Name: Istituzione di umano epiteliali Enteroids e Colonoids dal tessuto intero e biopsia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Impara a generare enteroidi e colonoidi umani da biopsie intestinali utilizzando matrice di membrana basale. Questo metodo consente studi specifici del paziente su malattie intestinali e biologia epiteliale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo il Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Paesi Bassi) per il gentile dono delle cellule TOPflash.
Questo progetto è stato supportato in parte da NIH-R01DK083325 (MAH); NIH P30 DK078392 (Centro per la salute dell'apparato digerente); NIH UL1RR026314 (CTSA).

NOTA: Etica Dichiarazione: Tutti sperimentazione utilizzando tessuti umani descritti nel presente documento è stato approvato da un IRB a CCHMC (IRB # 2012-2858; # 2.014-0.427). Il consenso informato per la raccolta dei tessuti, lo stoccaggio e l&#39;uso dei campioni è stato ottenuto da donatori a CCHMC. 1. Preparazione per la Cultura NOTA: Tutti i reagenti sono elencati nella tabella 1. <ol><li> Preparare soluzione stock EDTA come segue: preparare 0,5 M di acido etilendiamminotetraacetico, pH 8 (EDTA) in ultrapura H 2 O, filtro sterilizzato con 0,22 micron filtro. Facoltativamente, conservare la soluzione EDTA stock in RT a tempo indeterminato. </li><li> Preparare tampone chelante come segue: mescolare 2% sorbitolo, 1% di saccarosio, 1% frazione albumina sierica bovina V (BSA) e 1x Gentamicina / soluzione amfotericina in fosfato di Dulbecco tamponata salina senza Ca 2+ e Mg 2+ (DPBS), filtro sterilizzato con 0,22 micron filtro. Preparare il buf chelantefer fresco. </li><li> Preparare medio Wnt-3A condizionata come segue: media Wnt-3A-condizionata è fatta in casa utilizzando la linea cellulare L Wnt-3A secondo le istruzioni del produttore (ATCC, CRL-2647). Supplemento alla media con glutammina 2 mM, HEPES 10 mM, 100 U / ml di penicillina, 100 g / ml di streptomicina, 1 N2 supplemento, 1 B27 supplemento, 1% BSA e filtro sterilizzato con filtro 0,22 micron. NOTA: test ogni lotto per l&#39;attività Wnt usando un test TOPflash. Utilizzare una stabile linea cellulare HEK293 TOPflash (Hans Clevers laboratorio) con un kit di test luciferasi Renilla secondo le istruzioni del produttore. Normalizzare il saggio TOPflash con 100 ng / ml ricombinante Wnt-3A umana. Conferma almeno un&#39;attività di 10 volte cambiamento dei media condizionati rispetto al controllo. Dividere fresco medio Wnt-3A-condizionata in 10 ml aliquote in 15 ml provette coniche e congelare a -20 ° C per un massimo di 6 mesi. Conservare scongelato aliquote fino a 5 giorni a 4 ° C senza perdita di attività. </li><li> Prepare medio minigut umana come segue: Supplemento avanzata DMEM / F12 con glutammina 2 mM, HEPES 10 mM, 100 U / mL di penicillina, 100 g / mL di streptomicina, 1 N2 integratore, 1 B27 supplemento, 1% BSA e filtro sterilizzato con 0,22 Filtro micron. NOTA: Dividere mezzo fresco minigut umano in 10 ml aliquote in 15 ml provette coniche e congelare a -20 ° C per un massimo di 3 mesi. Conservare scongelato aliquote fino a 5 giorni a 4 ° C senza perdita di attività. </li><li> Preparare mezzo completo minigut umana come segue: Preparare fresco prima cultura cripta o medio cambiamento medio minigut umana (cfr 1,4) integrato con il 50% Wnt-3A-condizionata medie (vedi 1.3), 1 mg / ml di R-spondina 1 (1: 1.000 diluizione di 1 mg / ml di brodo), 100 ng Noggin / ml (1: 1.000 diluizione di 100 g / mL archivio), 50 ng / mL EGF (1: 10.000 diluizione di 500 mg / mL archivio), 500 nM A-83 -01 (1: 1.000 diluizione 500 m stock), 10 mM SB202190 (1: 3.000 diluizione 30 magazzino mM), 10 nM [Leu] 15-Gastrina 1 (1: 10.000 diluizione 100 micronazione), Nicotinamide 10 mm (1: 100 diluizione di 1 m stock) e 1 mm N-Acetilcisteina (1: 1.000 diluizione di 1 m stock). NOTA: Conservare i media minigut umani completi fino a 2 giorni a 4 ° C senza perdita di attività. </li></ol> 2. Cripta isolamento da tutto il tessuto NOTA: Dalla collezione tessuti, è essenziale mantenere il campione in soluzione salina. Si raccomanda di mantenere il tessuto in ghiaccio durante il trasporto. Preparazione del campione per l&#39;isolamento della cripta deve essere eseguita appena possibile. NOTA: Tutti i reagenti sono elencate nella Tabella 1, strumenti, attrezzature, e materiali di consumo sono elencate nella tabella 2. <ol><li> Preparare tutti i reagenti prima di iniziare l&#39;esperimento. Scongelare la matrice membrana basale su ghiaccio e pre-incubare una piastra da 24 pozzetti in un CO 2 incubatore a 37 ° C. NOTA: In alternativa fare un sottile strato di matrice membrana basale utilizzando 15 microlitri / pozzetto nel centro di un 24Piastra -well e collocarlo in un incubatore CO 2 a 37 ° C. Questo passaggio facoltativo mantiene seminterrato matrice di membrana come una goccia durante la polimerizzazione. </li><li> Lavare il tessuto con ghiacciata fosfato di Dulbecco tamponata salina senza Ca 2+ e Mg 2+ (DPBS). Proseguire fino al contenuto di DPBS è chiara. </li><li> Usando 0,2 millimetri di diametro minutien perni, fissare il tessuto su un vetro Petri dish siliconata riempito con DPBS gelide. Allungare e pin il tessuto piana con il lato rivolto verso l&#39;alto della mucosa. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere la mucosa sovrastante dalla sottomucosa e tessuto connettivo con le forbici micro-dissezione e punta fine pinze curve (Figura 2A, B). </li><li> Allungare e pin la sezionato mucosa piatta sul piatto di vetro siliconato Petri con il lato rivolto verso l&#39;alto della mucosa. La sottomucosa rimanente e del tessuto connettivo possono essere scartati o utilizzati per ulteriori esperimenti (Figura 2C). </li><li> Delicatamenteraschiare la superficie della mucosa con pinze curve. Questo passo è necessario per migliorare la qualità della preparazione. <ol><li> Per tenue, raschiare delicatamente la mucosa per rimuovere i villi. </li><li> Per colon, raschiare delicatamente la mucosa per rimuovere muco e detriti. </li></ol></li><li> Lavare la mucosa 3-4 volte con tampone chelazione ghiacciato per rimuovere villi e detriti. </li><li> Coprire la mucosa con appena preparato tampone chelazione 2mM EDTA (200 ml 0.5 M EDTA in 49,6 ml tampone di chelazione). </li><li> Porre la capsula Petri sul ghiaccio e agitare delicatamente per 30 minuti su un agitatore orbitale orizzontale. </li><li> Lavare il tessuto 3-4 volte con tampone chelazione gelida, senza EDTA. Dopo il lavaggio, lasciare la mucosa in tampone chelazione gelida. </li><li> Elaborare la mucosa sotto un microscopio da dissezione con pinze curve e sottili. Raschiare delicatamente la mucosa per liberare cripte intestinali utilizzando le pinze curve. </li><li> Rimuovere delicatamente la sospensione cripta dalla capsula di Petri con un piPette e le trasferisce in una provetta conica da 50 ml. NOTA: controllare il tessuto per assicurarsi che quasi tutti cripte sono stati rimossi dalla mucosa. </li><li> Filtrare la sospensione cripte attraverso un 150 micron in rete 2 volte. NOTA: controllare il flusso attraverso cripta arricchimento al microscopio (Figura 2D). </li><li> Centrifugare la cripta di sospensione 5 min a 50 xg, 4 ° C. Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in 5 ml di tampone chelazione ghiacciata. </li><li> Contare il numero di cripte per caduta di 10 microlitri della sospensione dal punto 2.15. Trasferire il numero di cripte necessari per la placcatura a 5 ml tubo a fondo rotondo. Usa 200 a 500 cripte per pozzetto di un piatto 24 pozzetti per stabilire enteroids o colonoids. </li><li> Centrifugare la frazione cripta per 10 minuti a 150 g, 4 ° C. Rimuovere il surnatante. </li><li> Utilizzare cripte per la cultura successiva. </li></ol> 3. Cripta Isolamento da biopsia <ol><li> Preparare tutti i reagenti primainizio dell&#39;esperimento. Scongelare la matrice membrana basale su ghiaccio e pre-incubare una piastra da 24 pozzetti in un CO 2 incubatore a 37 ° C. </li><li> Lavare la biopsia con ghiacciata fosfato di Dulbecco tamponata salina senza Ca 2+ e Mg 2+ (DPBS). </li><li> Usando 0,1 millimetri di diametro minutien perni, fissare la biopsia su un vetro Petri dish siliconata riempito con DPBS gelide. Allungare e pin mucosa piatta con il lato rivolto verso l&#39;alto della mucosa (Figura 2E). </li><li> Raschiare delicatamente la superficie della mucosa con pinze curve per rimuovere villi e detriti. Questo passo è necessario per migliorare la qualità della preparazione. </li><li> Lavare la biopsia 3-4 volte con tampone chelazione ghiacciato per rimuovere villi e detriti. </li><li> Coprire la biopsia con appena preparato tampone chelazione 2mM EDTA (200 ml 0.5 M EDTA in 49,8 ml tampone di chelazione). </li><li> Porre la capsula Petri sul ghiaccio e agitare delicatamente per 30 minuti su un agitatore orbitale orizzontale. </li> &lt;li&gt; Lavare la biopsia 3-4 volte con tampone chelazione gelida, senza EDTA. Dopo il lavaggio, lasciare la biopsia nel buffer di chelazione gelida. </li><li> Elaborare la biopsia sotto un microscopio da dissezione con pinze curve e sottili. Raschiare delicatamente la mucosa per liberare le cripte intestinali con pinze curve. </li><li> Rimuovere delicatamente la sospensione cripta dalla capsula di Petri con una pipetta e trasferirlo in una provetta da 50 ml. NOTA: controllare il tessuto per assicurarsi che quasi tutti cripte sono stati rimossi dalla mucosa. </li><li> Filtrare la sospensione cripta attraverso un nylon 150 micron maglia 2 volte. NOTA: controllare il flusso attraverso cripta arricchimento al microscopio. </li><li> Centrifugare la cripta di sospensione 5 min a 50 xg, 4 ° C. Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in 1 ml ghiacciata buffer di chelazione. Trasferire la sospensione cripta in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Centrifuga la frazione cripta per 10 minuti a 150 xg, 4 ° C. Rimuovere il surnatante. &lt;/ Li&gt; <li> Utilizzare cripte per la cultura successiva. </li></ol> 4. Cripta Cultura a matrice di membrana basale <ol><li> Utilizzando puntali pre-refrigerati, risospendere il pellet crypt (dal punto 2.18 o 3.15) in membrana basale matrice (200 a 500 cripte / 50 ml seminterrato matrice di membrana). </li><li> Applicare 50 ml di sospensione cripta a membrana matrice seminterrato per bene sul piatto pre-riscaldato. Lentamente estrarre la matrice di membrana basale nel centro del pozzo. </li><li> Posizionare la piastra a 24 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 30 min per permettere una completa polimerizzazione della matrice membrana basale. </li><li> Sovrapporre la matrice membrana basale con 500 ml di mezzo completo minigut umano integrato con 2,5 micron CHIR99021 (1: 4.000 diluizione 10 stock mM) e 2,5 micron Thiazovivin (1: 4.000 diluizione 10 stock mM). </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Sostituire il mezzo con Huma fresca completan minigut media ogni 2 giorni. </li></ol> 5. Passaging di Colta Enteroids e Colonoids. NOTA: Passage Enteroids e Colonoids ogni 7 a 10 giorni dopo la placcatura iniziale. In generale, dividere un bene nel 3 a 4 pozzi. <ol><li> Preparare tutti i reagenti prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento. Scongelare la matrice membrana basale su ghiaccio e pre-incubare una piastra da 24 pozzetti in un CO 2 incubatore a 37 ° C. </li><li> Rimuovere il supporto con punte sterili e overlay con 1 ml di DPBS ghiacciate. </li><li> Pipetta avanti e indietro con una punta di 1.000 ml. Trasferire la soluzione in un nuovo tubo da 15 ml. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno minigut umana integrata con 5% FBS per 1 ml di terreno. </li><li> Centrifugare la soluzione per 5 min a 50 xg, a 4 ° C. Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet con 2 ml di dissociazione cellulare dell&#39;enzima supplementato con 10 mM Y-27632 (1: 1.000 diluizione 10 stock mM). Incubare per 5 min a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Dissociare il grumi di cellule utilizzando una siringa da 3 ml Luer-Lock dotato di un 18-G di riempimento / ago smussato. Pipetta delicatamente la soluzione avanti e indietro con la siringa per 10 volte. </li><li> Centrifugare la sospensione per 5 minuti a 500 xg, a 4 ° C. Scartare il surnatante. </li><li> Utilizzando puntali pre-refrigerati, risospendere il pellet cellulare in matrice di membrana basale. </li><li> Applicare 50 ml di sospensione cripta a membrana matrice seminterrato per bene sul piatto pre-riscaldato. Lentamente estrarre la matrice di membrana basale nel centro del pozzo. </li><li> Posizionare la piastra a 24 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 20 min per permettere una completa polimerizzazione della matrice membrana basale. </li><li> Sovrapporre la matrice membrana basale con 500 ml di mezzo completo minigut umano integrato con 10 pM Y-27632 (1: 1.000 diluizione 10 stock mM). </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Dopo 2 giorni, Sostituire il mezzo con fresco mezzo completo minigut umano supplementato con 10 micron Y-27632 (1: 1.000 diluizione 10 stock mM). Successivamente, sostituire il mezzo fresco con mezzo completo, minigut umana ogni altro giorno. </li></ol> 6. Il congelamento di Colta Enteroids e Colonoids NOTA: Di solito congelare un pozzetto in 2-3 cryovials. <ol><li> Ripetere i punti da 5.1 a 5.8. </li><li> Risospendere il pellet con il mezzo di congelamento freddo. Trasferire 1 ml di congelamento soluzione in una provetta Microbank ™ etichetta. Posizionare il esageratamente in un recipiente congelamento contenente 500 ml di alcool isopropilico. </li><li> Trasferire il contenitore di congelamento di un C congelatore 80 ° per 24 ore, poi il trasferimento esageratamente allo stoccaggio di azoto liquido. NOTA: Conservare Enteroids e Colonoids fino a 1 anno. </li></ol>

