Name: Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Scopri l'isolamento e la coltura di neuroni dopaminergici primari dal mesencefalo ventrale di roditori. Questo metodo consente di studiare la neurodegenerazione nella malattia di Parkinson.

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Questo lavoro è stato svolto utilizzando i fondi della Divisione di Scienze del Cervello, Dipartimento di Medicina, Imperial College di Londra a K.N.A.

NOTA: Gli animali sono stati mantenuti e gestiti in conformità con le linee guida istituzionali e tutte le procedure di animali sono stati approvati dal benessere degli animali del Imperial College e Ethical Review Body (AWERB) e il Ministero degli Interni e la Harvard University Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC), in conformità alle normative federali e statali. 1. reagente e installazione attrezzature <ol><li> Thaw, aliquota e conservare 1 mg / ml soluzione laminina a -80 ° C. Sciogliere 2 microlitri in 1 ml DMEM / F12, ottenendo una concentrazione di rivestimento di 1-2 mg / cm 2. NOTA: Thaw laminina lentamente sul ghiaccio e si dissolvono in freddo DMEM / F12 e aggiungerlo ai piatti / coprioggetti immediatamente. </li><li> Diluire 75 ml di 0,01% Poly-L-ornitina in 425 ml di PBS e conservare a 4 ° C. NOTA: La durata della soluzione di lavoro è fino a un mese. </li><li> Sciogliere 25% (peso / volume) BSA in PBS, pH 7.4, e conservare a 4 ° C per un massimo di un year. </li><li> Preparare 50% FBS (in HBSS) mezzi di disattivazione. </li><li> Preparare terreno completo aggiungendo 50 U / ml di penicillina e streptomicina, 1x N2 supplemento, 5% (vol / vol) FBS, 0,36% D - (+) - Glucosio (peso / volume), 0,25% di BSA (peso / volume) di DMEM / F12 e conservare a 4 ° C. NOTA: La durata è fino a 10 giorni. </li><li> Luogo coprioggetto in ebollizione il 70% (vol / vol) di etanolo per almeno 30 minuti per rimuovere eventuali tracce di grasso e di autoclave. </li><li> Luogo coprioggetto in piastre da 24 pozzetti e aggiungere 500 microlitri soluzione Poli-L-ornitina in ciascun pozzetto. Incubare 1 ora sotto il cofano di coltura tissutale a temperatura ambiente e poi, lavare 3 volte con 500 microlitri acqua. Aggiungere la soluzione laminina 500 microlitri per ogni piatto e incubare O / N in umidificata coltura tissutale incubatore a 37 ° C. NOTA: Anche se non sono necessari lavaggi dopo il trattamento laminina, lavare i poli-L-ornitina meno di tre volte provoca la morte delle cellule 24 ore dopo coltura. </li><li> Lucidare le punte delle pipette di vetro oltre a gas naturale o torcia fzoppo. NOTA: Dopo questo passo il diametro della punta dovrebbe essere circa la metà della sua dimensione normale. </li><li> Tagliare i tappi di provette da 1,5 ml microcentrifuga, utilizzando una forbice autoclave e autoclave. </li></ol> 2. dissezione embrionali ventrale Mesencefalo <ol><li> Narcotizzare gravide temporizzato (E12.5) dighe di CO 2 inalazione e quindi eutanasia da dislocazione cervicale. </li><li> Spruzzare l&#39;addome con il 70% di etanolo e fare un&#39;incisione addominale fino a quando le sacche uterine sono tutti esposti. Uso pinze tagliare l&#39;attaccamento vaginale e rimuovere l&#39;utero. Inserire l&#39;utero in ghiacciata HBSS, in una piastra di Petri 100 mm. </li><li> Rimuovere embrioni dall&#39;utero e sacco amniotico, usando pinze (Figura 1C). Luogo embrioni in HBSS ghiacciata fresca. NOTA: Il rettangolo in figura 1D indica la posizione del mesencefalo ventrale embrionale. </li><li> Mettere gli embrioni al microscopio dissezione (10x) e sezionare il mesencefalicaarch tagliando il cervello al istmo e mesencefalica-diencephalic regione di confine, con il bioscissor e pinza (Figura 1E, si prega di fare riferimento alla Figura 1A per le linee di incisione). </li><li> Dopo aver preso l&#39;intera mesencefalo, fare un taglio nel mesencefalo mediodorsale (Figura 1F). </li><li> Rimuovere meningi, utilizzando due pinze (Figura 1H). NOTA: PUNTO CRITICO: Questo passaggio è fondamentale per la resa ottimale neuronale e la sopravvivenza. Poiché le condizioni di coltura sono ottimali per le cellule cerebrali, la maggior parte delle cellule del tessuto circostante muoiono dopo placcatura e il segnale apoptotico da questo tessuto può danneggiare l&#39;integrità delle culture. </li><li> Appiattire il tessuto mesencefalo sul piatto Petri per osservare la forma a farfalla e tagliare circa la metà di ogni ala, utilizzando una lama da barba sterilizzato (Figura 1H, I). NOTA: Figura 1J descrive isolato mesencefalo ventrale. </li><li> Trasferire ilpezzo di mesencefalo ventrale in ghiaccio-freddo HBSS in un tubo da 15 ml e procedere con il successivo dell&#39;embrione. NOTA: i passaggi 2,1-2,8 non