Name: Tridimensionale Co-cultura Modello di tumore stromale-Interaction (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Scopri un modello di co-cultura tridimensionale per studiare le interazioni tra cellule tumorali polmonari e fibroblasti associati al cancro in matrici di collagene. Questo metodo supera le limitazioni delle colture 2D.

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Questo lavoro è stato supportato da Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (26461185 e 25460137).

NOTA: Questo studio è stato approvato dai comitati etici appropriati. 1. Cultura primario umano Polmone fibroblasti <ol><li> Raccolta di tessuto polmonare: <ol><li> Ottenere campioni di tessuto polmonare umano dalla sala operatoria chirurgica direttamente. Raccogliere circa 1 cm 3 isolati da tessuto polmonare cancerose e non cancerose, con il campione non cancerose raccolto più lontano dal tumore possibile. </li><li> Sospendere i campioni in terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 100 unità / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 0,25 ug / ml di amfotericina B (terreno privo di siero). Mantenere i campioni sospesi in sterili provette da 50 ml e trasferire al laboratorio. NOTA: I fibroblasti sono altamente migratori e proliferative rispetto ad altri tipi di cellule, come le epiteliali, endoteliali e cellule muscolari lisce. Il metodo conseguenza sfrutta queste caratteristiche di fibroblasti, e outgrocellule ala da sezioni di tessuto sono abbondanti in fibroblasti. Dopo diversi passaggi in coltura, altri tipi di cellule non riescono a sopravvivere e propagarsi in DMEM con siero fetale bovino 10% (FBS), risultando in colture cellulari di fibroblasti purificate. Le cellule potrebbero essere usate 3-7 passaggi seguenti colture primarie. </li></ol></li><li> Espianto e condizionamento per escrescenza cellulare: <ol><li> Eseguire colture primarie di fibroblasti con un protocollo precedentemente riportato con modifiche 5. </li><li> In laboratorio, posizionare il campione di tessuto su un piatto di 10 centimetri di coltura tissutale senza terreno di coltura e tagliato in piccole sezioni ~ 2-3 mm di dimensioni con pinza sterile e un bisturi. Durante questo processo, evitare di fare parte asciutta, altrimenti l&#39;efficienza della cella escrescenza è compromessa. </li></ol></li><li> Separazione dello strato di cellule epiteliali e tessuto connettivo: <ol><li> Immergere le sezioni di tessuto tagliato in mezzo di coltura contenente 2.000 PU / ml dispasi I e cultura per 16 ore a 4 ° C. &lt;/ Li&gt; <li> Trasferire le sezioni di tessuto ad un piatto, e separare lo strato di cellule epiteliali dal tessuto connettivo adiacente. Elaborare le sezioni di un banco pulito per evitare la contaminazione di microrganismi. NOTA: Se è necessaria colture primarie di cellule epiteliali, eseguire il passaggio 1.3. Se solo fibroblasti devono essere isolati, omettere il passo 1.3, perché le successive Espianto e cellulari passaggi sono sfavorevoli per le cellule epiteliali, che danno le popolazioni di fibroblasti purificate. </li></ol></li><li> Montaggio di sezioni di tessuto: <ol><li> Tritare i tessuti a pezzi 1 millimetro con due bisturi. Se i pezzi non sono sufficientemente piccoli, spiccano più facilmente dal piatto, e le cellule non riuscirà a superare sulla superficie del piatto. </li><li> Inserire piccole sezioni di tessuto polmonare uno dall&#39;altro per mantenere un&#39;area vuota circostante ogni pezzo. Effettuare graffi sulla superficie del piatto di coltura tissutale con una lama di bisturi per facilitare il fissaggio di sezioni di tessuto. NOTA: Graffioappare anche per facilitare escrescenza cellulare, fornendo