<ol><li>Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal development and differentiation.</a> Exp Cell Res. 317 (19), 2702-2710 (2011).</li>
<li>Shroyer, N. F., Kocoshis, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShroyer%2C+NF+%22Pediatric+Gastrointestinal+and+Liver+Diseases%22">Pediatric Gastrointestinal and Liver Diseases</a>. Hyams, J. R. W. III , Elsevier. 324-336 (2010).</li>
<li>Leushacke, M., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+the+intestinal+epithelium%3A+strategies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications.</a> Gut. , (2014).</li>
<li>Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+intestinal+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation.</a> Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Mahe, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Gastrointestinal+Epithelial+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 3, 217-240 (2013).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">A nomenclature for intestinal in vitro cultures.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (12), G1359-G1363 (2012).</li>
<li>Ramalingam, S., Daughtridge, G. W., Johnston, M. J., Gracz, A. D., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+levels+of+Sox9+expression+mark+colon+epithelial+stem+cells+that+form+colonoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct levels of Sox9 expression mark colon epithelial stem cells that form colonoids in culture.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (1), G10-G20 (2012).</li>
<li>Furstenberg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+mouse+jejunal+epithelial+cells+with+CD24+yields+a+population+with+characteristics+of+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sorting mouse jejunal epithelial cells with CD24 yields a population with characteristics of intestinal stem cells.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (3), G409-G417 (2011).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Intestinal+Stem+Cells+Based+on+Surface+Marker+Combinations+and+Colony-Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Intestinal Stem Cells Based on Surface Marker Combinations and Colony-Formation Assay.</a> Gastroenterology. , (2013).</li>
<li>Yan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+stem+cell+markers+Bmi1+and+Lgr5+identify+two+functionally+distinct+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (2), 466-471 (2012).</li>
<li>Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dll1%2B+secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nat Cell Biol. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li>
<li>Yui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+engraftment+of+colon+epithelium+expanded+in+vitro+from+a+single+adult+Lgr5%28%2B%29+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell.</a> Nat Med. 18 (4), 618-623 (2012).</li>
<li>Durand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+intestinal+stem+cells+after+Paneth+cell+ablation+induced+by+the+loss+of+transcription+factor+Math1+%28Atoh1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), 8965-8970 (2012).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).</li>
<li>Akcora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CSF-1+receptor+fashions+the+intestinal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The CSF-1 receptor fashions the intestinal stem cell niche.</a> Stem Cell Res. 10 (2), 203-212 (2013).</li>
<li>Farin, H. F., Van Es, J. H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+sources+of+Wnt+regulate+intestinal+stem+cells+and+promote+formation+of+Paneth+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).</li>
<li>Rothenberg, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cKit%28%2B%29+colonic+crypt+base+secretory+cell+that+supports+Lgr5%28%2B%29+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice.</a> Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peyer%27s+patch+M+cells+derived+from+Lgr5%28%2B%29+stem+cells+require+SpiB+and+are+induced+by+RankL+in+cultured+%27miniguts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured 'miniguts.</a> Mol Cell Biol. 32 (18), 3639-3647 (2012).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Jung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+expansion+of+human+colonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells.</a> Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li>
<li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. , (2014).</li>
<li>Fuller, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cells+remain+viable+after+prolonged+tissue+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cells remain viable after prolonged tissue storage.</a> Cell Tissue Res. 354 (2), 441-450 (2013).</li>
<li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).</li>
<li>Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+potentiates+TGF-beta+signaling+to+promote+colonic+crypt+regeneration+after+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury.</a> Science. 338 (6103), 108-113 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+Marked+by+the+R-Spondin+Receptor+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Stem Cells Marked by the R-Spondin Receptor Lgr5.</a> Gastroenterology. , (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 16-19 (2009).</li>
<li>Tojo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ALK-5+inhibitor+A-83-01+inhibits+Smad+signaling+and+epithelial-to-mesenchymal+transition+by+transforming+growth+factor-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta.</a> Cancer Sci. 96 (11), 791-800 (2005).</li>
<li>Gafni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li>
<li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Exp Biol Med (Maywood). , (2014).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li>
<li>Kovbasnjuk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids%3A+preclinical+models+of+non-inflammatory+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Human enteroids: preclinical models of non-inflammatory diarrhea.</a> Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S3(2013).</li>
<li>Fujii, M., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+intestinal+stem+cells%3A+applications+for+colorectal+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Culturing intestinal stem cells: applications for colorectal cancer research.</a> Front Genet. 5, 169(2014).</li>
<li>Koo, B. K., Sasselli, V., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+gene+expression+control+in+primary+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral gene expression control in primary organoid cultures.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo metodo fornisce un sistema completo riprodurre linee dell&#39;epitelio intestinale e dinamiche epiteliali che costituiscono un utile strumento per studiare la biologia epiteliale intestinale. Il metodo presentato qui è stato adattato dallo studio murino originale di Sato e Clevers 22 che si traduce in modo efficiente in enteroids umani e colonoids. Qui, abbiamo scelto manualmente le cripte per microdissezione per evitare contaminanti cellulari. Questo metodo permette una visualizzazione diretta delle cripte e porta a consistenza straordinari rispetto alla raccolta cripta originale &quot;agitando&quot;. Altri gruppi hanno sviluppato tecniche simili utilizzando approcci leggermente diversi soprattutto sostituiscono la chelazione da EDTA con collagenasi 25. Oltre alle differenze di raccolta cripta, tali tecniche utilizzano un supporto definito che è necessaria per far crescere i enteroids umani in coltura 22. Per aumentare l&#39;efficienza crescita a crypt semina, aggiungiamo un inibitore GSK3 (CHIR99021)per i primi due giorni a 12. La movimentazione del tessuto o biopsie è importante e l&#39;isolamento cripta deve essere eseguita non appena il tessuto arriva in laboratorio. Tuttavia, ritardata isolamento e la coltura cripta potrebbero essere eseguite fino a 24 ore dopo la raccolta del tessuto (dati non mostrati) come precedentemente descritto per il tessuto murino 26. Il tessuto intestinale deve essere posto in una provetta conica completamente riempito con DPBS per evitare perturbazioni del tessuto devono essere mantenuti a 4 ° C. La preparazione ritardata permette per trasporto tessuto ma la variazione di temperatura deve essere evitato durante il trasporto. Il tempo complessivo necessario per il fasciame cripta iniziale è di circa 2 ore con 15 a 30 minuti per elaborare il tessuto e da 1 a 2 ore per isolare e piastra cripta. La microdissezione del tessuto è un fattore determinante e predicato di una preparazione crypt pulito. Tuttavia, il rilascio cripta mano tremare, come descritto in diversi protocolli è possibile 22,23. Nonostante le analogie con il sistema enteroid murino (enteroids), le enteroids umani richiedono specifiche molecole per migliorare e sostenere la loro crescita nel tempo. I fattori di crescita, EGF, Noggin, R-spondina vengono utilizzati in modo simile ai organoidi epiteliali murine. Tuttavia, l&#39;uso di Wnt-3A è critica. Abbiamo notato che la formazione e l&#39;efficienza di crescita è maggiore utilizzando un mezzo condizionato Wnt-3A rispetto alla proteina umana ricombinante. Contemporaneamente, abbiamo dimostrato condizioni di coltura migliorate utilizzando un inibitore della chinasi glicogeno sintasi 3 (CHIR99021) 12. Fattori di crescita ricombinanti potrebbero essere sostituiti da Wnt-3A, R-spondina, e Noggin condizionato-media. Una linea L-cell-Wnt-3A espressione è disponibile in commercio (ATCC). Altri gruppi hanno sviluppato R-spondina 1- 23,27, Noggin- 19, e Wnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28 esprimere linee cellulari. Due inibitori piccole molecole vengono utilizzati nella cultura media e sono necessari per il mantenimento della cultura 29. A-83-01 è un inibitore selettivo della trasformazione β fattore di crescita e Activin / recettori nodali (activina-like chinasi 4, 5, 7) e SB202190 è un inibitore della proteina chinasi p38 mitogeno-attivata (MAPK). Entrambi gli inibitori sono stati utilizzati rispettivamente per sostenere umana indotte pluripotenti cellule staminali di auto-rinnovamento e di stabilire naïve cellule staminali pluripotenti umane 30-32. Inoltre, nicotinamide, un precursore di nicotinamide adenina dinucleotide, è necessario per mantenere enteroids ed espansione colonoids in modo lungo termine 22,29. La chelazione EDTA è un passo importante in quanto determina il rendimento dalla preparazione cripta. Abbiamo avuto successo con 2 trattamento mM EDTA. Tuttavia, la concentrazione EDTA può essere modificato da 2 mM a 15 mM relative al tipo di tessuto. In tal caso, il tempo di incubazione deve essere determinato empiricamente. Dopo la placcatura iniziale, la cripta arrotonderà-up e alla fine formano enteroids. Tuttavia, i enteroids o colonoids spesso mostrano un fenotipo &quot;radice&quot; formando sfere con poco o nessun cellule differenziate. In tal caso, la differenziazione può essere avviata prelevando Wnt-3A, nicotinamide e l&#39;inibitore p38 MAPK. L&#39;uso di inibitori Notch come DAPT o DBZ aiuta migliorare la differenziazione all&#39;interno dei enteroids 22. Questo modello ricapitola la fisiologia intestinale con eventi-cripta erba continui derivanti da un compartimento di cellule staminali e domini epiteliali dei villi-like contenenti sia di assorbimento e di secrezione differenziata lignaggi. È interessante notare che questo sistema non contiene cellule mesenchimali e utilizza specifiche condizioni dei media per soddisfare i requisiti del segnale di nicchia. Come il modello murino, enteroids umani possono essere generati da isolate cellule epiteliali intestinali per testare la capacità di queste cellule di funzionare come una cellula staminale. Sevestudi ral hanno utilizzato gruppo di marcatori di differenziazione (CD44, CD24 e CD166) e le cellule positive EphB2 per arricchire per le cellule con proprietà staminali 12,23,33. Insieme, questi studi dimostrano l&#39;utilità di enteroids umane culture per testare la staminalità. Altri ricercatori stanno utilizzando questo modello per studiare malattie intestinali quali le malattie infettive diarroiche, la fibrosi cistica, o tumori colorettali 22,34-37. Questi studi dimostrano che enteroids umani costituiscono un modello affidabile malattia umana con la possibilità di muoversi in direzione di uno screening personalizzato. Enteroids umani possono essere geneticamente modificati utilizzando trasfezione DNA o infezione con particelle virali 38. Ciò fornisce un potente strumento per studiare le funzioni specifiche del gene nei organoidi epiteliali umane o correggere le mutazioni genetiche. Recentemente, Schwank e colleghi hanno dimostrato la possibilità di modificare il genoma con il sistema CRISPR / Cas9 e correggere la mutazione sul gene CFTR causando acfibrosi ystic 24. Enteroids umane costituiscono un sistema prezioso per lo studio delle cellule staminali intestinali e epiteliali della mucosa biologia e servire come un sistema sperimentale romanzo di studiare sia normale e anormale fisiologia gastrointestinale.