dovrebbe prendere più di 1 ora. Mantenere gli embrioni di là di questo lasso di tempo sul ghiaccio diminuisce vitalità cellulare in modo significativo. </li></ol> 3. La dissociazione delle cellule ventrale Midbrain <ol><li> Trasferire i pezzi di mesencefalo ventrale sotto una cappa a flusso laminare. Rimuovere il HBSS e aggiungere 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C) 0,05% tripsina-EDTA nel tubo conico (volumi sufficienti per un massimo di 12 pezzi di mesencefalo ventrale). Incubare il tessuto a 37 ° C per 5-10 minuti. </li><li> Rimuovere tripsina-EDTA sotto il cofano e aggiungere 1 ml di mezzo di disattivazione (siero disattiverà tripsina) al tessuto. </li><li> Rimuovere il mezzo disattivazione e lavare il tessuto in 1 ml di mezzo completo due volte. NOTA: evitare di rimuovere tutto il supporto dal tubo e pipettando il tessuto, per evitare che scartando le cellule dissociate. </li><li> Aggiungere 1 ml terreno completo e triturato il tessuto con un bicchiere pipetta fuoco lucido. Evitare la formazione di bolle e continuare triturazione fino al raggiungimento sospensione di cellule singole. NOTA: Di solito, 8-10 passa attraverso la punta ristretta sono necessari per la completa dissociazione. </li><li> Centrifugare le cellule a 400 xg per 5 minuti a RT e rimuovere il supporto. </li><li> Risospendere il pellet in 1 ml di media completo lentamente pipettando su e giù per un massimo di quattro volte. </li></ol> 4. Cellule placcatura ventrale Midbrain <ol><li> Miscelare 10 ml di sospensione cellulare con 90 microlitri Trypan blue soluzione e contare il numero di cellule con un emocitometro. NOTA: la vitalità delle cellule può essere controllato in questa fase. </li><li> Mettere tappi provetta sterilizzati in 100 millimetri piastre di Petri e trasferire i coprioggetti Poly-L-ornitina / laminina rivestite, utilizzando pinze, una alla volta sulla parte superiore dei tappi. NOTA: Non lavare i coprioggetti ed evitare l&#39;essiccazione della laminina, poiché questo può causare uneveculture n e diminuzione sopravvivenza delle cellule. </li><li> Regolare il volume a 1500 cellule per 1 ml aggiungendo mezzo completo e aggiungere 100 microlitri (totale di 150.000 cellule) della sospensione cellulare sopra l&#39;coprioggetto (il volume è ottimale per coprire la superficie del vetrino senza perdite). Chiudere le piastre di Petri e incubare per 1 ora in un incubatore umidificato coltura tissutale (37 ° C, 5% CO 2). NOTA: PUNTO CRITICO: Questo passo è necessario per migliorare il collegamento e la vitalità delle cellule e per aumentare il numero di lamelle per dell&#39;embrione. In alternativa, le cellule possono essere trasferiti direttamente nei pozzetti (contenenti coprioggetto), ma il numero di celle deve essere aumentata a 350.000 per pozzetto (invece di 150.000). In altre parole, con questo metodo, 8-10 coprioggetto possono essere acquisiti, mentre il trasferimento diretto produce circa 3-4 vetrini a causa delle cellule, che si attaccano alle piastre (accanto o sotto i coprioggetti). La viabili mediaty delle culture, con questo metodo è stato di circa il 90%. </li></ol> 5. Cultura crescita e manutenzione <ol><li> Dopo 1 ora di incubazione, trasferire accuratamente i coprioggetti compreso il terreno in piastre da 24 pozzetti, contenente 400 ml di pre-riscaldato (a 37 ° C) terreno completo (volume totale: 500 ml). Incubare le cellule O / N a 37 ° C. </li><li> Entro 24 ore dopo incubazione dei pozzetti, aggiungere delicatamente 500 microlitri terreno completo in ogni pozzetto. NOTA: Le prime ore è la fase più critica per la sopravvivenza dei neuroni dopaminergici e il numero di cellule sopravvissute non cambia significativamente oltre questo punto. </li><li> Non aggiungere supporti supplementare alle colture per le prime due settimane o finché il terreno diventa gialla. Se coltura per più di due settimane o cambiamenti di colore medio al giallo, cambio la metà dei mezzi di comunicazione (500 ml) con mezzi freschi completi pre-riscaldato (tipicamente ogni due settimane). NOTA: i neuroni dopaminergici nelculture sarebbero sopravvissuti per più di 6 settimane in queste condizioni. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Neuroni dopaminergici nel mesencefalo sono la principale fonte di dopamina nel sistema nervoso centrale. Sono divisi in tre gruppi, pars compacta della sostanza nera (SNPC), area ventrale tegmentale (VTA) e campo retrorubral (RRF) 10, 11. I neuroni in SNPC e VTA danno luogo a grandi vie dopaminergiche, mesocorticali, mesolimbico e nigrostriatale, coinvolte in funzioni come il controllo delle emozioni, la motivazione e il comportamento del motore. Scomparsa dei neuroni in SNPC e disgregazione funzionale del si...