piste lungo le quali le cellule possono migrare. <ol><li> In alternativa, inserire pezzi di tessuto tritate individualmente in ogni pozzetto di un 6-pozzetti, e coprire con un vetrino. Fissare il vetrino alla superficie della piastra con grasso al silicone. </li><li> Mettere grasso al silicone in due punti 1,5 centimetri a parte in ogni pozzetto usando un pin sterile. La copertura di pezzi di tessuto migliora l&#39;efficacia di escrescenza cellulare e la propagazione delle cellule dopo diversi passaggi. </li></ol></li></ol></li><li> Successivamente Espianto: <ol><li> Aggiungere delicatamente mezzo di coltura al piatto prima che le sezioni di tessuto asciugano, come conseguenza cella efficiente è perso in gran parte, se i campioni asciugare. Non versare il medium troppo rapidamente come le sezioni di tessuto sarebbe staccare. </li><li> Cellule culturali in DMEM con 10% FBS. Utilizzare abbastanza medio coprire appena il tessuto, ma non troppo che permette galleggiante, come galleggiabilità supplementare promuove distacco dalpiatto. </li></ol></li><li> Brano Cell: <ol><li> Maneggiare il terreno di coltura con cura in ogni momento, come ripetuti movimenti del piatto cultura può portare al distacco delle sezioni di tessuto. </li><li> Porre le capsule di coltura in un incubatore a 37 ° C per 5-7 giorni. Aggiornare il mezzo di ogni altro giorno, e gestire i piatti della cultura minimamente durante le medie modifiche. I fibroblasti troppo grande dal bordo delle sezioni di tessuto nelle prossime settimane. NOTA: Dopo ~ 2-3 settimane, fibroblasti diventano troppo grandi raggiungono quasi confluenza, a seconda della quantità di superficie. </li><li> Lavare le cellule con 1x PBS, e aggiungere 1 ml di tripsina I alla piastra. </li><li> Dopo tripsinizzazione, staccare le cellule utilizzando 9 ml di DMEM supplementato con 10% FBS. Raccogliere cellule sospese nel mezzo in una provetta da 10 ml, insieme alle sezioni di tessuto. Dopo la centrifugazione per formare pellet cellulari, risospendere il pellet con conseguente nuovo mezzo. </li><li> Seed le celle e sezioni di tessuto su un nuovo culpiatto ture, al punto che i tessuti non riescono a collegare al piatto, mentre le cellule aderiscono e crescono. Il giorno seguente, rimuovere i pezzi di tessuto galleggianti per aspirazione, e cambiare il mezzo. Fibroblasti Attached propagano con culture successive. </li></ol></li></ol> 2. tridimensionale Co-cultura umano Polmone fibroblasti e cellule tumorali <ol><li> Preparazione delle cellule e reagenti: <ol><li> Circa utilizzare 2 x 10 5 cellule epiteliali e 2,5 x 10 5 fibroblasti per pozzetto. Preparare collagene di tipo IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), tampone di ricostituzione (NaOH 50 mm, 260 NaHCO mM 3, HEPES 200 mm), 5x DMEM, DMEM integrato con il 10% FBS per la cultura di fibroblasti, e un mezzo di co-coltura 3D (una miscela 1: 1 di coltura di fibroblasti medie e terreno di coltura per le cellule tumorali). </li><li> Cultura A549 cellule di adenocarcinoma del polmone, i fibroblasti e la co-coltura A549 3D in DMEM supplementato con 10% FBS. </li></ol></li><li> Collagene gel formazione: <ol><li> Lavare fibroblasti coltivati ​​su 10 centimetri piatto con 1x PBS, e aggiungere 1 ml di tripsina I alla piastra. Dopo tripsinizzazione per ~ 5 min a 37 ° C, staccare le cellule utilizzando 9 ml DMEM supplementato con 10% FBS. Raccogliere cellule sospese nel mezzo in una provetta da 10 ml, e centrifugare a 200-300 xg per formare pellet cellulari. </li><li> Risospendere il pellet risultanti a 100% FBS ad una densità di 5 x 10 5 / ml. </li><li> Preparare il gel di collagene su ghiaccio. Raffreddare i reagenti, pipette e tubi in