Tridimensionale Co-cultura Modello di tumore stromale-Interaction

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le interazioni cellulari tra cellule di cancro del polmone e fibroblasti associati al cancro mediante un metodo di co-coltura tridimensionale. Questo viene ottenuto attraverso la coltura primaria di fibroblasti umani associati al cancro del polmone ottenuti da tessuto polmonare raccolto e ridotto in frammenti di un millimetro. Il secondo passaggio consiste nel preparare gel di collagene contenenti fibroblasti, mescolando una soluzione di collagene utilizzando le cellule oculari di topo trattate con tripsina e trasferendola in una piastra a sei pozzetti per la gelatinizzazione.

Successivamente, le cellule di adenocarcinoma polmonare vengono seminate sulla superficie di ciascun gel per preparare una coltura co-colturale tridimensionale di cellule tumorali e fibroblasti, e il gel viene separato dal bordo della pozzetta per generare una coltura in sospensione. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire il saggio di coltura all'interfaccia aria-liquido e di invasione, esponendo i gel contratti all'aria posizionandoli su una rete situata in una piastra a sei pozzette. Infine, esami istologici vengono utilizzati per valutare l'invasione delle cellule tumorali e i cambiamenti morfologici.

Il principale vantaggio di questa procedura rispetto ai metodi esistenti, come la coltura monolayer bidimensionale, è che le interazioni multicellulari possono essere studiate in una coltura tridimensionale in condizioni controllate. Questa procedura inizia con la coltura primaria di fibroblasti ottenuti da tessuto polmonare raccolto, come descritto e citato nel protocollo testuale. In questo video, vengono utilizzati polmoni di topo anziché tessuto di cancro polmonare umano.

Posizionare il campione di tessuto polmonare su una piastra per colture cellulari da 10 centimetri senza mezzo di coltura. Tagliare il tessuto in piccole sezioni di circa un millimetro di dimensione utilizzando pinze sterili e un bisturi. Durante questo processo, evitare che la sezione si secchi, altrimenti l'efficienza della migrazione cellulare risulta compromessa. Disporre le piccole sezioni di tessuto polmonare a distanza l'una dall'altra, mantenendo un'area vuota intorno a ciascun frammento.

Eseguire dei graffi sulla superficie della piastra per colture cellulari utilizzando una lama di bisturi. In alternativa, la copertura con frammenti di tessuto migliora l'efficacia dell'espansione cellulare e della propagazione cellulare dopo diversi passaggi. Posizionare innanzitutto della vaselina siliconica in due punti distanti 1,5 centimetri l'uno dall'altro in ciascun pozzetto.

Successivamente, posizionare singolarmente i pezzetti di tessuto tritato al centro di ciascun pozzetto. Quindi fissare il vetrino alla superficie della piastra utilizzando della vaselina siliconica. Aggiungere delicatamente il mezzo di coltura alla piastra, o al piatto a sei pozzetti, prima che le sezioni di tessuto si secchino.

La fuoriuscita efficiente delle cellule è per la maggior parte compromessa. Se i campioni si seccano, non versare il mezzo troppo rapidamente per evitare il distacco delle sezioni di tessuto durante la formazione del gel di collagene. Lavare i fibroblasti con una soluzione salina tamponata al fosfato o PBS e aggiungere la tripsina per staccare le cellule in fuoriuscita dopo un'incubazione con tripsina di circa cinque minuti.

A 37 gradi Celsius, staccare le cellule utilizzando nove millilitri di DMEM integrato con FBS al 10%, raccogliere le cellule sospese nel mezzo in un tubo da 10 millilitri e centrifugare a 200-300 ×g per formare pellet cellulari. Sospendere i pellet ottenuti in FBS al 100% a una densità di mezzo milione di cellule per millilitro. Raffreddare reagenti, pipette e tubi per la preparazione del gel di collagene in frigorifero prima della preparazione del gel di collagene.

Successivamente, preparare il gel di collagene mescolando vigorosamente la sospensione di fibroblasti in collagene di tipo I A in FBS, DMEM 5X e tampone di riconstituzione mediante pipettaggio, al fine di ottenere una miscela omogenea, evitando la formazione di bolle durante l'operazione. Quindi aggiungere tre millilitri della miscela in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti e lasciare gelificare nell'incubatrice a 37 gradi Celsius senza disturbo per 30-60 minuti, per la coltura cellulare tumorale sul gel di collagene. Sospendere le cellule tumorali nel mezzo di co-coltura 3D a una densità di 1 × 10⁵ cellule per millilitro.

Versare due millilitri della soluzione di cellule di adenocarcinoma polmonare A549 risospese sulla superficie di ciascun gel. Modificare il numero di cellule tumorali o di fibroblasti nella coltura co-coltivata in base alle condizioni sperimentali per eseguire la contrazione del gel. Incubare i gel durante la notte a 37 gradi Celsius affinché le cellule tumorali possano aderire al gel di collagene.

Quindi staccare ciascun gel e generare una coltura in sospensione in ogni pozzetto. Utilizzare una piastra a sei pozzetti con un ago da 21 gauge inclinato o una spatola piccola per separare ogni gel dal bordo del pozzetto ogni due o tre giorni. Rinnovare il mezzo nei pozzetti aggiungendo due millilitri di mezzo di co-coltura 3D.

Misurare le dimensioni di ciascun gel ogni giorno per cinque giorni. Infine, consultare il protocollo scritto per l'analisi del gel di collagene. Dopo aver coltivato i gel di collagene a 37 gradi Celsius per cinque giorni.

Esponi i gel contratti all'aria posizionandoli su una rete. In nuove piastre a sei pozzetti, realizza la rete utilizzando filtri cellulari disponibili in commercio, impiegati per la citometria a flusso. Riempire delicatamente ogni pozzetto con 11 millilitri di mezzo di co-coltura 3D.

Posizionare i gel sulla griglia utilizzando un cucchiaio sterile e rimuovere ogni residuo di mezzo dai gel in queste condizioni. I gel sono immersi nel mezzo mentre la superficie superiore del gel è esposta all'aria. Definire questa condizione di coltura come interfaccia aria-liquido.

Questo metodo di co-coltura, che imita l'ambiente microscopico del tumore, è uno strumento utile per studiare le interazioni tra cellule tumorali e fibroblasti inglobati in gel di collagene. Un numero di 5 49 cellule è stato coltivato in co-coltura su un gel di collagene contenente i fibroblasti, e lo strato di 5 49 cellule è stato esposto all'aria posizionando il gel su una rete immersa nel mezzo di coltura. Qui viene mostrata un'immagine rappresentativa del gel posizionato sulla rete in una pozzetta di una piastra a sei pozzette, destinata ad analisi istologiche con ematossilina, eosina e eoin.

La colorazione di sezioni trasversali di un gel coltivato in tre dimensioni ha rivelato l'invasione di cellule 5 49 nel gel di collagene arricchito con fibroblasti associati al cancro del polmone. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'espressione genica o l'abbattimento genico per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio sulla funzione specifica di un gene nell'interazione con la stroma tumorale.