L&#39;epitelio rivestimento del tratto gastrointestinale è in costante rinnovamento. Questo processo è innescato da proliferazione delle cellule staminali intestinali (ISC) che producono continuamente progenie di sostituire rapidamente l&#39;epitelio intestinale come si gira. Il vano proliferativa comprendente le ISC si limita al fondo delle cripte. Le ISC danno origine a una progenie che alla fine differenziarsi in assorbimento o lignaggi secretoria. Spostamento dalla cripta e sulla villi o la superficie epitelio, cellule si differenziano progressivamente quando migrano verso l&#39;alto prima di esfoliazione nel lume 1. ISC danno origine a tutti i tipi di cellule epiteliali intestinali tra cui enterociti, cellule, cellule microfold enteroendocrine, cellule del calice, cellule ciuffo e cellule Paneth. Il colon è caratterizzato da cripte allungati composte principalmente di colonociti e cellule calice, con enteroendocrine sparse e cellule ciuffo 2. Ex vivo culsistemi ture costituiscono strumento promettente per lo studio ISC manutenzione e omeostasi tessuto intestinale. Tuttavia, è difficile fare affidamento su tecnologie di coltura di tessuti come condizioni fisiologiche non sono completamente riprodotti e il microambiente epiteliale spesso alterati 3,4. Un grande passo avanti nel campo ISC è stata la creazione di tecniche di coltura di tessuti per mantenere ed espandere i singoli CSI murini utilizzando fattori di crescita definiti per sostituire i normali segnali di nicchia intestinale. Condizioni di coltura a lungo termine sono stati descritti da Sato et al., In cui singoli cripte o cellule staminali isolate dalla epitelio intestinale crescono a formare strutture epiteliali 3-dimensionale compresa più domini cripta simili 5-7. Queste strutture tridimensionali subiscono eventi di fissione per espandere continuamente. È interessante notare, tutti i tipi di cellule intestinali specifici del tessuto di origine vengono prodotti e così vengono estrusi in un lume 8. Usando modifiche di questo sistema, epitelialeorganoidi possono essere generati dallo stomaco, intestino tenue e colon. Più specificamente, organoidi epiteliali dell&#39;intestino tenue sono enteroids 9, e quelli del colon sono colonoids 9,10. Questi epiteliali sistemi di coltura organoide sono stati utilizzati per testare la capacità di isolate cellule singole a funzionare come cellule staminali in vitro, testando così la &quot;staminalità&quot; di cellule isolate 5,6,10-15. Altri ricercatori hanno usato sia enteroids e colonoids per studiare la funzione di singole cellule epiteliali 16-21. Così, le culture e enteroid colonoid possono essere utilizzati per valutare sia le funzioni di staminali e di cellule non-staminali e dare una nuova visione delle interazioni cellulari fondamentali all&#39;interno dell&#39;intestino. Nel 2011, Sato e colleghi generato cultura a lungo termine di organoidi epiteliali derivati ​​dal piccolo intestino umano e colon 22,23. Oltre alle differenze nella composizione media, le enteroids epiteliali umanee colonoids presentano le stesse caratteristiche come la loro controparte murina. Inoltre, possono essere generati da tessuti malati come l&#39;esofago di Barrett, adenoma o adenocarcinoma, e fibrosi cistica 22,24. Enteroids umane costituiscono un sistema prezioso per lo studio delle cellule staminali intestinali e epiteliali della mucosa biologia e servire come un sistema sperimentale romanzo studiare la fisiologia gastrointestinale sia normale e anormale 3. Qui si descrivono i metodi per stabilire enteroids e colonoids dal piccolo intestino umano e cripte del colon (Figura 1). In questa recensione metodologica, sottolineiamo la raccolta cripta dal tessuto insieme e biopsie. Abbiamo Ricapitoliamo le modalità di coltura che sono essenziali per la crescita e il mantenimento di enteroids e colonoids umani e le possibili strategie sperimentali svolte da questo modello di successo.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato Ca2+, Mg2+ free (DPBS)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitolo</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP439-500</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA) Frazione V</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Gzntamicina/Amfotericina B</td><td>Tecnologie per la vita; Fluido condizionato Gibco</td><td>R-015-10</td><td></td></tr><tr><td>Wnt-3A</td><td>in casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnologie avanzate DMEM/F12</td><td>Life; Gibco</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (glutammina)</td><td>Tecnologie per la vita; Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>N2 Integratore</td><td>Tecnologie per la vita; Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplemento</td><td>Tecnologie per la vita; Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotidamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, GFR, senza fenolo (matrice della membrana basale)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Noggin ricombinante umano</td><td>R& D</td><td>6057-NG/CF</td><td></td></tr><tr><td>umano ricombinante R-Spondin</td><td>Preprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>umano ricombinante EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>umano [Leu]15- Gastrin 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), rosso fenolo (enzima di dissociazione cellulare)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino Life</td><td>technologies; Gibco</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>CTS Synth-a-Freeze Medium (mezzo di congelamento)</td><td>Tecnologie di vita; Linea cellulare Gibco</td><td>A13713-01</td><td></td></tr><tr><td>L Wnt-3A</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>Saggio della luciferasi Renilla</td><td>Promega</td><td>E2710</td><td></td></tr><tr><td>ricombinante umano Wnt-3A</td><td>R& D</td><td>5036-WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 Linea di celle</td><td></td><td></td><td></td> TOPflash</tr></tbody></table>

