Analizzando gli effetti delle cellule stromali per il reclutamento dei leucociti da portata

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare in che modo le cellule residenti nei tessuti influenzano la capacità delle cellule endoteliali vascolari di favorire il reclutamento dei leucociti durante l'infiammazione. Questo viene ottenuto innanzitutto stabilendo colture cellulari condivise di cellule endoteliali con cellule staminali mesenchimali, utilizzando uno dei due modelli vascolari in vitro: il modello con microvetto e il modello con filtro. Successivamente, queste colture vengono trattate con citochine prima del saggio di flusso.

Il sistema di adesione basato sul flusso viene quindi assemblato passo dopo passo, con modifiche apportate a seconda del sistema modello utilizzato. L'ultimo passaggio consiste nel perfondere leucociti sulle cellule endoteliali e osservarne il reclutamento dal flusso e il successivo comportamento. In definitiva, questi saggi di adesione multicellulari basati sul flusso hanno dimostrato che il dialogo tra cellule staminali mesenchimali e cellule endoteliali sopprime il reclutamento dei neutrofili durante l'infiammazione.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del traffico dei leucociti, ad esempio: come modificano questo processo le cellule residenti nei tessuti, come ad esempio le cellule staminali mesenchimali? Tali modifiche si osservano in patologie come l'infiammazione cronica o il cancro? Possiamo utilizzare queste conoscenze per sviluppare nuove strategie terapeutiche? Per iniziare, si preparino colture cellulari miste di cellule endoteliali e cellule staminali mesenchimali utilizzando il modello con microslitta o il modello con filtro, come descritto nel protocollo testuale, per assemblare il sistema di flusso.

Accendere innanzitutto il riscaldatore e impostarlo a 37 gradi Celsius. Successivamente, collegare una siringa da 20 millilitri senza stantuffo e una siringa da cinque millilitri a un rubinetto a tre vie. Quindi misurare e tagliare un tratto lungo di tubo da 2,4 millimetri pari approssimativamente alla distanza tra la valvola e il rubinetto a tre vie.

Tagliare un pezzo di tubo da 8 a 10 millimetri di lunghezza e con diametro di 1,3 millimetri ed inserirlo in una estremità del tubo più spesso. Fissare il lato del tubo spesso al rubinetto a tre vie e collegare il tubo sottile all'estremità di una porta della valvola microfluidica elettronica a tre vie per formare il serbatoio di lavaggio.

Quindi fissare il rubinetto alla camera in plexiglas utilizzando nastro microporoso. Successivamente, preparare un pezzo di tubo sottile e uno spesso lungo da sei a otto millimetri, e inserire il tubo sottile in un'estremità del tubo spesso. Fissare l'estremità del tubo spesso a una siringa da due millilitri con lo stantuffo rimosso.

Ora collegare l'estremità del tubicino della siringa da due millilitri a una porta della valvola microelettronica per creare il serbatoio del campione. Successivamente misurare e tagliare un pezzo lungo di tubicino sottile corrispondente alla distanza tra la valvola microelettronica e il centro della piastra del microscopio. Per il modello di vetrino microscopico, fissare un pezzo di tubo spesso lungo otto-dieci millimetri all'estremità del tubicino sottile.

Quindi posizionare un connettore a forma di L all'estremità del tubo spesso. Questo verrà collegato al microscopio o al modello di filtro. Collegare un pezzo di tubo manometrico blu Portex lungo da otto a dieci millimetri all'estremità del tubo sottile.

Successivamente posizionare l'estremità del tubo sottile sulla microvalvola. Il tubo diventa l'uscita comune per i serbatoi di lavaggio e del campione. Riempire i serbatoi con soluzione salina tamponata al fosfato contenente albumina sierica bovina.

Abbreviato PBSA, prime il tubo facendo scorrere PBSA al suo interno per rimuovere eventuali bolle d'aria, quindi collega il tubo del manometro a una siringa di vetro da 50 millilitri. Mentre nel modello con vetrino microscopico si collega soltanto un pezzo di tubo spesso lungo 10-12 millimetri all'estremità del tubo del manometro che va verso la siringa di vetro. Inserisci un connettore a forma di L all'estremità del tubo spesso.

Primi la siringa riempiendola con 10 millilitri di PBSA. Capovolgi la siringa in modo che l'estremità collegata al tubo sia rivolta verso l'alto ed espelli tutte le bolle d'aria prima di riempirla nuovamente con cinque millilitri di PBSA. Infine, posiziona la siringa di vetro in una pompa per siringhe per l'infusione e il prelievo.

Impostare la velocità di ricarica e il diametro della siringa di vetro per configurare le microslitte per il flusso. Posizionare la microslitta sul portacampioni di un microscopio a contrasto di fase invertito. Ruotare il rubinetto a tre vie per permettere al PBSA di scorrere attraverso il tubo di ingresso.

Collegare il connettore a forma di L al porto di ingresso di un canale della microslitta. Successivamente, inserire il connettore a forma di L della pompa a siringa nel porto di uscita del canale. Rimuovere eventuali residui di PBSA che si sono depositati sulla microslitta.

In alternativa, per il modello con filtro, tagliare innanzitutto un pezzo di pellicola parafilm delle stesse dimensioni del coperchio in vetro utilizzando un modello metallico. Successivamente, ritagliare una finestra di 20 per quattro millimetri nella pellicola parafilm utilizzando un modello metallico per creare il canale di flusso. Utilizzare la guarnizione in paraform per segnare il canale di flusso sul coperchio in vetro.