frigorifero prima della seguente procedura. Anche su ghiaccio, la miscela solidifica in una certa misura, ed il volume totale è inferiore alla somma di tutti i componenti. </li><li> In ogni pozzetto, preparare il gel di collagene miscelando 0,5 ml di sospensione fibroblasti (2,5 x 10 5 cellule) in FBS, 2.3 ml di collagene tipo IA, 670 microlitri DMEM 5x, e 330 microlitri tampone di ricostituzione. Lasciare i gel di impostare facilmente a temperatura ambiente. <ol><li> Vigorosamente pipetta per garantire a mi omogeneaxture. Evitare di creare bolle durante il processo di pipettaggio. </li></ol></li><li> Aggiungere la miscela (3 ml) a ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti e lasciare gelatinizzare in incubatore a 37 ° C senza disturbo per 30-60 min. </li></ol></li><li> Coltura cellulare Cancer sul gel di collagene: <ol><li> Eseguire co-coltura tridimensionale utilizzando un protocollo precedentemente riportato con modifiche 6. </li><li> Risospendere le cellule tumorali nel medio 3D co-coltura (o in DMEM con 10% FBS in caso di cellule A549) ad una densità di 1 x 10 5 / ml. </li><li> Versare 2 ml della soluzione di cellule risospeso (2 x 10 5 cellule) sulla superficie di ciascun gel. Modifica numero di cellule delle cellule tumorali o fibroblasti in co-coltura a seconda delle condizioni sperimentali. </li></ol></li><li> Gel contrazione: <ol><li> Incubare gel notte a 37 ° C in modo che le cellule tumorali possono aderire al gel di collagene. Staccare ogni gel, e generare una &#39;cultura fluttuante&#39; in ogni pozzetto of la piastra da 6 pozzetti. NOTA: utilizzando una cultura galleggiante, vari cambiamenti nella dimensione gel sono indotti dalla tensione meccanica e la degradazione del collagene, che sono mediati da interazioni cellulari tra cellule e fibroblasti tumorali co-coltura. </li><li> Utilizzare un angolato 21 ago G o spatola per separare ciascun gel dal bordo del pozzo. Ogni 2-3 giorni, aggiornare i pozzetti con 2 ml di 3D medio co-coltura. Misurare la dimensione di ciascun gel ogni giorno per 5 giorni. </li></ol></li><li> Analisi di gel di collagene: <ol><li> Misurare il contenuto di collagene di ogni gel con metodi di quantificazione di collagene, come ad esempio il test Sircol. Eseguire l&#39;analisi trascrittomica o RT-PCR dopo aver raccolto RNA da gel 5. </li></ol></li></ol> 3. Aria liquida Cultura Interfaccia e Invasion Assay <ol><li> Dopo coltura i gel di collagene a 37 ° C per 5 giorni, esporre i gel contratte all&#39;aria ponendoli su una maglia (70 micron dimensione dei pori) in una nuova 6-pozzetti. Effettuare la maglia da filtri cellulari disponibili in commercio utilizzati per citometria a flusso. </li><li> Riempire delicatamente ogni pozzetto con 11 ml di 3D medio co-coltura. </li><li> Posizionare il gel sulla rete utilizzando un cucchiaio sterile e rimuovere qualsiasi supporto rimanente dal gel. In questa condizione, immergere gel nel mezzo, mentre esporre la superficie superiore del gel all&#39;aria. Definire questa condizione cultura come interfaccia aria-liquido. NOTA: Dopo 5-7 giorni di mantenimento della coltura interfaccia aria-liquido a 37 ° C in incubatore, le cellule tumorali invasive migrano nel gel. A seconda del tipo di cellula e come risultato di interazioni cellulari, gradi variabili di cellule variazione morfologica nelle cellule tumorali sono indotte dalla cultura all&#39;interfaccia aria-liquido. </li><li> Per la valutazione istologica, fissare il gel in soluzione di formalina notte a temperatura ambiente e incorporare in paraffina. Macchia sezioni verticali (4 micron) con ematossilina eosina (H &amp; E). Eseguire l&#39;analisi immunoistochimica on sezioni 4. </li></ol>