istituzione di umano epiteliali enteroids e colonoids dal tessuto intero e biopsia

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

L'epitelio del tratto gastrointestinale si rinnova costantemente man mano che si capovolge. Questo processo è innescato dalla proliferazione delle cellule staminali intestinali (ISC) e della progenie che migrano e si differenziano progressivamente verso la punta dei villi. Questi processi, essenziali per l'omeostasi gastrointestinale, sono stati ampiamente studiati utilizzando molteplici approcci. Le tecnologie ex vivo, in particolare le colture cellulari primarie, si sono dimostrate promettenti per la comprensione delle funzioni epiteliali intestinali. È stato creato un sistema di coltura primaria a lungo termine per cripte intestinali di topo per generare organoidi epiteliali tridimensionali. Queste strutture epiteliali contengono domini simili a cripte e villi che ricordano il normale epitelio intestinale. Comunemente, chiamati "enteroidi" quando derivati dall'intestino tenue e "colonoidi" quando derivati dal colon, sono diversi dagli organoidi che contengono anche tessuto mesenchimico. Inoltre, questi enteroidi/colonoidi producono continuamente tutti i tipi di cellule che si trovano normalmente all'interno dell'epitelio intestinale. Questo sistema di coltura in vitro simile a un organo sta rapidamente diventando il nuovo standard di riferimento per lo studio della biologia delle cellule staminali intestinali e della fisiologia delle cellule epiteliali. Questa tecnologia è stata recentemente trasferita allo studio dell'intestino umano. La costituzione di enteroidi epiteliali e colonoidi di derivazione umana dall'intestino tenue e dal colon è stata possibile attraverso l'utilizzo di specifici terreni di coltura che ne consentono la crescita e il mantenimento nel tempo. Qui, descriviamo un metodo per stabilire un sistema derivato dalla cripta dell'intestino tenue e del colon da tessuto umano intero o biopsie. Sottolineiamo le modalità di coltura che sono essenziali per la crescita e il mantenimento di successo di enteroidi e colonoidi umani.