La perdita di neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta conduce ai sintomi motori cardinali della malattia di Parkinson (PD), la seconda malattia neurodegenerativa più diffusa. La causa della morte di questa popolazione neuronale mesencefalica non è nota. Per studiare i meccanismi biochimici responsabili dello sviluppo e modulando le proprietà neurofisiologiche e la sopravvivenza dei neuroni mesDA, diverse colture cellulari e sistemi modello animali sono stati utilizzati. Linee cellulari immortalizzate, compreso il ratto dopaminergica linea cellulare 1RB 3 AN 27 (N27), il dopaminergico umano linea cellulare di neuroblastoma SH-SY5Y, la linea cellulare di ibridoma del mouse dopaminergica MN9D e mesencefalico umana LUHMES cellule sono state usate per gli studi meccanicistici biochimici e limitate 1 -5. Per lo studio della perdita di neuroni specifica mesDA, vari neurotossina-based e modelli genetici sono stati sviluppati 6-8. Culture mesencefalo ventrale primarie, Fornire uno strumento indispensabile per lo studio delle proprietà neuronali e sinaptiche dei neuroni dopaminergici e i meccanismi coinvolti nella patogenesi di questa malattia comune. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per l&#39;isolamento dei neuroni dopaminergici mesencefalici, che contiene le modifiche con conseguente maggiore sopravvivenza e una maggiore resa di vetrini per dell&#39;embrione. L&#39;uso di pre-maturo mesencefalo del mouse E12.5 (E14.5 nel ratto) migliora la sopravvivenza. A questa età i neuroni non hanno ancora sviluppato assoni, che lascia intatte le cellule durante la dissezione e riduce al minimo lo stress incrementando in modo significativo la redditività. Inoltre, attenta dissezione del mesencefalo ventrale, come descritto nella sezione 2 del presente protocollo, migliora ulteriormente la capacità di sopravvivenza. Per aumentare il numero di vetrini per embrione, un metodo alternativo di placcatura è presentato nella sezione 4 del presente protocollo. Questo porta ad un rendimento di fino a 10 vetrini per dell&#39;embrione rispetto a 4 coprioggetti sottocondizioni standard di placcatura riducendo così la quantità di animali per esperimento. I neuroni in coltura mostra conseguenza di assoni e dentrites, formano connessioni sinaptiche e rivelano la presenza di marcatori neuronali e sinaptiche rendono queste culture adatto per l&#39;imaging cellulare dal vivo, immunocitochimica e studi elettrofisiologici. Inoltre, l&#39;uso di colture neuronali facilita la manipolazione genetica e farmacologica. Escrescenza dei neuriti dal giorno 2 in vitro consente per gli studi di sviluppo. Inoltre, la sopravvivenza a lungo termine di culture (fino a sei settimane) li rende adatti per lo studio della lenta, progressiva degenerazione dei neuroni questi.