<ol><li>Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts-a+key+host+cell+type+in+tumor+initiation%2C+progression%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Ups.+J.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis.</a> Ups. J. Med. Sci. 117 (2), 187-195 (2012).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

CAF formano una componente importante della ECM circostante le cellule tumorali e non solo forniscono una impalcatura per il tumore, ma anche partecipare attivamente nello sviluppo del tumore 7. Accumulando prove dipana l&#39;impatto dei CAF o loro molecole correlate alla eventuale previsione, mettendo in evidenza il ruolo critico della progressione tumorale CAF-mediata 8. Nello studio precedente, abbiamo utilizzato il metodo conseguenza di isolare CAF polmonari 4....

Il tessuto tumorale può essere percepito come un tipo di organo, che si evolve attraverso strette interazioni tra il cancro e il microambiente stromale tumorale, composto da fibroblasti associati al cancro (CAF), cellule immunitarie, vasi tumorali e matrice extracellulare (ECM). I CAF sono la principale fonte di fattori solubili (citochine, fattori di crescita e chemochine) che esercitano effetti mitogeni, pro-migratori e pro-invasivi sulle cellule tumorali. Stimolano anche la formazione dei vasi tumorali e reclutano cellule precursori, come le cellule derivate dal midollo osseo (BMDC). I CAF attivati sono coinvolti nella produzione e nel rimodellamento della MEC, promuovendo così la crescita e la diffusione delle cellule tumorali1. I CAF forniscono anche una nicchia che facilita la colonizzazione e la metastasi delle cellule tumorali e sono in grado di conferire fenotipi di cellule staminali alle cellule tumorali vicine. Le osservazioni patologiche suggeriscono che le reazioni stromale o le alterazioni fibrotiche nei tessuti tumorali sono indicative di una prognosi infausta. Studi recenti hanno anche dimostrato che le caratteristiche stromali del tumore, come la firma genica, possono predire la prognosi del paziente. Inoltre, i fattori derivati dai CAF possono modulare la sensibilità alla chemioterapia, evidenziando il ruolo dei CAF nel determinare la sensibilità e la resistenza ai farmaci2.
Poiché i CAF svolgono un ruolo multiforme nella promozione della progressione tumorale attraverso vie di segnalazione che mediano le interazioni tra CAF e diversi tipi di cellule all'interno del microambiente tumorale, hanno attirato una crescente attenzione come nuovi bersagli per le terapie antitumorali. L'eterogeneità delle popolazioni cellulari all'interno del microambiente tumorale rappresenta un ostacolo per il targeting dei CAF. Sono stati proposti diversi marcatori per i CAF, come l'actina muscolare liscia α (α-SMA), la proteina di attivazione dei fibroblasti (FAP) e il proten-1 specifico dei fibroblasti (FSP-1: chiamato anche S100A4); tuttavia, questi marcatori molecolari non sono specifici per distinguere i CAF da altre cellule presenti nei tessuti non cancerosi3. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per ottenere maggiori conoscenze sulle proprietà specifiche dei CAF. A tal fine, è istruttivo caratterizzare i CAF primari in coltura rispetto ai fibroblasti normali abbinati al paziente.
Recentemente, sono state riportate analisi su CAF derivati da pazienti in diversi tipi di cancro, rivelando modelli di espressione genica e comportamenti cellulari unici rispetto ai fibroblasti derivati da tessuti non cancerosi. Utilizzando CAF isolati da tessuti di cancro del polmone umano, abbiamo sviluppato un metodo di co-coltura tridimensionale, che ci ha permesso di valutare le proprietà dei CAF polmonari. In questo modello, abbiamo studiato gli effetti dei CAF sull'invasione, la proliferazione e la contrazione del gel di collagene delle cellule tumorali del polmone, che hanno ricapitolato sperimentalmente i ruoli di promozione del tumore dei CAF polmonari4.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>Collagene tipo IA</td><td>Gelatina Nitta Inc.</td><td>Tampone di ricostituzione CELL-1A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nitta gelatin Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto</td><td>NUNC</td><td>174934</td><td></td></tr><tr><td>Grasso siliconico</td><td>Dow Corning Toray</td><td>Grasso</td><td></td>per alto vuoto</tr><tr><td>Dispase I</td><td>WAKO</td><td>386-02271</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare (70 &mu; m)</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr></tbody></table>