La figura 2D mostra un tipico esempio di cripte appena isolate da tutto il tessuto (Figura 2D). Il numero di cripte isolate da una biopsia è inferiore nel tessuto intero. Utilizzando pinze capacità standard di biopsia con ago, di solito effettuiamo due morsi biopsia su un unico passaggio. Ogni risultati morso biopsia in una superficie 10 mm 2 con una media di 50 a 100 cripte per biopsia (Figura 2F). Dopo la cultura in matrice membrana basale, le cripte completano a formare enterospheres per tenue e colonospheres per colon. La cripta erba di solito si verifica entro 5 o 6 giorni, dopo la semina. Tuttavia non è raro vedere sia enteroids (enteroids) o colonoids (colonoids) formano sfere della matrice membrana basale (Figura 3A-C, Movie 1). Il passaging può essere effettuata dopo 7 giorni, a seconda delle dimensioni delle enteroids. Il enteroids o colonoids establmentata da biopsie subiscono lo stesso sviluppo della cultura. Tuttavia, poiché la densità cripta di semina è inferiore, il passaging viene di solito effettuata dopo 10 a 12 giorni di coltura (figura 4a, b). Enteroids e colonoids culture espandono in modo riproducibile. Entrambi enteroids e colonoids presentano un lato luminale e sono rivestiti con un epitelio (Figura 5A, B). Le cellule proliferative si possono osservare nei enteroids e si trovano all&#39;interno delle punte del germoglio (figura 5C, D). Confocale di enteroids colorati con E-caderina (Ecad) mostra le cellule epiteliali (Figura 5E). Sia enteroids e colonoids possono essere stabiliti dal tessuto ottenuti da pazienti affetti da malattie genetiche / congenite. La figura 6 mostra enteroids rappresentativi che crescono da un paziente con fibrosi cistica (Figura 6A) e una enteropatia trapunto a causa di una mutazione congenita nell&#39;annuncio cellule epitelialigene coesio molecola (EpCAM) (Figura 6B). Oltre al difetto genetico, i enteroids non presentano differenze di condizioni basali. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig1highres.jpg" /> Figura 1. Flusso di lavoro di cripte dissociazione e la generazione di enteroids umani e colonoids in coltura. Cripte (dal piccolo intestino o colon umano) sono isolati dal EDTA chelazione. Cripte coltivate formano enteroids per l&#39;intestino tenue e colonoids per il colon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig2highres.jpg" /> Figura 2. processo di dissezione per l&#39;isolamento cripta. (A) L&#39;intestino tenue specimen è allungata e appuntato piatta in una capsula di Petri siliconata. (B) La mucosa è separata dalla sottomucosa sottostante. (C) La mucosa sezionato è allungata e appuntato piatta in una capsula di Petri siliconata. (D) Dopo EDTA chelazione, cripte sono isolate dal tessuto. (E) Una biopsia è allungata e appuntato piatta in una capsula di Petri siliconata. (F) Dopo EDTA chelazione, cripte sono isolati dalla biopsia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig3highres.jpg" /> Figura 3. cultura Cripta e enteroid umana e la generazione colonoid dal tessuto intero. (A) cripte digiunale placcato in matrice membrana basale dopo l&#39;isolamento. Le cripte stanno chiudendo dopo 3 a 4 ore e iniziano a palloncino fino a formare enterospheres oltre tale termine. In 7 giorni, le enteroids digiunali si formano. (B) Dopo l&#39;isolamento e la cultura, cripte ileali si comportano come le cripte digiunali e forma enteroids ileale. (C) cripte del colon sono placcati in matrice membrana basale dopo l&#39;isolamento. Le cripte stretti e formano colonoids dopo 7 giorni (bar Scala: 100 micron). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig4highres.jpg" /> Figura 4. cultura Cripta e enteroid umana e la generazione colonoid dalla biopsia. (A) cripte duodenali placcato in matrice membrana basale dopo l&#39;isolamento. Le cripte stanno chiudendo dopo 3 a 4 ore e iniziano a palloncino fino Beyond questa volta a formare enterospheres. In 7 giorni, le enteroids si formano. (B) Dopo l&#39;isolamento e la cultura, cripte del colon sono placcati in matrice di membrana basale. Le cripte vicino a formare colonospheres poi colonoids dopo 7 giorni (bar Scala: 100 micron). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig5highres.jpg" /> Figura 5. intestinali lignaggi dei enteroids umane. (A) enteroid umana dopo 6 giorni di coltura. (B) sezioni ematossilina-eosina dei enteroids in (A) dimostrare l&#39;epiteliali che rivestono (bar Scala: 100 micron). (CD) confocale di enteroids dopo EdU colorazione (magenta) indica la presenza di cellule proliferative. (E </strong&gt;) confocale del enteroids dimostra la presenza di: E-caderina per le cellule epiteliali (ECAD, verde) (bar Scala:. 50 micron) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig6highres.jpg" /> Figura 6. cultura Cripta e la generazione enteroid umana dal tessuto malato. (A) Enteroids stabilito da un campione di fibrosi cistica. (B) Enteroids stabilito da un congenito esemplare tufting enteropatia (barre di scala: 100 micron). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Movie 1. Enterosphere formando enteroid umano nella cultura. 32 hr temporali girie filmato mostra un enterosphere stabilita dal piccolo intestino umano scomparsa per formare un enteroid in cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/Movie1_v2.mp4" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Solvente </td><td> Archivio Concentrazione </td><td> Concentrazione finale </td><td> Commento </td></tr><tr><td> Fosfato di Dulbecco tamponata salina Ca 2+, Mg 2+ gratuito (DPBS) </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 14190-144 </td><td> - </td><td> - </td><td> 1x </td><td></td></tr><tr><td> Etilendiammina tetraacetico (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 431.788 </td><td> Ultrapure dH 2 O </td><td&gt; 0.5 M </td><td> 2 mm </td><td></td></tr><tr><td> Sorbitolo </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP439-500 </td><td> DPBS </td><td> Polvere </td><td> 2% </td><td></td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP220-1 </td><td> DPBS </td><td> Polvere </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino (BSA) Frazione V </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td> DPBS </td><td> Polvere </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione Gzntamycin / amfotericina B </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> R-015-10 </td><td> - </td><td> 500x </td><td> 1x </td><td></td></tr><tr><td> Wnt-3A conditionned medio </td><td> in casa </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> Avanzate DMEM / F12 </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 12634-028 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 15630-080 </td><td> - </td><td> 1 M </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax (glutamina) </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 35050-061 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina (10.000 U / mL) </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 15140-148 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> N2 Supplemento </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 17502-048 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> B27 Supplemento </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 17504-044 </td><td> - </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> N-Acetilcisteina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9165-5G </td><td> DPBS </td><td> 1 M </td><td> 1 mM </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Nicotidamide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N0636 </td><td> DPBS </td><td> 1 M </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel, GFR, fenolo (matrice membrana basale) gratis </td><td> Corning </td><td> 356.231 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> RICHIESTO </td></tr><tr><td> Noggin ricombinante umana </td><td> R &amp; S </td><td> 6057-NG / CF </td><td> DPBS </td><td> 100 ug / ml </td><td> 100 ng / ml </td><td rowspan="3"> Altri fornitori: R &amp; S; Anaspec e Preprotech </td></tr><tr><td> umana ricombinante R-spondina </td><td> Preprotech </td><td> 120-38 </td><td> DPBS </td><td> 1 mg / ml </td><td> 1 ug / ml </td></tr><tr><td> EGF ricombinante umana </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9644-.2MG </td><td> DBPs </td><td> 500 mg / ml </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Y0503-1MG </td><td> DPBS </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> A-83-01 </td><td> Tocris </td><td> 2939 </td><td> DMSO </td><td> 500 micron </td><td> 500 nM </td><td></td></tr><tr><td> SB202190 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7067-5MG </td><td> DMSO </td><td> 30 mM </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> umana [Leu] 15-Gastrin 1 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9145-.1MG </td><td> DPBS </td><td> 100 pM </td><td> 10 nM </td><td></td></tr><tr><td> CHIR99021 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0004 </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 2,5 micron </td><td></td></tr><tr><td> Thiazovivin </td><td> Stemgent </td><td> 04-0017 </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 2,5 micron </td><td></td></tr><tr><td> TrypLE espresso Enzyme (1X), rosso fenolo (cellule dissociazione enzimatica) </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 12605-010 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Per passaging </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 10082-147 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Per passaging </td></tr><tr><td> CTS Synth-a-Freeze (media di congelamento) Medium </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> A13713-01 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Per il congelamento </td></tr><tr><td> Linea cellulare L Wnt-3A </td><td> ATCC </td><td> CRL-2647 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A conditionned produzione di media </td></tr><tr><td> Renilla test luciferasi </td><td> Promega </td><td> E2710 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A conditionned attività dei media </td></tr><tr><td> umana ricombinante Wnt-3A </td><td> R &amp; S </td><td> 5036-WN / CF </td><td> DPBS </td><td> 100 ug / ml </td><td> 100 ng / ml </td><td&gt; Wnt-3A conditionned attività dei media </td></tr><tr><td> Linea cellulare HEK293 TOPflash </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A conditionned attività dei media; Regalo da laboratorio di Hans Clevers </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Elenco dei reagenti dettagliato con il produttore preferito e numero di catalogo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Attrezzatura </td><td> Consumabili </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Cappa a flusso laminare </td><td> 15 e 50 ml provette coniche </td><td> Dumont # 5 pinze normali (FST; # 11251-20) </td></tr><tr><td> CO 2 Incubatore </td><td> Tubi microcentrifuga </td><td> Dumont # 7, curve pinza sottile (FST; # 11274-20) </td></tr><tr><td> Stereomicroscopio </td><td> Piastre da 24 pozzetti </td><td> Forbici Belle (FST; # 14060-09) </td></tr><tr&gt; <td> Centrifuga </td><td> 0.22 micron filtri (Sartorius) </td><td> Forbici primavera Vännäs (FST; # 15018-10) </td></tr><tr><td> Shaker orbitale </td><td> Pipette sierologiche </td><td> 0,2 millimetri di diametro minutien perni (FST; # 26002-20) </td></tr><tr><td> Contenitore congelamento (Nalgene) </td><td> Suggerimenti micropipetta </td><td> 0,1 millimetri di diametro minutien perni (FST; # 26002-10) </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Silicone (Dow Corning) </td><td> 150 micron aperture di maglia, lo screening di nylon (Dynamic Aqua-fornitura) </td><td></td></tr><tr><td> Piatto di vetro Petri </td><td> 5 ml tubi in polipropilene a fondo tondo (Falcon) </td><td></td></tr><tr><td> Pipetta sierologica </td><td> 18G ago riempimento smussato (BD) </td><td></td></tr><tr><td> Micropipetta </td><td> 3 ml lsyringes con punte Luer-Lock (BD) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Cryovials </td><td></td></tr></tbody></table><strong&gt; Tabella 2. dettagliata di consumo, strumenti, e le attrezzature necessarie per l&#39;isolamento e la coltura cripta.

