Generazione di cellule staminali adiposo umano attraverso dedifferenziazione di adipociti maturi in Culture soffitto
7 marzo 2015
Gli adipociti maturi possono rappresentare un'abbondante fonte di cellule staminali attraverso la dedifferenziazione, che porta a una popolazione omogenea di cellule simili a fibroblasti. La digestione della collagenasi viene utilizzata per isolare gli adipociti maturi dal grasso umano. L'obiettivo del nostro protocollo è quello di ottenere cellule adipose multipotenti e dedifferenziate da adipociti maturi umani.
I depos maturi hanno la capacità di differenziarsi in cellule precursori in vitro. Ciò si ottiene attraverso la coltura delle foche, una tecnica in cui le cellule mature vengono coltivate in un pallone completamente riempito di terreno e coltivate a testa in giù. Le cellule galleggianti aderiscono al pallone e cambiano la loro morfologia passando da una cellula rotonda piena di lipidi a una cellula allungata simile a un fibroblasto. Omogeneo.
Popolazioni di cellule allungate possono essere ottenute e curate Al ricevimento di campioni di tessuto in laboratorio. Pesare i tessuti adiposi, a seconda del numero di adipociti necessari, posizionare un volume adeguato di campione in una confezione da 50 ml. Due per la digestione, ci si può aspettare di ottenere circa 1 milione di cellule per grammo di tessuto.
Le colture a soffitto vengono eseguite con 500.000 cellule per pallone da 25 centimetri e 50.000 cellule per ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti, aggiungere il tampone di lavoro KRH integrato con collagenasi, tritare il tessuto con le forbici e incubare la preparazione a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Durante l'incubazione, preparare il tubo e la siringa. Versare la soluzione traslucida attraverso una rete di nylon in un bicchiere di plastica con una pinzetta.
Strofinare delicatamente la preparazione cellulare attraverso la rete e lavare delicatamente con cinque ml di KRH Working Buffer. Trasferire la sospensione cellulare filtrata in una serie da 50 ml con provetta e siringa. Facciamo riposare gli adipociti maturi per circa 10 minuti.
Le cellule raggiungeranno la parte superiore del tampone per flottazione. Aspirare lentamente il tampone dal basso. Utilizzando una siringa e un tubo, aggiungere 20 ml di tampone di lavoro KRH per il lavaggio.
Ripetere due volte le fasi di lavaggio. Raccogliere il tampone per portare la sospensione adipocitaria a un volume finale di cinque ml e procedere al conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro, riempire un pallone T 25 a tre quarti del suo volume con D-M-E-M-F 12 integrato con il 20% di siero di vitello trasferire 500.000 adipociti maturi nel pallone. Rabboccare il pallone con il fluido e rimuovere le bolle d'aria dalla superficie superiore.
Avvitare un tappo inventato sul pallone. Incubare il pallone capovolto per una settimana in un incubatore per colture cellulari con il 5% di anidride carbonica. Evitare il movimento del pallone poiché le bolle rimanenti potrebbero interrompere l'aderenza della cellula.
Posizionare un vetrino coprioggetti sul fondo dei pozzetti. Aggiungere la boccola di plastica nel pozzetto e riempire il pozzetto con otto ml di terreno. Assicurati che non ci siano bolle.
Posizionare un vetrino coprinte sulla boccola, lasciando uno spazio per inserire il puntale della pipetta. Campionare 50.000 cellule e iniettarle posizionando la punta tra il vetrino coprioggetti e la boccola. Incubare la piastra in un incubatore per colture cellulari con il 5% di anidride carbonica per una settimana o meno.
A seconda del disegno dell'esperimento, sono necessari almeno tre giorni affinché le cellule aderiscano al vetrino coprioggetto in una piastra diversa. Vetrini coprioggetto inversi in due ml di supporto. In continuazione, i vetrini di copertura della coltura possono quindi essere fissati in formalina per esperimenti di immunofluorescenza o per estrazioni di D-N-A-R-N-A e proteine.
La dedifferenziazione degli adipociti maturi provoca importanti cambiamenti nella morfologia cellulare. Durante questo processo, gli adipociti perdono il loro fenotipo e diminuiscono l'espressione dei trascritti solitamente associati alla loro funzione di accumulo dei lipidi. Questa immagine in immunofluorescenza rappresenta le cellule adipose in vari stati di de-differenziazione.
Le cellule con la morfologia rotonda esprimono ancora FABP quattro, un marcatore adipocitario maturo, mentre le cellule allungate non lo esprimono più In base alla letteratura. Le cellule adipose differenziate D, spesso chiamate cellule adipose D, possono essere ottenute da pazienti giovani, anziani, magri o di base ostetrica. La loro capacità di coltura a lungo termine e la loro multipotenza dimostrata.
Mi piace anche il loro potenziale per l'ingegneria tissutale e la terapia cellulare. Potrebbero rappresentare un nuovo modello per l'indagine post-specifica della fisiologia degli adipociti.
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Panoramica
Questo studio analizza la dedifferenziazione di adipociti maturi in cellule staminali multipotenti. Mediante l'utilizzo della digestione con collaghenasi e delle tecniche di coltura in ambiente sigillato, i ricercatori possono isolare e coltivare queste cellule per ottenere una popolazione omogenea di cellule di tipo fibroblastico.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ricerca sulle cellule staminali
- Biologia degli adipociti
- Tecniche di coltura cellulare
Sfondo
- Gli adipociti maturi possono dedifferenziarsi in cellule precursori.
