Esame di Rapid dopamina Dynamics con Fast Scan voltammetria ciclica Durante intraorale sapida Amministrazione in Rats Awake

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le risposte della dopamina al secondo al gusto orale denso. Ciò si ottiene creando prima i cateteri orali, gli elettrodi di riferimento e gli elettrodi in fibra di carbonio necessari per le procedure chirurgiche e la successiva registrazione tramite telemetria a V ciclica a scansione rapida. Il secondo passo consiste nell'impiantare chirurgicamente i cateteri orali, l'elettrodo intracranico e la cannula guida per l'elettrodo in fibra di carbonio.

Una settimana dopo, il microelettrodo in fibra di carbonio può essere calato nel nucleo accumbens per registrare i cambiamenti di rilascio extracellulare di dopamina in risposta alla somministrazione intraorale dei sapori. Il passaggio finale dopo la registrazione consiste nel calibrare l'elettrodo e nell'utilizzare l'analisi dei componenti principali per isolare i dati che contengono informazioni sulla dopamina. In definitiva, l'uso combinato del gusto e della somministrazione intraorale e della telemetria a scansione rapida della vol ciclica viene utilizzato per mostrare i cambiamenti nelle risposte della dopamina al taton in meno di secondo.

Ci sono due vantaggi principali di questa tecnica combinata rispetto ai metodi esistenti. In primo luogo, la fotometria IC veloce ha un'alta risoluzione temporale e in secondo luogo la somministrazione intraorale di taten riduce al minimo il movimento che il ratto deve fare per ottenere la tatina e ci consente di isolare meglio le risposte della dopamina alla tatina. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con la fabbricazione del catetere orale.

Tuttavia, la costruzione di un catetere orale buono e pagato garantirà una perfetta aderenza del catetere tra la guancia e i molari superiori e aumenterà la probabilità di successo dell'esperimento. Per preparare l'elettrodo di registrazione, aspirare prima una fibra di carbonio T six 50 di sette micron di diametro in un capillare di vetro silicato di bora con un diametro interno di 0,4 millimetri. Quindi, posizionare il capillare in un polare verticale dell'elettrodo inizialmente tirato con un riscaldatore impostato su 55.0 e il magnete spento, quindi regolare secondo necessità.

Dopo aver estratto la pipetta al microscopio, tagliare la fibra di carbonio esposta in modo che si estenda da 75 a 100 micron oltre il vetro. La fibra nel bicchiere deve essere ben sigillata, altrimenti scartare il preparato. Quindi, spellare l'isolamento da metà di un filo da tre pollici calibro 30, applicare il termorestringente per fissare l'elettrodo al micro manipolatore.

Quindi applicare un sottile strato di vernice d'argento sul filo mentre la vernice è ancora bagnata. Inserire il filo nell'estremità aperta dell'elettrodo e fissarlo alla fibra di carbonio al suo interno. Verificare questo contatto al microscopio.

Prendere l'elettrodo nel micromanipolatore e fissarlo con il termoretraibile. Posizionare l'elettrodo in fibra di carbonio preparato nell'alcool isopropilico per almeno 10 minuti per pulire la superficie dell'elettrodo e aumentare la successiva sensibilità alla dopamina. Dopo aver rimosso l'elettrodo dall'IPA, sciacquare la fibra di carbonio con acqua di rubinetto per rimuovere l'IPA.

Quindi, preparare l'elettrodo di riferimento da un filo d'argento da 13 millimetri con una rete di argento e cloruro d'argento da sei millimetri con un diametro di 0,4 millimetri, tagliare la parte non a maglie del filo e saldarla a uno spillo d'oro. Quindi applicare la resina epossidica sulla saldatura. Quindi immergere la parte della rete in un acido copolimero cinque volte.

Lascialo asciugare per 30 minuti all'aria tra un tuffo e l'altro dopo l'ultimo tuffo. Lascialo asciugare all'aria per una notte. Il giorno dopo.

Cuocere la parte in rete del filo a 120 gradi Celsius per un'ora. Per effettuare il primo taglio del catetere orale. Tubo in polietilene 100 in segmenti di sei centimetri.

Quindi fare un piccolo disco piatto in uno dei segmenti del tubo fondendo l'estremità e premendolo su una superficie piana e fredda al centro del disco. Usa un ago calibro 18 per creare un foro. Attacca l'altra estremità del segmento del tubo all'estremità smussata di un ago calibro 18.

Quindi, utilizzando una perforatrice, si realizzano diversi pezzi di politetrafluoroetilene di sei millimetri di diametro e 3,18 millimetri di spessore. Quindi al centro di questi dischi, creare un foro, trasformando così i dischi in rondelle. Tagliare la rondella in una forma trapezoidale per aiutarla a inserirsi durante l'impianto dei molari.

