Monitoraggio midollo osseo di topo monociti In Vivo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare il traffico di monociti nel midollo osseo del cranio di un topo vivente utilizzando l'imaging a due fotoni. In primo luogo, il topo viene anestetizzato e iniettato con una soluzione di marciume, destrano di rumina per etichettare il sistema vascolare. Il topo viene quindi posizionato in un supporto metallico personalizzato e il cuoio capelluto dalla parte posteriore dell'osso parietale all'osso frontale viene rimosso.

Un anello di gomma viene quindi applicato direttamente sul cranio con colla chirurgica e i serbatoi vengono riempiti con soluzione salina liquida. Infine, la microscopia multifotonica viene utilizzata per monitorare lo sviluppo delle cellule fluorescenti nel tempo all'interno del midollo osseo del cranio. Questo può aiutare a rispondere a una domanda chiave nel campo dell'immunoematologia, come il meccanismo di mobilizzazione dei monociti allo stato stazionario o dopo la chemioterapia.

Quindi questo metodo può fornire informazioni sul comportamento dei monociti modulari. Può anche essere applicato per studiare altri sottogruppi di cellule del midollo osseo a seconda della specificità del reporter del centesimo di influenza utilizzato. Il seguente protocollo utilizza un microscopio multifotone accoppiato con un laser a cristalli di zaffiro in titanio e un modulatore op per il controllo della potenza del laser.

Per consentire la registrazione simultanea di tre canali fluorescenti, la configurazione dovrebbe includere tre rivelatori di scansione esterni non DS o nds con una combinazione di specchi dicroici da 565 nanometri e 690 nanometri, 565, 610 nanometri e 500, 550 nanometri e un filtro passa corto da 485. Si noti che in questa configurazione, la generazione di seconda armonica o SHG e la proteina fluorescente ciano o CFP vengono rilevate dall'NDD dopo il filtro passa corto 485. La CFP viene rilevata anche dalla NDD.

Dopo che il filtro passa banda 500, 550 e il destrano Rod Domine viene rilevato dall'NDD. Dopo il filtro passa-banda 565 610, diverse ore prima dell'imaging impostare la camera di riscaldamento a 32 gradi Celsius. Questa temperatura manterrà il topo a una temperatura corporea ottimale per tutta la durata dell'esperimento.

Si noti che la camera di riscaldamento qui utilizzata è scura e copre gli obiettivi e la piastra motorizzata del sistema. Questo aiuta a evitare la contaminazione della luce esterna. Per accendere prima il sistema, accendere il laser in zaffiro di titanio, quindi accendere il resto del sistema del microscopio.

Avvia il software di acquisizione. Qui viene utilizzato il software Zen di Zeiss. Impostare l'intervallo di lunghezza d'onda del laser su 870 nanometri.

Quindi selezionare l'NDD appropriato per la registrazione. Il topo utilizzato in questo esperimento è un topo transgenico chiamato Mac blue, che esprime una proteina fluorescente ciano sotto il controllo del promotore del recettore CSF one. Il metodo di anestesia consigliato dipende dalla durata dell'imaging, quindi è meglio consultare il documento di accompagnamento per i dettagli.

Un aspetto difficile di questa procedura è l'iniezione della vena T, poiché è piuttosto facile perdere la vena. Se ciò accade, eseguire invece l'iniezione retroorbitale. Una volta che il mouse è stato anestetizzato, utilizzare le tronchesi per verificare la perdita di coscienza stimolando il poggiapiedi. Prossimo.

Per colorare il sistema vascolare iniettare 200 microlitri di destrano domine a bastoncello nella vena della coda o per la colorazione dei neutrofili. Iniettare 100 microlitri di soluzione fisiologica contenente LY six GPE. Dopo l'iniezione, posizionare la testa del topo tra le piastre di fissaggio di un supporto stereotassico personalizzato adattato al microscopio e all'inalatore di gas anestetico.

Ciò garantisce che i movimenti respiratori non influenzino l'imaging. Stringere le piastre di fissaggio per allungare la pelle tra le orecchie e la testa. Verificare la stabilità.

Premendo delicatamente la testa con una pinza, la testa non dovrebbe muoversi. Quindi assicurarsi che l'animale respiri normalmente. Per preparare il mouse per l'imaging a due fotoni, utilizzare un dito per applicare etanolo al 70% sui capelli del cuoio capelluto, facendo attenzione a evitare gli occhi.

Quindi posiziona un telo con un ritaglio per esporre il cuoio capelluto. Successivamente, utilizzando forbici e tronchesi sterili, tagliare la pelle e rimuovere completamente il cuoio capelluto dalla parte posteriore dell'osso parietale all'osso frontale. Mantenere una distanza di tre millimetri dagli occhi e dalle orecchie per evitare sanguinamenti estesi.

Rimuovere il tessuto connettivo sciolto o il periostio che copre il cranio. Quindi, utilizzando un tovagliolo di carta caldo imbevuto di PBS, lavare i capelli rimanenti come mostrato qui. Utilizzando un ago di piccolo calibro, applicare la colla chirurgica su tutta la periferia di un anello di gomma di 10 millimetri di diametro.