tridimensionale co-cultura modello di tumore stromale-interaction

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

La progressione del cancro (inizio, crescita, invasione e metastasi) avviene attraverso interazioni tra le cellule maligne e le cellule stromali tumorali circostanti. Il microambiente tumorale è costituito da una varietà di tipi di cellule, come fibroblasti, cellule immunitarie, cellule endoteliali vascolari, periciti e cellule derivate dal midollo osseo, incorporate nella matrice extracellulare (ECM). I fibroblasti associati al cancro (CAF) hanno un ruolo pro-tumorigenico attraverso la secrezione di fattori solubili, l'angiogenesi e il rimodellamento della ECM. I modelli sperimentali per la sopravvivenza, la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali si sono basati principalmente su colture di tessuti bidimensionali monocellulari e monostrato o su saggi della camera di Boyden. Tuttavia, questi esperimenti non riflettono esattamente le condizioni fisiologiche o patologiche in un organo malato. Per ottenere una migliore comprensione delle interazioni tra tumore, stroma o matrice tumorale, le colture multicellulari e tridimensionali forniscono strumenti più potenti per studiare la comunicazione intercellulare e la modulazione dipendente dalla ECM del comportamento delle cellule tumorali. Come piattaforma per questo tipo di studio, presentiamo un modello sperimentale in cui le cellule tumorali vengono coltivate su gel di collagene incorporati con colture primarie di CAF.

Questo metodo di co-coltura, imitando il microambiente tumorale, è uno strumento utile per studiare le interazioni tra cellule tumorali e fibroblasti incorporati in gel di collagene. Nello studio precedente, tre parametri sono stati valutati in questo modello sperimentale: collagene contrazione gel, l&#39;invasione delle cellule tumorali e cambiamento morfologico. La proliferazione delle cellule del cancro è stato stimato utilizzando anche Ki67 immunostaining 4. Campioni di tessuto polmonare sono stati raccol...

Qui presentiamo un protocollo per la co-coltura in tre dimensioni, che è utile per studiare le interazioni multicellulari e la modulazione dipendente dalla matrice extracellulare del comportamento delle cellule tumorali. In questo modello sperimentale, le cellule tumorali vengono coltivate su gel di collagene incorporati con fibroblasti umani associati al cancro.

