Istituzione di umano epiteliali Enteroids e Colonoids dal tessuto intero e biopsia

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare entrate umane dai tessuti intestinali. Ciò si ottiene sezionando prima la mucosa intestinale dal tessuto sottomucoso sottostante. Il secondo passo consiste nell'incubare la mucosa con EDTA per favorire la dissociazione dell'epitelio dal tessuto connettivo.

Successivamente, le cripte intestinali vengono separate dall'epitelio dissociato. Infine, le cripte intestinali vengono coltivate nella matrice della membrana basale. In definitiva, le tecniche di immunoistochimica vengono utilizzate per mostrare l'organizzazione epiteliale e specifici marcatori epiteliali degli OID in coltura.

Le implicazioni di questo metodo sono il fatto che ora possiamo generare OID da biopsie specifiche del paziente, il che significa che ora possiamo utilizzare quel tessuto in laboratorio per esaminare malattie e diagnosi intestinali, cosa che prima d'ora non siamo mai stati in grado di fare. Dopo aver preparato i tamponi e i reagenti, secondo il protocollo di testo, scongelare la membrana basale su ghiaccio e preincubare una piastra da 24 pozzetti in un incubatore ad anidride carbonica a 37 gradi Celsius quando il tessuto è stato ricevuto. Usa il PBS di KO senza calcio e magnesio o DPBS per lavare il tessuto fino a quando il DPBS non è chiaro.

Posizionare il fazzoletto in una capsula di Petri di vetro rivestita di silicone riempita con DPBS ghiacciato con il lato della mucosa rivolto verso l'alto e con spilli da minuchin fissare il tessuto allungandolo e fissandolo con un appuntamento. Successivamente, sotto un microscopio da dissezione, utilizzare le forbici da microdissezione e le pinze curve a punta fine per rimuovere la mucosa sottostante dalla sottomucosa e dal tessuto connettivo. Quindi, con il lato della mucosa rivolto verso l'alto, allungare e appuntare la mucosa sezionata sulla piastra di Petri in vetro rivestita di silicone.

Usando una pinza curva, raschiare delicatamente la superficie della mucosa. Questo passaggio è necessario per migliorare la qualità della preparazione. Coprire la mucosa con un tampone chelante EDTA da due millimolari appena preparato.

Quindi, dopo aver lavato il tessuto sul ghiaccio, tre o quattro volte secondo il protocollo di testo al microscopio da dissezione, utilizzare una pinza curva per raschiare delicatamente la mucosa per rilasciare le cripte intestinali con una pipetta. Rimuovere delicatamente la sospensione della cripta dalla capsula di Petri e trasferirla in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi controlla il tessuto per assicurarti che quasi tutte le cripte siano state rimosse dalla mucosa.

Filtrare la sospensione della cripta attraverso un filtro da 150 micrometri due volte e utilizzare un microscopio per controllare il flusso attraverso Dopo aver lavato la sospensione della cripta e aver trasferito il numero di cripte necessarie in un tubo inferiore rotondo da cinque millilitri, secondo il protocollo di testo, centrifugare la frazione della cripta per 10 minuti a 150 Gs e quattro gradi Celsius. Quindi rimuovere il surnatante utilizzando i puntali delle pipette pre-raffreddati e la matrice della membrana basale Resuspend. Il pellet della cripta.

Applicare 50 microlitri di sospensione di cripta nella matrice della membrana basale per pozzetto alla piastra di preriscaldamento espellendo lentamente la matrice della membrana basale al centro del pozzo. Incubare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica per 30 minuti per consentire una polimerizzazione completa della matrice della membrana basale. Quindi sovrapporre la matrice della membrana basale con 500 microlitri di mini terreno intestinale umano completo, integrato con 2,5 micromolari ciascuno di CHIR 9 0 2 2 1.

E Thien incuba il tessuto cambiando il terreno dopo due giorni, poi a giorni alterni. Questa figura mostra un tipico esempio di cripte appena isolate da un intero tessuto. Il numero di cripte isolate da una biopsia è inferiore a quello dell'intero tessuto.

Di solito vengono eseguiti due morsi di biopsia in un unico passaggio. Ogni morso di biopsia si traduce in una superficie di 10 millimetri quadrati con una media di 50-100 crips per biopsia. Dopo la coltura e la matrice della membrana basale per cinque o sei giorni, i Crips si arrotondano per formare entero sfere per l'intestino tenue e colon sfere per il colon e vengono fatti passare dopo sette giorni.

Gli enter o OID stabiliti dalle biopsie mostrate qui subiscono lo stesso sviluppo a una densità inferiore al momento della semina. Pertanto, il confezionamento viene solitamente effettuato dopo 10-12 giorni di coltura. Come mostrato qui, sia gli OID che gli OID presentano un lato luminale e sono rivestiti da un epitelio.

Le cellule proliferative possono essere osservate all'interno degli OID e si trovano all'interno delle punte delle gemme. L'imaging confocale degli OID colorati con e catrina qui in verde mostra le cellule epiteliali. Questa figura mostra gli ingressi che crescono da un paziente con fibrosi cistica e un'enteropatia da tufting dovuta a una mutazione congenita nel gene della molecola di adesione delle cellule epiteliali.

Seguendo questa procedura o un metodo come la PCR in tempo reale o il sangue occidentale, è possibile rispondere a ulteriori domande relative a un gene o a un problema di interesse. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare costantemente i Crip umani per essere in grado di generare in modo efficiente ingressi nel tuo laboratorio per rispondere alle domande specifiche del tuo paziente.