 volte. G. Rimuovere il PBS, sospendere le cellule in un millilitro di Accutane e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 millilitri di PBS.

Mescolare la soluzione cellulare pipettando su e giù cinque volte e centrifugare per cinque minuti a 300 volte G.Una volta rimosso il PBS, utilizzare 10 millilitri di terreno di coltura cellulare per risospendere le cellule e determinare il numero di cellule seme. 15.000 cellule per centimetro quadrato in un pallone filtrante da 75 centimetri quadrati e coltivarle per due giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica quando il pallone dovrebbe essere 50 al 70% confluente. Dopo aver raccolto le cellule e aver sospeso Resus nel mezzo di differenziazione secondo il protocollo di testo, pipettare 20 millilitri di acqua e cinque millilitri di goccia sospesa o soluzione HD in una capsula di Petri quadratica per evitare di seccare l'hds.

Quindi, pipettare fino a 50 millilitri di sospensione cellulare in un vassoio. Quindi capovolgere il coperchio della capsula di Petri e, utilizzando una pipetta a 12 canali, posizionare sul coperchio 180 HDS contenenti ciascuno 20 microlitri di sospensione cellulare. Capovolgere con cautela il coperchio e posizionarlo sulla capsula di Petri.

Dopo aver incubato per due giorni per far formare le cellule, capovolgere con cura il coperchio della piastra di Petri quadratica e trasferire l'EBS derivato da due piastre di Petri in una provetta da 50 millilitri. Attendere 10 minuti per lasciare che l'EBS si depositi sul fondo della provetta, quindi aspirare quanto più terreno possibile. Utilizzare 10 millilitri di terreno di differenziazione per sospendere l'EBS e trasferire la sospensione in una piastra di Petri da 10 centimetri.

Una volta che le cellule sono state coltivate in sospensione per quattro giorni, secondo il protocollo di testo, trasferire l'EBS in una piastra di coltura cellulare di 10 centimetri quadrati rivestita di gelatina e incubare nei successivi due-sei giorni al microscopio, controllare le cellule per i focolai di battitura e la formazione di uno strato cellulare tre giorni dopo che le cellule hanno iniziato a battere, Aspirare il terreno e aggiungere 10 millilitri di differenziazione fresca. Terreno contenente 400 microgrammi per millilitro di G quattro 18 alle cellule quattro giorni dopo. Rimuovere con cautela il terreno senza aspirare lo strato cellulare.

Quindi aggiungere 10 millilitri di PBS per lavare le cellule. Dopo aver rimosso con cura il PBS, aggiungere 10 millilitri di soluzione di collagenasi quattro e trasferire le cellule in una provetta da 50 millilitri. Successivamente, dopo l'incubazione a 37 gradi Celsius per cinque minuti, mescolare energicamente la sospensione pipettando su e giù 10 volte e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per altri cinque minuti.

Dovrebbe essere presente una sospensione di piccoli grappoli. Quindi aggiungere 20 millilitri di PBS e centrifugare per 10 minuti a 300 volte. G, aspirare con cura il PBS e se si generano corpi sino-atriali indotti o sabs, utilizzare 12 millilitri di terreno di differenziazione contenente 400 microgrammi per millilitro di G quattro 18 per Resus, sospendere le cellule e vedere due millilitri ciascuno su sei pozzetti di una piastra rivestita di gelatina a 24 pozzetti per generare singole cellule nodali piuttosto che aggiungere terreno di differenziazione.

Dopo aver rimosso il PBS, utilizzare cinque millilitri di Accutane per sospendere le cellule e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Pipettare su e giù fino a energicamente. Mescolare la sospensione dopo l'incubazione a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Aggiungere 20 millilitri di PBS e centrifugare per cinque minuti a 300 volte G con 12 millilitri di differenziazione. Medium contenente G quattro 18. Sospendi le cellule e vedi due millilitri ciascuna su sei pozzetti di una coltura su piastra rivestita di gelatina a 24 pozzetti ed esegui l'analisi delle cellule secondo il protocollo di testo.

Utilizzando il protocollo dimostrato in questo video, isab S può essere generato da cellule staminali pluripotenti con una frequenza di battito di circa 450 battiti al minuto, come si vede qui dopo la dissociazione di isab S.Le singole cellule osservate mostrano le forme tipiche delle cellule del nodo del seno che include cellule fusiformi e ragno. Queste cellule mostrano alti livelli di espressione di proteine essenziali per la funzione del nodo del seno, come il catione dipendente dal nucleotide ciclico attivato dall'iperpolarizzazione. Canale quattro HCN quattro, conexion quattro cinque conexion 30.2 e MYH sei.

Quando trattate con il bloccante dei canali ZD 7 2 88 o con l'agonista del recettore muscarinico caracol, le cellule derivate da isab mostrano una frequenza di battito significativamente ridotta. L'agonista del recettore beta surrenalico, l'isoprene, d'altra parte, porta a un'elevata frequenza di battito. Nel complesso, la nostra tecnica aprirà la strada a una migliore comprensione della funzionalità e delle malattie dei pacemaker cardiaci.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare cellule linfonodali sinusali completamente funzionali da potenti cellule staminali PLU.