<table><tbody><tr><td>Miscela di nutrienti medi Eagle modificata di Dulbecco, F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330</td><td></td></tr>, <tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) (1X), siero bovino fetale liquido</td><td>Invitrogen</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>, inattivato termicamente (FBS),</td> integratore <td>Invitrogen</td><td>16140</td><td></td></tr><tr><td>N2 (100X), liquido</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio soluzione (45% (wt/vol) in acqua</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina BSA</td><td>Sigma</td><td>A9430</td><td></td></tr><tr><td>Laminina da membrana basale del sarcoma murino di Engelbreth-Holm-Swarm</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (0,05% (wt/vol)</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino coltura cellulare di albumina (BSA) testata</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-tirosina idrossilasi (Th)</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P60101-0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitina, soluzione allo 0,01%</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Map2 (proteina associata ai microtubuli-2A e -2B) anticorpo</td><td>Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-sinapsina-1</td><td>Millipore</td><td>AB1543P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 asino anti-coniglio IgG&nbsp; &nbsp; anticorpo</td><td>Sonde molecolari</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 asino anti-coniglio IgG&nbsp; &nbsp; anticorpi</td><td>Sonde molecolari</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 asino anti-pecora IgG&nbsp; &nbsp; anticorpo</td><td>Sonde molecolari</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 asino anti-pecora IgG&nbsp; &nbsp; anticorpi</td><td>Sonde molecolari</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 asino anti-topo IgG&nbsp; &nbsp; anticorpi</td><td>Sonde molecolari</td><td>A-21203</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano (0,4% (wt/vol))</td><td>Biowhittaker</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto di fase invertito</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 40 C</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forcipe</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>May-45</td><td></td></tr><tr><td>Pinze antiscivolo &ndash; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11251-33</td><td></td></tr><tr><td>Due pinze Dumont #45 &ndash; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11245-30</td><td></td></tr><tr><td>Portalama/Deruttore Impugnatura piatta - 11cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per iride per studenti - Dritta 11,5 cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Illuminatore alogeno in fibra ottica</td><td>Nikon</td><td>MKII</td><td></td></tr><tr><td>Monouso in vetro borosilicato Pasteur Pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>Emocitometro 13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Proscitech</td><td>SVZ2NIOU</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &; m unità filtranti sterili</td><td>Nalgene</td><td>NL-CE-156-4020</td><td></td></tr><tr><td>piastre di Petri 100x20 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351005</td><td></td></tr><tr><td>Tondo Cover Slip #1 Spessore Vetro tedesco 12 mm</td><td>Vetro Bellco</td><td>1943-10012&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento, cultura e lungo termine manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici da brains embrionali dei roditori

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

La degenerazione dei neuroni dopaminergici mesencefalici (mesDA) è il segno patologico della malattia di Parkinson. Lo studio dei processi biologici coinvolti nelle funzioni fisiologiche e nella vulnerabilità e morte di questi neuroni è utile per comprendere le cause sottostanti e svelare la cura per questa comune malattia neurodegenerativa. Le colture primarie di neuroni mesDA forniscono uno strumento per lo studio delle proprietà molecolari, biochimiche ed elettrofisiologiche, al fine di comprendere lo sviluppo, la sopravvivenza a lungo termine e la degenerazione di questi neuroni durante il decorso della malattia. Qui presentiamo un metodo dettagliato per l'isolamento, la coltura e il mantenimento di neuroni dopaminergici mesencefalici da embrioni di topo E12.5 (o di ratto E14.5). Le condizioni ottimizzate della coltura cellulare in questo protocollo determinano la presenza di proiezioni assonali e dendritiche, connessioni sinaptiche e altre proprietà morfologiche neuronali, che rendono le colture adatte allo studio delle caratteristiche fisiologiche, biologiche cellulari e molecolari di questa popolazione neuronale.

Immunoistochimica contro tirosina idrossilasi (TH) mostra che tra 0,5-1% delle cellule in coltura sono dopaminergica. Proiezioni neuronali sembrano in 2 ore dopo la placcatura e il primo giorno, assoni e dendriti sono distinguibili (figura 2), utilizzando la tirosina idrossilasi (TH) e proteina 2 (Map2) anticorpi associata ai microtubuli (Figura 3). I neuroni sopravvivono per più di sei settimane e mostrano un&#39;ampia conseguenza. Il rapporto neurone-glia nelle colture è direttamente ...