- Questo processo può essere eseguito in vitro utilizzando specifici metodi di coltura.
- L'isolamento degli adipociti è fondamentale per ottenere cellule staminali.
- La digestione con collaghenasi è un metodo standard per l'isolamento cellulare.
Scopo dello studio
- Ottenere cellule adipose multipotenti e dedifferenziate da adipociti maturi umani.
- Stabilire un protocollo per l'isolamento e la coltivazione di queste cellule.
- Studiare i cambiamenti morfologici durante il processo di dedifferenziazione.
Metodi Utilizzati
- Digestione con collaghenasi per isolare adipociti maturi.
- Tecnica di coltura in ambiente sigillato per favorire la dedifferenziazione.
- Valutazione della morfologia cellulare per confermare la dedifferenziazione.
- Quantificazione del rendimento cellulare in base al peso del tessuto.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di circa 1 milione di cellule per grammo di tessuto adiposo.
- Le cellule dedifferenziate hanno mostrato una morfologia allungata simile a quella dei fibroblasti.
- Popolazioni cellulari omogenee sono state ottenute attraverso i metodi descritti.
- È stato dimostrato il potenziale degli adipociti maturi come fonte di cellule staminali.
Conclusioni
- Gli adipociti maturi possono essere efficacemente convertiti in cellule staminali multipotenti.
- I metodi descritti forniscono un approccio affidabile per la ricerca sulle cellule staminali.
- Questo studio contribuisce alla comprensione della plasticità degli adipociti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La dedifferenziazione di adipociti maturi in cellule staminali multipotenti offre una nuova fonte per applicazioni di medicina rigenerativa e ingegneria tissutale. Questo approccio consente la caratterizzazione specifica per deposito della funzione adipocitaria e delle proprietà metaboliche, supportando la validazione degli obiettivi nella ricerca sulle malattie metaboliche. Il metodo fornisce una piattaforma scalabile per la generazione di cellule di tipo fibroblastico con dimostrata multipotenza, facilitando lo sviluppo di modelli preclinici e la riduzione del rischio meccanicistico nella scoperta di terapie mirate agli adipociti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi della plasticità degli adipociti e la verifica di ipotesi terapeutiche nei percorsi delle malattie metaboliche.
- Valore operativo: Fornisce un sistema riproducibile per la validazione funzionale di bersagli mediante l'isolamento di adipociti specifici per deposito.
- Valore scientifico: Consente una maggiore affidabilità predittiva generando popolazioni omogenee di cellule dedifferenziate per la chiarificazione dei percorsi molecolari.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi mediante tecniche standardizzate di digestione con collaghenasi e coltura a soffitto.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità del saggio attraverso un rendimento controllato di adipociti (circa 1 milione di cellule per grammo di tessuto).
- Valore scientifico: Permette una valutazione affidabile di composti mediante l'uso di cellule di tipo fibroblastico con confermata riduzione dell'espressione di FABP4 come marcatore di dedifferenziazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta lo sviluppo di sistemi pertinenti alle malattie per l'indagine post-specifica della fisiologia degli adipociti.
- Valore operativo: Garantisce una continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica grazie alla capacità di coltura a lungo termine delle cellule adipose dedifferenziate.
- Valore scientifico: Facilita decisioni di avanzamento ponderate sui rischi dimostrando la multipotenza e il potenziale di ingegneria tissutale delle cellule D-fat.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale del bersaglio fino all'identificazione del capostazione e agli studi preclinici, in particolare per programmi relativi a malattie metaboliche e medicina rigenerativa.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la riduzione del rischio biologico modellando la dedifferenziazione degli adipociti in vitro.
- Screening: Garantisce prontezza del saggio e output quantitativi mediante isolamento cellulare standardizzato e valutazione della morfologia.
- Analisi: Fornisce letture misurabili, come i cambiamenti nell'espressione di FABP4, per confrontare gli stati di dedifferenziazione in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica grazie alla dimostrata coltura a lungo termine e alla multipotenza degli adipociti dedifferenziati.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per generare cellule staminali derivate da adipociti in molteplici indagini specifiche per diversi depositi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nel passaggio di fenotipo degli adipociti.
- Valore operativo: Standardizzazione e scalabilità mediante digestione con collagenasi definita e protocolli di coltura invertita.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui, consentendo la caratterizzazione specifica per deposito delle proprietà metaboliche prima dell'ottimizzazione del capostipite.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio mediante valutazione convalidata del rendimento delle cellule staminali e del potenziale differenziativo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento di adipociti primari e nelle tecniche di digestione con collaghenasi.
- Necessita di un'infrastruttura per colture cellulari in grado di mantenere colture a soffitto in fiasche capovolte o in piastre a 6 pozzetti.
- Richiede una standardizzazione tra gruppi di lavoro per garantire rese di adipociti e valutazioni della dedifferenziazione costanti tra diversi laboratori.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica il protocollo a tessuto adiposo proveniente da depositi diversi o con caratteristiche differenti del donatore.
- Comprende limitazioni pratiche, come la necessità di un riempimento preciso del mezzo di coltura per evitare la formazione di bolle durante la coltura capovolta.
