Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

L'obiettivo di questa procedura è isolare ed coltivare in modo efficiente neuroni primari dal mesencefalo ventrale di roditori. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando il mesencefalo di embrioni di roditori. Il secondo passaggio consiste nell'isolare con attenzione il mesencefalo ventrale.

Successivamente, il tessuto neuronale deve essere dissociato per ottenere una sospensione di singole cellule. L'ultimo passaggio consiste nel seminare i neuroni primari in un piccolo volume su coprivetrini, prima di trasferire le cellule aderenti in una piastra a 24 pozzetti in un secondo momento. Infine, l'anticorpo e la microscopia a immunofluorescenza vengono utilizzati per identificare i neuroni dopaminergici all'interno della coltura.

I neuroni dopaminergici nel mesencefalo sono coinvolti in diverse funzioni, tra cui il controllo del movimento e delle emozioni nella cognizione e il sistema di ricompensa del cervello. Sono inoltre implicati in condizioni neurologiche e neuropsichiatriche, tra cui la malattia di Parkinson, le dipendenze e la schizofrenia. Il metodo di riparazione del mesencefalo ventrale.

Le colture neuronali possono essere utilizzate per studiare la fisiologia e le proprietà cellulari dei neuroni dopaminergici, nonché per comprendere le cause della loro degenerazione durante il decorso di disturbi come il morbo di Parkinson. Per prima cosa, preparare le lamelle.

Fare bollire in etanolo al 70% per almeno 30 minuti per rimuovere eventuali tracce di grasso. Successivamente, sterilizzare le lamelle in autoclave. Trasferire le lamelle in piastre a 24 pozzetti e aggiungere mezzo millilitro di poliol all'etene ciascuna.

Lasciare le piastre in incubazione per un'ora a temperatura ambiente. Si noti che la durata in magazzino della soluzione di poliol o di Athene pronta all'uso è di un mese. Quindi lavare le lamelle tre volte con mezzo millilitro di acqua per ogni lavaggio.

Senza tutti e tre i lavaggi, le cellule coltivate non sopravvivrebbero per 24 ore. Successivamente, preparare la soluzione di laminina. Assicurarsi di scongelarla lentamente sul ghiaccio.

Quindi sciogliere la laminina in D-M-E-M-F 12 freddo e utilizzarla immediatamente. Aggiungere ora mezzo millilitro di soluzione di laminina appena preparata in ogni pozzetto e lasciare incubare le piastre tutta la notte a 37 gradi Celsius. Infine, durante la preparazione della pipetta di vetro, lucidare le punte fino a ridurle della metà rispetto alle dimensioni normali.

Eseguire un'incisione addominale per esporre le sacche uterine e, utilizzando pinzette, staccare l'utero. Trasferire l'utero in HBSS freddo su ghiaccio in una piastra da 100 millimetri e iniziare a rimuovere gli embrioni con le pinzette. Trasferire gli embrioni isolati in una nuova piastra contenente HBSS freddo.

Ora, sotto un microscopio stereoscopico, prepararsi ad accedere alla regione del mesencefalo ventrale con un ingrandimento di 10x. Dissezionare il mesencefalo e l'arco cefalico tagliando il cervello a livello dell'istmo e della regione di confine tra mesencefalo e diencefalo cefalico utilizzando forbici chirurgiche o pinzette. Dopo aver rimosso l'intero mesencefalo, effettuare un taglio nella regione mediale dorsale del mesencefalo.

Utilizzando pinzette, rimuovere le meningi. Questo passaggio è fondamentale per il successo della coltura neuronale. Le cellule non neuronali moriranno in condizioni di coltura e invieranno segnali avversi ai neuroni vicini.

Ora appiattire il tessuto del mesencefalo in una forma a farfalla. Rimuovere con una lama sterile circa metà di ciascuna ala, lasciando il mesencefalo ventrale. Trasferire il mesencefalo ventrale in HBSS freddo su ghiaccio in un tubo conico da 15 millilitri.

Procedere quindi a dissezionare il processo dell'embrione successivo, elaborando quanti più embrioni possibile entro un'ora. Gli embrioni mantenuti sul ghiaccio per più di un'ora presentano una scarsa vitalità cellulare. Per garantire un'elevata vitalità dei neuroni dopaminergici, il tempo che intercorre tra la dissezione e la semina non deve superare un'ora.

Inoltre, rimuovere le meningi è fondamentale per la sopravvivenza dei neuroni sotto cappa. Rimuovere l'HBSS dal campione di mesencefalo ventrale. Quindi aggiungere un millilitro di tripsina al 0,05% A DTA tiepida, una quantità sufficiente di soluzione per 12 frammenti di tessuto.

Incubare il tessuto a 37 gradi Celsius per cinque-dieci minuti. Sotto cappa, sostituire la tripsina A DTA con un millilitro di mezzo di deattivazione. Agitare delicatamente per mescolare, quindi rimuovere il mezzo di deattivazione, lasciandone una quantità sufficiente da non eliminare le cellule dissociate.

Successivamente, lavare i tessuti con mezzo completo due volte senza perdere le cellule. Aggiungere ora un millilitro di mezzo completo. Quindi triturare il tessuto con la pipetta flame-polished senza formare bolle finché non si ottiene una sospensione di cellule singole.

Circa otto-dieci passaggi dovrebbero essere sufficienti. Al termine, centrifugare le cellule a 400 G per cinque minuti. Rimuovere il mezzo e risospendere le cellule in un millilitro di mezzo completo.

Pipettare le cellule fino a quattro volte per ottenere una sospensione. Iniziare contando e valutando lo stato di salute delle cellule nella sospensione, utilizzando l'esclusione con triptan blu e un emocitometro.

Ora regolare la sospensione cellulare a 1500 cellule per microlitro. Successivamente trasferire i tappi di provette microcentrifuga sterilizzati in piastre da 100 millimetri. Posizionare i coprioggetti preparati sui tappi utilizzando pinzette.

Non lavare i coprioggetti e cercare di non farli asciugare. Caricare 100 microlitri di sospensione su ciascun coprioggetto. Questo metodo leggermente insolito garantisce una vitalità della coltura del 90% ed è un passaggio fondamentale per il successo.

Quindi chiudere la piastra di Petri e trasferirla nell'incubatore per un'ora; al termine dell'incubazione, trasferire con attenzione i coprioggetti con il mezzo su piastre a 24 pozzetti contenenti 400 microlitri di mezzo completo riscaldato a 37 gradi Celsius in ogni pozzetto, quindi incubare le cellule per tutta la notte. Le prime ore sono le più critiche per la sopravvivenza cellulare entro 24 ore. Aggiungere delicatamente mezzo millilitro di mezzo completo in ogni pozzetto.

Ogni due settimane. Cambiare metà del mezzo di coltura. Se la coltura diventa gialla, il cambio di metà del mezzo può essere eseguito prima, ma il cambio deve comunque essere infrequente.

I neuroni dopaminergici sopravvivranno per più di sei settimane in queste condizioni. Dopo due settimane di coltura, l'immunohistochimica contro la tirosina, l'idrossilasi e i marcatori neuronali mostra che l'1% delle cellule è dopaminergico. Le proiezioni neuronali compaiono entro due ore dal seeding.

Al termine del primo giorno di coltura, assoni e dendriti sono distinguibili. Alla fine, i neuroni sopravvivono per oltre sei settimane e mostrano una notevole crescita estesa seguendo questa procedura. Altri metodi come la trasduzione virale, la fluorescenza immunitaria o l'elettrofisiologia possono essere eseguiti per rispondere a domande meccanicistiche nei neuroni dopaminergici.