Per completare il catetere, spingere completamente un ago attaccato al tubo PE attraverso la rondella e far scorrere la rondella a filo sul tubo. Il completamento del protocollo seguente richiede circa 75 minuti. Inizia con un topo preparato per l'intervento chirurgico e apri la bocca usando un batuffolo di cotone.

Quindi spingere l'ago su una cannula nel tessuto tra la guancia e il primo molare superiore in modo che l'ago esca appena dietro e medialmente alle orecchie. Quindi spostare la cannula verso l'alto e fissare la rondella ai molari per fissare il catetere sull'ago esposto. Far scorrere una rondella e portarla ben stretta all'incisione.

Fissare questa rondella in posizione. Taglia il tubo in modo che rimangano esposti da due a quattro centimetri sopra la testa del topo. Quindi, usando la stessa tecnica, inserire un catetere nell'altro lato della bocca.

Successivamente, metti il ratto in un telaio stereotassico e pratica tre fori per le cannule e gli elettrodi per effettuare registrazioni nella posizione del nucleo accumbens. La cannula guida 1,2 millimetri anteriore e 1,4 millimetri. Torema laterale.

Abbassare l'apparecchio della cannula fino a quando la base di plastica non viene a filo con il cranio. Posizionare l'elettrodo di riferimento nell'emisfero controlaterale alla cannula guida. Abbassare il riferimento di circa due millimetri sotto la dura dura.

Quindi posizionare l'elettrodo stimolante, 5,2 millimetri posteriore e 1,0 millimetri laterale torema. Per colpire l'area tegmentale ventrale. Abbassare l'elettrodo stimolante di 8,0 millimetri sotto la dura.

Quindi fissare i componenti con viti e cemento e fornire assistenza postoperatoria. Prima di condurre un esperimento, verificare sempre la pervietà della cannula orale infondendo 200 microlitri di acqua e osservare se il ratto assaggia l'acqua, pulire il sito di registrazione rimuovendo la cannula fittizia, aggiungendovi due gocce di eparina al 50% e poi riposizionandola delicatamente. Il manichino non deve trovarsi a meno di due millimetri dal luogo di registrazione.

A questo punto, collegare e stabilizzare lo stadio della testa allo stimolatore impiantato nel VTA, quindi abbassare l'elettrodo di registrazione nel nucleo accumbens. Seguendo ora il protocollo di testo, produrre un set di dati di addestramento. Attendere sempre almeno due minuti, ma fino a quattro o cinque minuti tra le stimolazioni per consentire la ricarica vescicolare e il mosto.

Il passaggio più critico dell'esperimento è ottenere un elettrodo di alta qualità. Se lo sfondo è una caratteristica forma arrotondata in fase di lievitazione è un buon elettrodo. Se la forma arrotondata è piccola o corrisponde molto alla forma d'onda applicata, provare un elettrodo diverso.

Se lo sfondo è esattamente nel punto in cui è stato spostato, applicare uno spostamento di offset alla forma d'onda applicata in una direzione positiva con incrementi di 0,1 volt. Una volta generato un set di allenamento nel sito di registrazione, raccogliere i dati durante l'infusione di 200 microlitri di taten ogni uno o tre minuti per 25 infusioni. Quindi attendere almeno 30 minuti e infondere il gusto successivo allo stesso modo.

L'FSCV combinato con l'impianto di catetere intraorale è stato utilizzato per esaminare come il saccarosio e l'AIT up di taten modulano il rilascio fasico di dopamina nel nucleo accumbens prima dell'infusione di taten La stimolazione elettrica indicata dalla barra rossa del VTA ha prodotto robusti aumenti del rilascio fasico di dopamina nel nucleo accumbens dopo l'acquisizione del set di allenamento Infusioni di 6,5 secondi di 200 microlitri di saccarosio indicate dalla barra rossa prodotta in elevazione in corrente indicata dalla freccia bianca. Ciò si è verificato al potenziale di ossidazione della dopamina, che è indicato dalla linea del tratteggio bianco, trasformando i dati in un grafico della concentrazione in funzione del tempo. Dopo PCA ha verificato che l'aumento della corrente in risposta al gusto è il risultato di un aumento della concentrazione di dopamina.

Un altro mentolo tatin è stato infuso durante le registrazioni FSCV nel nucleo accumbens è stato osservato anche un aumento della concentrazione di dopamina dopo l'infusione di mentolo Una volta padroneggiato, l'intervento chirurgico combinato intraorale e incannulamento può essere eseguito in 75 minuti. Questa tecnica può essere combinata con altre forme di comportamento, come il condizionamento pavloviano competitivo e avversivo e l'opera, al fine di rispondere a domande sulla segnalazione della dopamina al di sotto del secondo durante questi processi.