Descriviamo un metodo per stabilire enteroidi umani da cripte intestinali tenue e colonoidi da cripte del colon raccolte sia da tessuto chirurgico che da biopsie. In questo articolo metodologico, presentiamo le modalità di coltura che sono essenziali per la crescita e il mantenimento di successo di enteroidi e colonoidi umani.

Istituzione di umano epiteliali Enteroids e Colonoids dal tessuto intero e biopsia

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare enteroidi umani a partire da tessuti intestinali. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando la mucosa intestinale dal tessuto sottomucoso sottostante. Il secondo passaggio consiste nell'incubare la mucosa con EDTA per favorire la dissociazione dell'epitelio dal tessuto connettivo.Successivamente, le cripte intestinali vengono separate dall'epitelio dissociato. Infine, le cripte intestinali vengono coltivate in una matrice della membrana basale. In ultima analisi, vengono utilizzate tecniche di immunohistochimica per mostrare l'organizzazione epiteliale e specifici marcatori epiteliali degli OID coltivati.Le implicazioni di questo metodo risiedono nel fatto che ora possiamo generare OID da biopsie specifiche del paziente, il che significa che possiamo utilizzare tale tessuto in laboratorio per studiare malattie e diagnosi intestinali, cosa che fino ad ora non eravamo mai stati in grado di fare. Dopo aver preparato i tamponi e i reagenti secondo il protocollo descritto nel testo, scongelare la membrana basale in ghiaccio e pre-incubare una piastra a 24 pozzetti in un incubatore a anidride carbonica a 37 gradi Celsius una volta ricevuto il tessuto. Utilizzare PBS senza calcio e magnesio o DPBS per lavare il tessuto fino a quando il DPBS non diventa limpido.Posizionare il tessuto in una piastra di Petri in vetro rivestita di silicone riempita con DPBS ghiacciato, con il lato mucoso rivolto verso l'alto, e fissare il tessuto distendendolo e pinnandolo con spilli da minuzia. Successivamente, sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare forbici da dissezione microchirurgiche e pinzette curve a punta fine per rimuovere la mucosa sottostante dalla sottomucosa e dal tessuto connettivo. Quindi, con il lato mucoso rivolto verso l'alto, distendere e fissare la mucosa dissezionata in modo piatto sulla piastra di Petri in vetro rivestita di silicone.Utilizzando pinze curve, raschiare delicatamente la superficie della mucosa. Questo passaggio è necessario per migliorare la qualità del preparato. Coprire la mucosa con tampone chelante EDTA due millimolare appena preparato.Successivamente, dopo aver lavato il tessuto su ghiaccio da tre a quattro volte secondo il protocollo descritto nel testo sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare pinze curve per raschiare delicatamente la mucosa al fine di rilasciare i cripti intestinali con una pipetta. Rimuovere delicatamente la sospensione di cripti dalla piastra di Petri e trasferirla in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi esaminare il tessuto per accertarsi che quasi tutti i cripti siano stati rimossi dalla mucosa.Filtrare la sospensione di cripte attraverso un filtro da 150 micrometri due volte e utilizzare un microscopio per controllare il flusso in uscita. Dopo aver lavato la sospensione di cripte e trasferito il numero di cripte necessario in un tubo rotondo da cinque millilitri, secondo il protocollo descritto nel testo, centrifugare la frazione di cripte per 10 minuti a 150 G e a quattro gradi Celsius. Rimuovere quindi il soprannatante utilizzando punte di pipetta preraffreddate e il matrix della membrana basale. Risospendere il pellet di cripte.Applicare 50 microlitri di sospensione di cripte in matrice della membrana basale per pozzetto sulla piastra preriscaldata espellendo lentamente la matrice della membrana basale al centro del pozzetto. Incubare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 30 minuti per consentire la completa polimerizzazione della matrice della membrana basale. Successivamente, sovrapporre alla matrice della membrana basale 500 microlitri di mezzo completo per mini intestino umano, integrato con 2,5 micromolari di CHIR 9 0 2 2 1 ciascuno.E Thien incuba il tessuto cambiando il mezzo dopo due giorni, quindi ogni due giorni successivamente. Questa figura mostra un esempio tipico di cripte appena isolate da tessuto intero. Il numero di cripte isolate da una biopsia è inferiore rispetto a quello del tessuto intero.Di norma, vengono effettuati due prelievi bioptici in un singolo passaggio. Ogni prelievo bioptico produce una superficie di 10 millimetri quadrati con una media di 50-100 cripte per biopsia. Dopo la coltura e la matrice della membrana basale per cinque-sei giorni, le cripte si arrotondano formando enterosfere per l'intestino tenue e colonosfere per il colon, e vengono sottoposte a passaggio dopo sette giorni.Gli enteroidi o OID stabiliti da biopsie, mostrati qui, subiscono lo stesso processo di sviluppo a una densità inferiore durante la semina. Pertanto, il confezionamento viene solitamente effettuato dopo 10-12 giorni di coltura. Come mostrato qui, sia gli enteroidi che gli OID presentano un lato luminale e sono rivestiti da un epitelio.Le cellule proliferative possono essere osservate all'interno degli OIDs e si trovano nelle punte dei germogli. L'immagine al microscopio confocale di OIDs colorati con e catrin in verde mostra le cellule epiteliali. Questa figura mostra enteroidi in crescita provenienti da un paziente affetto da fibrosi cistica e da un enteropatia a ciuffi dovuta a una mutazione congenita nel gene della molecola di adesione cellulare epiteliale.Seguendo questa procedura o metodi come la PCR in tempo reale o il Western blot, è possibile rispondere a ulteriori domande riguardanti un gene o una sonda di interesse. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare in modo riproducibile le cellule umane Crips per poter generare in modo efficiente entrate nel proprio laboratorio e rispondere a domande specifiche relative ai pazienti.