Tridimensionale Co-cultura Modello di tumore stromale-Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le interazioni cellulari tra cellule di cancro del polmone e fibroblasti associati al cancro mediante un metodo di co-coltura tridimensionale. Questo viene ottenuto attraverso la coltura primaria di fibroblasti umani associati al cancro del polmone ottenuti da tessuto polmonare raccolto e ridotto in frammenti di un millimetro. Il secondo passaggio consiste nel preparare gel di collagene contenenti fibroblasti, mescolando una soluzione di collagene utilizzando le cellule oculari di topo trattate con tripsina e trasferendola in una piastra a sei pozzetti per la gelatinizzazione.Successivamente, le cellule di adenocarcinoma polmonare vengono seminate sulla superficie di ciascun gel per preparare una coltura co-colturale tridimensionale di cellule tumorali e fibroblasti, e il gel viene separato dal bordo della pozzetta per generare una coltura in sospensione. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire il saggio di coltura all'interfaccia aria-liquido e di invasione, esponendo i gel contratti all'aria posizionandoli su una rete situata in una piastra a sei pozzette. Infine, esami istologici vengono utilizzati per valutare l'invasione delle cellule tumorali e i cambiamenti morfologici.Il principale vantaggio di questa procedura rispetto ai metodi esistenti, come la coltura monolayer bidimensionale, è che le interazioni multicellulari possono essere studiate in una coltura tridimensionale in condizioni controllate. Questa procedura inizia con la coltura primaria di fibroblasti ottenuti da tessuto polmonare raccolto, come descritto e citato nel protocollo testuale. In questo video, vengono utilizzati polmoni di topo anziché tessuto di cancro polmonare umano.Posizionare il campione di tessuto polmonare su una piastra per colture cellulari da 10 centimetri senza mezzo di coltura. Tagliare il tessuto in piccole sezioni di circa un millimetro di dimensione utilizzando pinze sterili e un bisturi. Durante questo processo, evitare che la sezione si secchi, altrimenti l'efficienza della migrazione cellulare risulta compromessa. Disporre le piccole sezioni di tessuto polmonare a distanza l'una dall'altra, mantenendo un'area vuota intorno a ciascun frammento.Eseguire dei graffi sulla superficie della piastra per colture cellulari utilizzando una lama di bisturi. In alternativa, la copertura con frammenti di tessuto migliora l'efficacia dell'espansione cellulare e della propagazione cellulare dopo diversi passaggi. Posizionare innanzitutto della vaselina siliconica in due punti distanti 1,5 centimetri l'uno dall'altro in ciascun pozzetto.Successivamente, posizionare singolarmente i pezzetti di tessuto tritato al centro di ciascun pozzetto. Quindi fissare il vetrino alla superficie della piastra utilizzando della vaselina siliconica. Aggiungere delicatamente il mezzo di coltura alla piastra, o al piatto a sei pozzetti, prima che le sezioni di tessuto si secchino.La fuoriuscita efficiente delle cellule è per la maggior parte compromessa. Se i campioni si seccano, non versare il mezzo troppo rapidamente per evitare il distacco delle sezioni di tessuto durante la formazione del gel di collagene. Lavare i fibroblasti con una soluzione salina tamponata al fosfato o PBS e aggiungere la tripsina per staccare le cellule in fuoriuscita dopo un'incubazione con tripsina di circa cinque minuti.A 37 gradi Celsius, staccare le cellule utilizzando nove millilitri di DMEM integrato con FBS al 10%, raccogliere