Le cause della degenerazione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo durante il morbo di Parkinson non sono completamente comprese. I sistemi di coltura cellulare forniscono uno strumento essenziale per lo studio delle proprietà neurofisiologiche di questi neuroni. Qui presentiamo un protocollo ottimizzato, che può essere utilizzato per la modellazione in vitro della neurodegenerazione.

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

L'obiettivo di questa procedura è isolare ed coltivare in modo efficiente neuroni primari dal mesencefalo ventrale di roditori. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando il mesencefalo di embrioni di roditori. Il secondo passaggio consiste nell'isolare con attenzione il mesencefalo ventrale.Successivamente, il tessuto neuronale deve essere dissociato per ottenere una sospensione di singole cellule. L'ultimo passaggio consiste nel seminare i neuroni primari in un piccolo volume su coprivetrini, prima di trasferire le cellule aderenti in una piastra a 24 pozzetti in un secondo momento. Infine, l'anticorpo e la microscopia a immunofluorescenza vengono utilizzati per identificare i neuroni dopaminergici all'interno della coltura.I neuroni dopaminergici nel mesencefalo sono coinvolti in diverse funzioni, tra cui il controllo del movimento e delle emozioni nella cognizione e il sistema di ricompensa del cervello. Sono inoltre implicati in condizioni neurologiche e neuropsichiatriche, tra cui la malattia di Parkinson, le dipendenze e la schizofrenia. Il metodo di riparazione del mesencefalo ventrale.Le colture neuronali possono essere utilizzate per studiare la fisiologia e le proprietà cellulari dei neuroni dopaminergici, nonché per comprendere le cause della loro degenerazione durante il decorso di disturbi come il morbo di Parkinson. Per prima cosa, preparare le lamelle.Fare bollire in etanolo al 70% per almeno 30 minuti per rimuovere eventuali tracce di grasso. Successivamente, sterilizzare le lamelle in autoclave. Trasferire le lamelle in piastre a 24 pozzetti e aggiungere mezzo millilitro di poliol all'etene ciascuna.Lasciare le piastre in incubazione per un'ora a temperatura ambiente. Si noti che la durata in magazzino della soluzione di poliol o di Athene pronta all'uso è di un mese. Quindi lavare le lamelle tre volte con mezzo millilitro di acqua per ogni lavaggio.Senza tutti e tre i lavaggi, le cellule coltivate non sopravvivrebbero per 24 ore. Successivamente, preparare la soluzione di laminina. Assicurarsi di scongelarla lentamente sul ghiaccio.Quindi sciogliere la laminina in D-M-E-M-F 12 freddo e utilizzarla immediatamente. Aggiungere ora mezzo millilitro di soluzione di laminina appena preparata in ogni pozzetto e lasciare incubare le piastre tutta la notte a 37 gradi Celsius. Infine, durante la preparazione della pipetta di vetro, lucidare le punte fino a ridurle della metà rispetto alle dimensioni normali.Eseguire un'incisione addominale per esporre le sacche uterine e, utilizzando pinzette, staccare l'utero. Trasferire l'utero in HBSS freddo su ghiaccio in una piastra da 100 millimetri e iniziare a rimuovere gli embrioni con le pinzette. Trasferire gli embrioni isolati in una nuova piastra contenente HBSS freddo.Ora, sotto un microscopio stereoscopico, prepararsi ad accedere alla regione del mesencefalo ventrale con un ingrandimento di 10x. Dissezionare il mesencefalo e l'arco cefalico tagliando il cervello a livello dell'istmo e della regione di confine tra mesencefalo e diencefalo cefalico utilizzando forbici chirurgiche o pinzette. Dopo aver rimosso l'intero mesencefalo, effettuare un taglio nella regione mediale dorsale del mesencefalo.Utilizzando pinzette, rimuovere le meningi. Questo passaggio è fondamentale per il successo della coltura neuronale. Le cellule non neuronali moriranno in condizioni di coltura e invieranno segnali avversi ai neuroni vicini.Ora appiattire il tessuto del mesencefalo in una forma a farfalla. Rimuovere con una lama sterile circa metà di ciascuna ala, lasciando il mesencefalo ventrale. Trasferire il mesencefalo ventrale in HBSS freddo su ghiaccio in un tubo conico da 15 millilitri.Procedere quindi a dissezionare il processo dell'embrione successivo, elaborando quanti più embrioni possibile entro un'ora. Gli