Allineare i bordi del filtro da sei pollici sullo slip di vetro. Assicurarsi che il filtro copra completamente i segni del canale di flusso. Tagliare con attenzione il filtro utilizzando un bisturi di tipo 10.

Successivamente, coprire con attenzione il filtro con una guarnizione in paraform, assicurandosi che la fessura del canale di flusso sia al centro del filtro. Utilizzare un pezzo di carta da filtro pulita ed eliminare eventuali bolle d'aria. Posizionare ora il vetrino nella sede della piastra inferiore della camera di flusso in plexiglas.

Posizionare la piastra superiore in perspex sopra la guarnizione e avvitare insieme le piastre. Ruotare il rubinetto a tre vie per consentire al buffer di lavaggio PBSA di fluire attraverso la valvola. Successivamente, collegare il tubo del manometro alla porta di ingresso della piastra superiore in perspex.

Eseguire il PBSA attraverso il canale di flusso per consentire alle bolle di passare. Quindi collegare il tubo del manometro dalla pompa a siringa al porto di uscita della piastra in plexiglas. Rimuovere qualsiasi PBSA che sia gocciolato sulla piastra superiore della camera.

Infine, posizionare la camera sul portapreparati di un microscopio a contrasto di fase invertito e regolare la messa a fuoco per visualizzare le cellule endoteliali sopra i filtri al fine di perfondere i leucociti sulle cellule endoteliali. Impostare la pompa a siringa sulla modalità di ricarica e premere "esegui" una volta regolata la messa a fuoco. Per visualizzare il monostrato di cellule endoteliali, aggiungere due millilitri di neutrofili purificati nel serbatoio del campione e lasciare riscaldare per due minuti.

Quindi lavare l'endotelio con PBSA per due minuti. Aprire la valvola per perfondere i neutrofili sull'endotelio. Somministrare la boli di neutrofili per quattro minuti.

Chiudere il rubinetto ed eseguire la perfusione di PBSA dal serbatoio di lavaggio per il resto dell'esperimento. Durante l'esecuzione dell'esperimento, assicurarsi che non passino bolle d'aria in alcun punto del saggio, poiché ciò potrebbe alterare il monostrato di cellule endoteliali e causare il distacco dei neutrofili aderenti. Registrare il reclutamento dei neutrofili durante il flusso dei neutrofili o dopo la perfusione, utilizzando un software di acquisizione delle immagini digitali.

Identificare il centro del canale spostando l'obiettivo fino al bordo del canale nel punto di ingresso e individuando il centro del collegamento. Effettuare registrazioni digitali di almeno cinque-dieci campi posizionati al centro del canale di flusso durante il passaggio dei neutrofili. Acquisire immagini di un singolo campo ogni 10 secondi per un minuto, quindi spostarsi lungo il canale e registrare un altro campo per un minuto.

Ripetere questo processo per tutta la durata del bolo al fine di registrare il post perfusione. Effettuare una registrazione di dieci secondi di cinque-dieci campi al centro del canale di flusso per valutare il comportamento dei leucociti. Acquisire immagini ogni secondo all'interno dell'intervallo di dieci secondi.

Questo consente un tempo sufficiente per il catturamento dal flusso e per l'analisi del comportamento dei neutrofili aderenti. Registrare un singolo campo contenente almeno 10 neutrofili transmigrati per cinque minuti, acquisendo immagini ogni 30 secondi. Questo permette di calcolare la velocità delle cellule migrate; registrare un’altra serie di campi di dieci secondi.

Questo permette ai neutrofili di tempo per migrare attraverso il monostrato endoteliale. Infine, arrestare la pompa a siringa e rimuovere il tubo di uscita, quindi il tubo di ingresso; smontare la camera di flusso e risciacquare il serbatoio del campione con PBSA; ripetere per i successivi filtri e canali della microslitta prima di procedere all'analisi del reclutamento e del comportamento dei leucociti come descritto nel protocollo testuale. Nel modello della microslitta, la stimolazione con citochine mediante fattore di necrosi tumorale alfa ha aumentato significativamente l'adesione dei neutrofili all'endotelio in modo dose-dipendente.

Inoltre, si è osservata una diminuzione dipendente dalla dose di TNF-alfa nella percentuale di neutrofili che rotolano sulla superficie endoteliale. Ciò si rifletteva in un aumento dipendente dalla dose di TNF-alfa nella percentuale di neutrofili che migravano attraverso il monostrato endoteliale, sottoponendosi quindi alla migrazione transendoteliale. Risultati simili sono stati osservati con il saggio di flusso basato su filtro.

Ad esempio, la stimolazione da TNF alpha ha aumentato l'adesione dei neutrofili in maniera dose-dipendente. La coltura congiunta di cellule endoteliali con cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo ha ridotto significativamente l'adesione dei neutrofili rispetto alle cellule endoteliali coltivate da sole, come previsto per il modello con microvetrino.

Anche in questo caso, effetti simili sono stati osservati quando è stato utilizzato il modello basato su filtro, con un'adesione minore riscontrata nella co-coltura rispetto alla monocultura. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare il modo in cui le cellule stromali comunicano con le cellule endoteliali per influenzare il reclutamento dei leucociti durante l'infiammazione.