le cellule sospese nel mezzo in un tubo da 10 millilitri e centrifugare a 200-300 ×g per formare pellet cellulari. Sospendere i pellet ottenuti in FBS al 100% a una densità di mezzo milione di cellule per millilitro. Raffreddare reagenti, pipette e tubi per la preparazione del gel di collagene in frigorifero prima della preparazione del gel di collagene.Successivamente, preparare il gel di collagene mescolando vigorosamente la sospensione di fibroblasti in collagene di tipo I A in FBS, DMEM 5X e tampone di riconstituzione mediante pipettaggio, al fine di ottenere una miscela omogenea, evitando la formazione di bolle durante l'operazione. Quindi aggiungere tre millilitri della miscela in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti e lasciare gelificare nell'incubatrice a 37 gradi Celsius senza disturbo per 30-60 minuti, per la coltura cellulare tumorale sul gel di collagene. Sospendere le cellule tumorali nel mezzo di co-coltura 3D a una densità di 1 × 10⁵ cellule per millilitro.Versare due millilitri della soluzione di cellule di adenocarcinoma polmonare A549 risospese sulla superficie di ciascun gel. Modificare il numero di cellule tumorali o di fibroblasti nella coltura co-coltivata in base alle condizioni sperimentali per eseguire la contrazione del gel. Incubare i gel durante la notte a 37 gradi Celsius affinché le cellule tumorali possano aderire al gel di collagene.Quindi staccare ciascun gel e generare una coltura in sospensione in ogni pozzetto. Utilizzare una piastra a sei pozzetti con un ago da 21 gauge inclinato o una spatola piccola per separare ogni gel dal bordo del pozzetto ogni due o tre giorni. Rinnovare il mezzo nei pozzetti aggiungendo due millilitri di mezzo di co-coltura 3D.Misurare le dimensioni di ciascun gel ogni giorno per cinque giorni. Infine, consultare il protocollo scritto per l'analisi del gel di collagene. Dopo aver coltivato i gel di collagene a 37 gradi Celsius per cinque giorni.Esponi i gel contratti all'aria posizionandoli su una rete. In nuove piastre a sei pozzetti, realizza la rete utilizzando filtri cellulari disponibili in commercio, impiegati per la citometria a flusso. Riempire delicatamente ogni pozzetto con 11 millilitri di mezzo di co-coltura 3D.Posizionare i gel sulla griglia utilizzando un cucchiaio sterile e rimuovere ogni residuo di mezzo dai gel in queste condizioni. I gel sono immersi nel mezzo mentre la superficie superiore del gel è esposta all'aria. Definire questa condizione di coltura come interfaccia aria-liquido.Questo metodo di co-coltura, che imita l'ambiente microscopico del tumore, è uno strumento utile per studiare le interazioni tra cellule tumorali e fibroblasti inglobati in gel di collagene. Un numero di 5 49 cellule è stato coltivato in co-coltura su un gel di collagene contenente i fibroblasti, e lo strato di 5 49 cellule è stato esposto all'aria posizionando il gel su una rete immersa nel mezzo di coltura. Qui viene mostrata un'immagine rappresentativa del gel posizionato sulla rete in una pozzetta di una piastra a sei pozzette, destinata ad analisi istologiche con ematossilina, eosina e eoin.La colorazione di sezioni trasversali di un gel coltivato in tre dimensioni ha rivelato l'invasione di cellule 5 49 nel gel di collagene arricchito con fibroblasti associati al cancro del polmone. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'espressione genica o l'abbattimento genico per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio sulla funzione specifica di un gene nell'interazione con la stroma tumorale.