embrioni mantenuti sul ghiaccio per più di un'ora presentano una scarsa vitalità cellulare. Per garantire un'elevata vitalità dei neuroni dopaminergici, il tempo che intercorre tra la dissezione e la semina non deve superare un'ora.Inoltre, rimuovere le meningi è fondamentale per la sopravvivenza dei neuroni sotto cappa. Rimuovere l'HBSS dal campione di mesencefalo ventrale. Quindi aggiungere un millilitro di tripsina al 0,05% A DTA tiepida, una quantità sufficiente di soluzione per 12 frammenti di tessuto.Incubare il tessuto a 37 gradi Celsius per cinque-dieci minuti. Sotto cappa, sostituire la tripsina A DTA con un millilitro di mezzo di deattivazione. Agitare delicatamente per mescolare, quindi rimuovere il mezzo di deattivazione, lasciandone una quantità sufficiente da non eliminare le cellule dissociate.Successivamente, lavare i tessuti con mezzo completo due volte senza perdere le cellule. Aggiungere ora un millilitro di mezzo completo. Quindi triturare il tessuto con la pipetta flame-polished senza formare bolle finché non si ottiene una sospensione di cellule singole.Circa otto-dieci passaggi dovrebbero essere sufficienti. Al termine, centrifugare le cellule a 400 G per cinque minuti. Rimuovere il mezzo e risospendere le cellule in un millilitro di mezzo completo.Pipettare le cellule fino a quattro volte per ottenere una sospensione. Iniziare contando e valutando lo stato di salute delle cellule nella sospensione, utilizzando l'esclusione con triptan blu e un emocitometro.Ora regolare la sospensione cellulare a 1500 cellule per microlitro. Successivamente trasferire i tappi di provette microcentrifuga sterilizzati in piastre da 100 millimetri. Posizionare i coprioggetti preparati sui tappi utilizzando pinzette.Non lavare i coprioggetti e cercare di non farli asciugare. Caricare 100 microlitri di sospensione su ciascun coprioggetto. Questo metodo leggermente insolito garantisce una vitalità della coltura del 90% ed è un passaggio fondamentale per il successo.Quindi chiudere la piastra di Petri e trasferirla nell'incubatore per un'ora; al termine dell'incubazione, trasferire con attenzione i coprioggetti con il mezzo su piastre a 24 pozzetti contenenti 400 microlitri di mezzo completo riscaldato a 37 gradi Celsius in ogni pozzetto, quindi incubare le cellule per tutta la notte. Le prime ore sono le più critiche per la sopravvivenza cellulare entro 24 ore. Aggiungere delicatamente mezzo millilitro di mezzo completo in ogni pozzetto.Ogni due settimane. Cambiare metà del mezzo di coltura. Se la coltura diventa gialla, il cambio di metà del mezzo può essere eseguito prima, ma il cambio deve comunque essere infrequente.I neuroni dopaminergici sopravvivranno per più di sei settimane in queste condizioni. Dopo due settimane di coltura, l'immunohistochimica contro la tirosina, l'idrossilasi e i marcatori neuronali mostra che l'1% delle cellule è dopaminergico. Le proiezioni neuronali compaiono entro due ore dal seeding.Al termine del primo giorno di coltura, assoni e dendriti sono distinguibili. Alla fine, i neuroni sopravvivono per oltre sei settimane e mostrano una notevole crescita estesa seguendo questa procedura. Altri metodi come la trasduzione virale, la fluorescenza immunitaria o l'elettrofisiologia possono essere eseguiti per rispondere a domande meccanicistiche nei neuroni dopaminergici.

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Il video dimostra il processo di isolamento e coltura dei neuroni dopaminergici dal mesencefalo di embrioni di topo. I pavimenti ventrali isolati del mesencefalo vengono dissociati utilizzando enzimi. I neuroni dopaminergici risultanti vengono raccolti e trasferiti in micro-isole all'interno di piastre multi-pozzetto. Le cellule vengono incubate con un mezzo neuronale dopaminergico per mantenere le cellule ad alta densità all'interno delle micro-isole.

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Scopri l'isolamento e la coltura di neuroni dopaminergici primari dal mesencefalo ventrale di roditori. Questo metodo consente di studiare la neurodegenerazione nella malattia di Parkinson.

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori (Video) | JoVE Journal

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

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