establishment-human-epithelial-enteroids-colonoids-from-whole-tissue

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Questo protocollo descrive la misura della permeabilità della barriera epiteliale in tempo reale dopo il trattamento farmacologico in organoids intestinale umana utilizzando la microscopia a fluorescenza e microscopia cellulare di vivere.

Misura in tempo reale di permeabilità della barriera epiteliale in Organoids intestinale umana

Enteroids stanno emergendo come un modello di romanzo nello studio della malattia umana. Il protocollo descrive come simulare un modello enteroid di enterocolite necrotizzante umano mediante trattamento di lipopolisaccaride (LPS) di enteroids generato dal tessuto neonatale. Enteroids raccolti dimostrano cambiamenti infiammatori simili a quelli osservati nella enterocolite necrotizzante umana.

Un nuovo modello Enteroid epiteliali umane di enterocolite necrotizzantesi

Qui, presentiamo un protocollo alla cultura umana enteroid o colonoid monostrati che hanno funzione di barriera intatta per studiare le interazioni epiteliali-microbiota ospite a livello cellulare e biochimico.

Monostrati Colonoid umana per studiare le interazioni tra gli agenti patogeni, Commensals ed epitelio intestinale Host

Qui, descriviamo la preparazione di monostrati epiteliali intestinali derivati da organoidi umani per studiare la funzione, la permeabilità e il trasporto della barriera intestinale. Poiché gli organoidi rappresentano la risposta originale del tessuto epiteliale agli stimoli esterni, questi modelli combinano i vantaggi dell'espandibilità delle linee cellulari e la rilevanza e la complessità del tessuto primario.

Monostrato epiteliale derivato da organoidi: un modello in vitro clinicamente rilevante per la funzione di barriera intestinale

In questo protocollo, descriviamo come generare monostrati epiteliali primari murini direttamente dalle cripte intestinali. Forniamo approcci sperimentali per generare monostrati confluenti su filtri permeabili, monostrati confluenti per la guarigione delle ferite da graffio e studi biochimici e monostrati sparsi e confluenti per l'analisi dell'immunofluorescenza.

Generazione di monostrati epiteliali del colon primario murino da cripte intestinali

Questo protocollo offre istruzioni dettagliate per stabilire organoidi murini dell'intestino tenue, isolare le cellule linfoidi innate di tipo 1 dalla lamina propria dell'intestino tenue murino e stabilire co-colture tridimensionali (3D) tra entrambi i tipi di cellule per studiare le interazioni bidirezionali tra le cellule epiteliali intestinali e le cellule linfoidi innate di tipo 1.

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Questo protocollo descrive un modello di enterocolite necrotizzante apicale (NEC) in un piatto che utilizza enteroidi intestinali piccoli con polarità invertita, consentendo l'accesso alla superficie apicale. Forniamo un protocollo di colorazione immunofluorescente per rilevare l'interruzione epiteliale correlata al NEC e un metodo per determinare la vitalità degli enteroidi apicali-out sottoposti al protocollo NEC-in-a-dish.

In vitro Modello enteroide apical-out di enterocolite necrotizzante

Questo protocollo descrive in dettaglio la creazione di enteroidi, un modello intestinale tridimensionale, dal tessuto intestinale fetale. L'imaging immunofluorescente dei biomarcatori epiteliali è stato utilizzato per la caratterizzazione del modello. L'esposizione apicale dei lipopolisaccaridi, un'endotossina batterica, utilizzando la tecnica della microiniezione ha indotto la permeabilità epiteliale in modo dose-dipendente misurata dalla fuoriuscita di destrano fluorescente.

Test della permeabilità epiteliale negli enteroidi derivati dal tessuto fetale

Descriviamo un protocollo che descrive in dettaglio l'isolamento delle cripte del colon murino per lo sviluppo di colonoidi tridimensionali. I colonoidi stabiliti possono quindi essere differenziati terminalmente per riflettere la composizione cellulare dell'epitelio ospite prima di ricevere una sfida infiammatoria o di essere diretti a stabilire un monostrato epiteliale.

Studiare gli effetti epiteliali dell'infiammazione intestinale in vitro su colonoidi murini accertati

Un metodo è descritto per propagare i tumori retinoblastoma umano nei topi. Le cellule tumorali sono direttamente iniettate negli occhi di topi privi di sistema immunitario. Tumori secondari sono state stabilite con successo utilizzando sia le cellule raccolte direttamente da tumori umani e tumorspheres colta.

Istituzione e Propagazione dei Tumori retinoblastoma umani in topi privi di sistema immunitario

Impara a generare enteroidi e colonoidi umani da biopsie intestinali utilizzando matrice di membrana basale. Questo metodo consente studi specifici del paziente su malattie intestinali e biologia epiteliale.

Istituzione di umano epiteliali Enteroids e Colonoids dal tessuto intero e biopsia

Esplora altri video