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Descriviamo metodologie per la creazione...

Eterotipica tridimensionale<em&gt; In Vitro</emModellazione&gt; di stromale-epiteliali interazioni Durante iniziazione e la progressione del cancro ovarico

Questo video mostra un metodo per stabilire una co-coltura tridimensionale di sferoidi tumorali e cellule T. Viene preparato un calco di agarosio con micropozzetti contenenti sferoidi tumorali, seguito dall'aggiunta di cellule T. Dopo l'incubazione, questa configurazione consente di studiare l'interazione delle cellule T con gli sferoidi tumorali in un ambiente tridimensionale controllato.

Un modello tridimensionale di co-coltura di cellule T infiltranti negli sferoidi tumorali

Il organotipico coculture fetta cervello con cellule di carcinoma consente la visualizzazione cambiamenti morfologici mediante fluorescenza e campo chiaro (video) microscopia durante il processo di carcinoma invasione delle cellule del tessuto cerebrale. Questo modello di sistema permette anche approcci di scambio cellulare e di rifornimento e offre una vasta gamma di manipolazioni e analisi.

Co-coltura di sistema con un Organotipica cervello Slice e 3D Spheroid delle cellule di carcinoma

Tre coltura tridimensionale di cellule epiteliali mammarie su una membrana basale ricostituita è un metodo utile ricordare l'architettura in vivo del seno benigno, e per differenziare il fenotipo maligno dal fenotipo seno benigno. È importante sottolineare che questo sistema può essere applicato a studiare carcinomi invasivi in ​​altri tessuti.

Tre Culture dimensionali: strumento per studiare normale acinose Architettura vs trasformazione maligna delle cellule mammarie

Dimostriamo un metodo per generare surrogati 3D del cancro al seno, che possono essere coltivati utilizzando un sistema di bioreattori di perfusione per fornire ossigeno e sostanze nutritive. Dopo la crescita, i surrogati vengono fissati e trasformati in paraffina per la valutazione dei parametri di interesse. Viene spiegata la valutazione di uno di questi parametri, la densità cellulare.

Preparazione e analisi di<em&gt; In Vitro</em&gt; Tridimensionale carcinoma mammario mondo dei replicanti

Le cellule tumorali vengono incorporate in un gel di collagene e poi inserite in un gel di fibrina acellulare per generare un sistema di coltura 3D in cui l'invasività e la formazione di tumori satelliti possono essere monitorate.

Three-Dimensional Cultura Assay per esplorare Cancer Cell invasività e formazione di tumori Satellite

È stato sviluppato un sistema di modelli in vitro per catturare i cambiamenti architettonici dei tessuti durante la progressione del carcinoma squamoso polmonare (LUSC) in una co-coltura tridimensionale (3D) con fibroblasti associati al cancro (CAF). Questo sistema organoide fornisce una piattaforma unica per studiare i ruoli dei diversi cambiamenti delle cellule tumorali-intrinseche ed estrinseci che modulano il fenotipo tumorale.

Sistema di cocultura multidimensionale per modellare la progressione del carcinoma squamoso polmonare

Viene stabilito un nuovo modello di sferoide tridimensionale basato sull'interazione eterotipica delle cellule tumorali e dei fibroblasti stromali. Qui, presentiamo la cocoltura di cellule tumorali e fibroblasti stromali, imaging time-lapse, e microscopia confocale per visualizzare la formazione di sferoidi. Questo modello tridimensionale offre una piattaforma pertinente per studiare le interazioni tumora-stroma e testare le terapie antitumorali.

Un nuovo modello di spheroid del tumore strutturato in 3D modulato come fibromastro per studiare l'interazione tumora-stroma e la scoperta di farmaci

L'approccio presentato valuta simultaneamente l'invasione delle cellule tumorali nei saggi dello sferoideo 3D e nella citotossicità delle cellule T. Gli spheroidi sono generati in un cast multi-microwell senza scaffold. La co-coltura e l'incorporamento nella matrice di collagene di tipo I vengono eseguite all'interno dello stesso dispositivo che permette di monitorare l'invasione delle cellule tumorali e la citotossicità mediata a cellule T.

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Mancano modelli completi in vitro che ricapitolino fedelmente la malattia umana pertinente. Il presente studio presenta la creazione e la coltura tridimensionale (3D) di sferoidi tumorali, uno strumento affidabile in vitro per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare umano.

Un modello sferoide tridimensionale per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare

C'è un bisogno critico di modelli di cancro 3D che catturino il crosstalk eterocellulare per studiare le metastasi del cancro. Il nostro studio presenta la generazione di epiteliali stromali eteromulticellulari in un ambiente privo di scaffold e scaffold che può essere utilizzato per studiare l'invasione e le distribuzioni spaziali cellulari.

Cellule stromali eteromulticellulari in colture 3D prive di scaffold di cellule tumorali epiteliali per guidare l'invasione

Scopri un modello di co-cultura tridimensionale per studiare le interazioni tra cellule tumorali polmonari e fibroblasti associati al cancro in matrici di collagene. Questo metodo supera le limitazioni delle colture 2D.

Tridimensionale Co-cultura Modello di tumore stromale-Interaction

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