Quindi posiziona l'anello di gomma direttamente sul teschio con un altro tovagliolo di carta imbevuto di PBS. Pulisci l'interno dell'anello un'ultima volta. Aggiungi PBS caldo per immergere completamente il cranio.

Quindi posizionare il supporto stereotassico sotto l'obiettivo. Una volta posizionato il mouse, utilizzare l'oculare del microscopio a trasmissione diretta per visualizzare il cranio e posizionarlo approssimativamente nel campo visivo del microscopio. In alto a sinistra nella finestra del software di imaging, fare clic su Acquisizione in tempo reale.

Una scansione dal vivo del tessuto apparirà al centro della finestra utilizzando il controllo direzionale del microscopio nel software. Individua una regione con CFP e segnale domine a barra per regolare la messa a fuoco. Quindi impostare la potenza del laser al minimo per ottenere il miglior rapporto segnale/rumore con il minimo danno fotografico.

Successivamente, nel software, fare clic sulla scheda del canale e aumentare la potenza di guadagno sui PMT per ciascun NDD per ridurre lo sbiancamento delle foto e i danni alle foto, quindi fare clic sulla scheda appropriata per impostare le impostazioni di acquisizione su scansione singola con un tempo di permanenza dei pixel di 1,58 microsecondi e una risoluzione di 512 x 512 pixel con un ingrandimento di 1,5. Una volta impostati i parametri di registrazione, cliccare sul comando di acquisizione in tempo reale e rilevare il tessuto per scegliere il campo x, y, Z desiderato da monitorare in tempo reale. Qui viene scelto un campo che comprende sia l'area vascolare che quella parenchimale.

Accanto a salvare o registrare le coordinate X, Y, Z del campo mostrato nella scheda delle posizioni. Fare clic su aggiungi. Ripetere questo processo con un massimo di tre campi aggiuntivi per registrare tutte le coordinate di interesse.

Le coordinate appariranno nella scheda delle posizioni accanto per istruire il software. Per catturare una pila di immagini di tre DZ, fai clic su sposta nella scheda delle posizioni nel software per andare alla prima posizione registrata e seleziona Zack nella casella in alto a sinistra del software. Questo aprirà la scheda dello stack Z, si sposterà nella posizione Z più alta e regolerà la potenza del laser di conseguenza.

Fare clic su imposta per ultimo, quindi spostarsi nella posizione più profonda. Regola la potenza del laser. Quindi fare clic su imposta prima.

Lo spessore dell'analisi della pila deve essere adattato rapidamente alla cella studiata. Le celle in movimento usciranno rapidamente dal francese, quindi dovrai acquisire una pila più spessa. Quindi acquisisci per le celle che si muovono lentamente.

Nella casella in alto a sinistra, selezionare il comando serie temporale per aprire la scheda serie temporale. Impostare il numero di cicli e l'intervallo di tempo. Qui, verrà acquisito un volume ogni 30 secondi per 60 cicli.

Ciò rappresenta 30 minuti in tempo reale. Per iniziare l'imaging time lapse nella finestra principale, selezionare avvia esperimento durante la procedura, continuare a monitorare l'animale per assicurarsi che sia incosciente. Assicurati anche che l'obiettivo sia immerso correttamente.

Dopo che la sequenza è stata acquisita, utilizzare una pipetta per aggiungere PBS caldo. Quindi inizia una seconda acquisizione di 30 minuti. Se si nota una progressiva scomparsa del segnale durante l'acquisizione, verificare la presenza di perdite di PBS.

Una volta che tutti i video richiesti sono stati registrati, l'analisi dei dati eseguita come descritto nel documento di accompagnamento per studiare la fisiologia del midollo osseo mediante imaging intravitale, un topo transgenico Mac blue è stato iniettato con 2 milioni di Dalton rod domine dextran e ripreso mediante microscopia a scansione laser a due fotoni. Come dimostrato in questo video, nella micrografia risultante, la vascolarizzazione colorata con destrano di domine a bastoncello da 2 milioni di Dalton è mostrata in rosso, mostrata in blu è visualizzata dalla seconda generazione armonica. I monociti ECFP positivi mostrati in ciano si trovano all'interno di nicchie parenchimali, che sono viste come aree scure tra il sistema vascolare e l'osso, e all'interno dei vasi.

Per calcolare la traiettoria delle singole cellule, è stato eseguito l'imaging time-lapse. Questo video mostra il comportamento migratorio dei monociti parenchimali. Il segnale ECFP è in ciano e i percorsi migratori per ogni punto rosso appaiono in verde.

Qui si può osservare il comportamento migratorio dei monociti vascolari. Questi dati possono essere utilizzati per calcolare sia la velocità media che lo spostamento quadratico medio delle celle. Si noti che i monociti vascolari mostrano sia un aumento dello spostamento che una maggiore velocità rispetto ai monociti parenchimali.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come tracciare i monociti del midollo osseo di topo in vivo utilizzando due immagini fotografiche Dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare la migrazione cellulare e l'interazione nel midollo osseo, che rappresentano un sito molto importante dell'emopoiesi, ma anche altre funzioni fondamentali come il priming dell'antigene e la memoria immunologica.