Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

L'obiettivo di questa procedura è isolare e coltivare in modo efficiente i neuroni primari dal mesencefalo ventrale dei roditori. Ciò si ottiene sezionando prima il mesencefalo degli embrioni di roditori. Il secondo passo consiste nell'isolare attentamente il mesencefalo ventrale.

Successivamente, il tessuto neuronale deve essere dissociato per produrre una sospensione a singola cellula. Il passaggio finale consiste nel placcare i neuroni primari in un piccolo volume su vetrini coprioggetti prima di trasferire le cellule attaccate in una piastra a 24 pozzetti. Infine, la microscopia anticorpale e immunofluorescenza viene utilizzata per identificare i neuroni dopaminergici all'interno della coltura.

I neuroni dopaminergici nel mesencefalo sono coinvolti in diverse funzioni, tra cui il controllo del movimento e delle emozioni nella cognizione e la secrezione della ricompensa del cervello. Sono anche implicati in condizioni neurologiche e neuropsichiatriche, tra cui il morbo di Parkinson, la dipendenza e la schizofrenia. Il metodo di riparazione del mesencefalo ventrale.

Le colture neuronali possono essere utilizzate per studiare la fisiologia e le proprietà cellulari dei neuroni dopaminergici, nonché per comprendere la causa della loro degenerazione. Durante il decorso di disturbi come il morbo di Parkinson. Per prima cosa, prepara i vetrini.

Lessatele in etanolo al 70% per almeno 30 minuti per eliminare eventuali tracce di grasso. Quindi sterilizzare in autoclave i vetrini coprioggetto. Trasferire i vetrini copricoperchio in piastre a 24 pozzetti e aggiungere mezzo millilitro di poliolo tutto atena a ciascuna.

Bene, lascia incubare le piastre per un'ora a temperatura ambiente. Tieni presente che la durata di conservazione della soluzione di poliolo o atene funzionante è di un mese. Quindi lavare i vetrini coprioggetto tre volte con mezzo millilitro d'acqua per lavaggio.

Senza tutti e tre i lavaggi, le cellule coltivate non sopravviverebbero 24 ore. Quindi, riparare la soluzione di laminina. Assicurati di scongelarlo prima lentamente con ghiaccio.

Quindi sciogliere la laminina in D-M-E-M-F 12 a freddo e utilizzarla immediatamente. Ora a mezzo millilitro di soluzione di laminina appena fatta in ogni pozzetto e lasciare che le piastre incubino per una notte a 37 gradi Celsius. Infine, quando preparo la pipetta di vetro, lucido le loro punte a metà della loro dimensione normale.

Fai un'incisione addominale per esporre le sacche uterine e, usando una pinza, taglia l'utero. Trasferisci l'utero in un HBSS ghiacciato in un piatto da 100 millimetri e inizia a rimuovere gli embrioni con una pinza. Trasferisci gli embrioni isolati in un nuovo piatto di HBSS freddo.

Ora sotto un microscopio da dissezione, preparati ad accedere a questa posizione del mesencefalo ventrale con un ingrandimento di 10x. Sezionare il meas e l'arco cefalico tagliando il cervello all'istmo e il meas e la regione di confine cefalica e cefalica utilizzando forbici o pinze biologiche. Dopo aver tolto l'intero mesencefalo, praticare un taglio nel mesencefalo dorsale mediale.

Usando una pinza, rimuovere le meningi. Questo passaggio è fondamentale per il successo della coltura neuronale. Le cellule non neuronali moriranno in coltura e nelle condizioni e segnaleranno negativamente i neuroni vicini.

Ora appiattisci il tessuto mesencefalico a forma di farfalla. Taglia circa metà di ogni ala con una lama sterile lasciando il mesencefalo ventrale. Trasferire il mesencefalo ventrale in HBSS ghiacciato in un tubo conico da 15 millilitri.

Quindi procedi a sezionare il successivo processo embrionale il maggior numero possibile di embrioni entro un'ora. Gli embrioni tenuti in ghiaccio per più di un'ora, hanno una scarsa vitalità cellulare. Per garantire un'elevata vitalità dei neuroni dopaminergici, il tempo dalla dissezione alla placcatura non deve superare un'ora.

Inoltre, la rimozione delle meningi è fondamentale per la sopravvivenza dei neuroni sotto un cappuccio. Rimuovere l'HBSS dalla collezione del mesencefalo ventrale. Quindi aggiungere un millilitro di tripsina A DTA calda allo 0,05%, soluzione sufficiente per 12 pezzi di tessuto.

Incubare il tessuto a 37 gradi Celsius per cinque-10 minuti. Sotto il cofano, sostituire la tripsina A DTA con un millilitro di disattivazione. Il terreno si gonfia delicatamente per mescolare, quindi rimuove il mezzo di disattivazione, ma lascia abbastanza terreno in modo che le cellule dissociate non vengano scartate.

Successivamente, lavare due volte i fazzoletti con terreno completo senza perdere le cellule. Ora aggiungi un millilitro di terreno completo. Quindi triturare il tessuto con la pipetta lucidata a fuoco senza formare bolle fino ad ottenere una sospensione a singola cellula.

Dovrebbero essere sufficienti da otto a 10 passaggi. Trascorso il tempo, centrifugare le celle da 400 Gs per cinque minuti. Rimuovere il terreno e risospendere le cellule in un millilitro di terreno completo.

Pipettare le cellule fino a quattro volte per ottenere una sospensione. Inizia contando e valutando lo stato di salute delle cellule nella sospensione. Utilizzo dell'esclusione triam blue con un emocitometro.

Ora regola la sospensione cellulare a 1500 cellule per microlitro. Quindi trasferire i tappi delle provette sterilizzate per microcentrifuga in piatti da 100 millimetri. Posizionare i vetrini coprioggetti preparati sui cappucci utilizzando una pinza.

Non lavare i vetrini coprioggetti e cercare di non farli seccare. Caricare 100 microlitri di sospensione su ciascun vetrino coprioggetti. Questo metodo un po' insolito fornisce il 90% di vitalità della coltura ed è un passo fondamentale per il successo.

Quindi chiudere la capsula di Petri e trasferirla nell'incubatore per un'ora dopo l'incubazione, trasferire con cura i vetrini di copertura con il terreno in piastre a 24 pozzetti contenenti 400 microlitri di terreno completo caldo a 37 gradi Celsius in ciascun pozzetto, quindi incubare le cellule durante la notte. Le prime ore sono le più critiche per la sopravvivenza cellulare entro 24 ore. Aggiungere delicatamente mezzo millilitro di terreno completo a ciascun pozzetto.

Ogni due settimane. Cambia metà del supporto. Se la lingua diventa gialla, la modifica del mezzo supporto può essere eseguita prima, ma la modifica dovrebbe comunque essere poco frequente.

I neuroni dopaminergici sopravvivono per più di sei settimane in queste condizioni. Dopo due settimane di coltura, l'immunoistochimica contro la tirosina, l'idrossilasi e i marcatori neuronali mostrano che l'1% delle cellule è dopaminergico. Le proiezioni neuronali compaiono entro due ore dalla placcatura.

Alla fine del primo giorno di coltura, assoni e dendriti sono distinguibili. Alla fine, i neuroni sopravvivono per più di sei settimane e mostrano un'ampia crescita Dopo questa procedura. Altri metodi come la trasduzione virale, la fluorescenza immunitaria o l'elettrofisiologia possono essere eseguiti per rispondere a domande meccanicistiche nei neuroni dopaminergici.