Auto-assemblaggio di forme complesse bidimensionali da Campagna DNA a singolo filamento

L'obiettivo generale del seguente esperimento è formare nanostrutture di DNA complesse mediante tessere a filamento singolo. Questo risultato si ottiene mescolando filamenti di DNA sintetici attentamente progettati in una soluzione tampone desiderata per formare la nanostruttura di DNA desiderata come secondo passaggio. Il campione viene incubato, durante il quale avviene l'autoassemblaggio della struttura.

Successivamente, vengono eseguite l'elettroforesi su gel di agarosio nativo e l'analisi mediante microscopia a forza atomica al fine di verificare la corretta formazione delle nanostrutture. I risultati mostrano che le nanostrutture di DNA si sono assemblate autonomamente, come confermato dall'elettroforesi su gel di agarosio nativo e dall'analisi mediante microscopia a forza atomica. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà poiché la preparazione del campione per tale autoassemblaggio può sembrare complessa. Prima di iniziare questa procedura, ottenere le catene di DNA con sequenze specifiche disciolte in acqua priva di RNA da un fornitore di oligonucleotidi in piastre Vbo a 96 pozzetti; pipettare un microlitro da ciascuno dei 362 pozzetti per le 24 eliche di 28 giri.

Aggiungere 100 micromolari per filamento in un tubo da prova da due millilitri. Quindi aggiungere 138 microlitri di acqua distillata deionizzata al tubo da prova per ottenere una soluzione madre a una concentrazione di 200 nanomolari per filamento.

Aggiungere 50 microlitri della soluzione stock di 200 ano molar, 10 microlitri di buffer di annealing 10x A e 40 microlitri di acqua distillata deionizzata in un tubo PCR da 0,2 millilitri. Successivamente, incubare il campione per 17 ore in un termociclatore con raffreddamento da 90 a 25 gradi Celsius.

Dopo aver preparato un gel di agarosio nativo al 2% precolorato con SYBR safe, farlo correre per due ore a 100 volt in un bagno di ghiaccio e acqua. Al termine, acquisire l'immagine del gel utilizzando uno scanner per gel con un filtro appropriato per la colorazione SYBR safe su un transilluminatore a luce blu, quindi escindere la banda dominante con mobilità simile a quella della banda di 1.500 paia di basi della scala di DNA di un chilobase utilizzando una lama di rasoio pulita e affilata. Posizionare i frammenti di gel desiderati in una colonna centrifuga, quindi frantumare il gel in piccoli pezzi usando un pellet microtubulare, quindi centrifugare a 438 ×g per tre minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, misurare la concentrazione del DNA utilizzando uno spettrofotometro a ultravioletti a 260 nanometri. A questo punto, staccare la MICA attaccata a un disco metallico campione utilizzando del nastro adesivo in modo da ottenere una superficie piatta e posizionare il disco campione sullo stadio di imaging del microscopio.

Aggiungere 40 microlitri di un tampone A x e in posizione genuflessa seguiti da cinque microlitri del campione purificato dei 24 HELOCs mediante 28 giri rettangolari sulla superficie appena scollata di Micah. Lasciare riposare la miscela per circa due minuti. Installare un chip in nitruro di silicio per la sonda AFM su un supporto per sonda ed eseguire l'immagine del campione in modalità tapping in fluido utilizzando una dimensione di scansione di due micrometri e 1024 linee per la risoluzione.

E una velocità di scansione di 0,5 a un hertz per l'etichettatura interna collegata al segmento di 17 nucleotidi in posizione tre prime, a otto tessere interne e a sei tessere perimetrali del rettangolo. Mescolare i 28 filamenti con maniglie con il resto dei filamenti componenti dei 24 HELOCs mediante il rettangolo di 28 giri per ottenere una soluzione madre di 200 NANOMOLARE per l'etichettatura perimetrale. Mescolare i 14 filamenti con maniglie con il resto dei filamenti componenti dei 24 heel seas mediante il rettangolo di 28 giri per ottenere una soluzione madre di 200 Nanomolare per l'etichettatura interna.

Per l'etichettatura del limite, aggiungere 50 microlitri della soluzione madre da 200 nanomolari, 60 microlitri delle catene marcate con biotina anti-handle da 100 micromolari, 10 microlitri di buffer di annealing 10x A e 34 microlitri di acqua distillata deionizzata in un tubo PCR.

Per l'etichettatura interna, aggiungere 50 microlitri della soluzione stock di 200 nanomolar. Tre microlitri della catena interna anti-handle modificata con biotina a 100 micromolar. 10 microlitri di buffer di annealing 10 x A e 37 microlitri di acqua distillata deionizzata in un tubo da PCR.

Successivamente pesare 0,06 grammi di formiato di uranile in tre millilitri di acqua distillata. Per preparare una soluzione acquosa di formiato di uranile al 2%, filtrare la soluzione colorante utilizzando un filtro da 0,2 microlitri applicato alla siringa. Aggiungere cinque microlitri di idrossido di sodio 5 N a un millilitro della soluzione colorante filtrata.

Dopo aver agitato brevemente la soluzione mediante vortex, centrifugare a 20.000 G. Scaricare le griglie rivestite di carbonio con il lato rivestito rivolto verso l'alto utilizzando le seguenti impostazioni. Al termine, pipettare 3,5 microlitri di campione sulla griglia trattata con scarica al plasma. Dopo quattro minuti, utilizzare un pezzo di carta da filtro per asportare il campione ponendo la carta a contatto con la griglia lateralmente.

Aggiungere immediatamente 3,5 microlitri della soluzione di colorante sulla griglia. Dopo un minuto, asportare il colorante con carta da filtro e tenere la carta contro la griglia per uno o due minuti. Trasferire la griglia in un portacampioni per microscopio elettronico a trasmissione.

Un'immagine ottenuta con A-J-E-O-L GM 1400, operato a 80 chilovolt con un ingrandimento compreso tra 10 K e 80 K. Una volta identificata la forma, selezionare i filamenti che corrispondono alla forma sulla tela molecolare. Sostituire il dominio esposto con un segmento poli T lungo da 10 a 11 nucleotidi, oppure aggiungere un protettore di estremità complementare al dominio esposto e terminarlo con un segmento poli T lungo da 10 a 11 nucleotidi. Per prevenire l'aggregazione, creare una libreria di filamenti per la tela molecolare di 310 pixel, che includa il bustino.

Impostare un set stella, due set stella, tre set stella e quattro set stella per ottenere un totale di 1.344 protezioni perimetrali. Dopo aver centrifugato le piastre a 96 pozzetti per i diversi set, pipettare un microlitro di 206 filamenti dal set principale, zero dal set una stella, zero dal set due stelle, zero dal set tre stelle e 24 filamenti dal set quattro stelle in un tubo da centrifuga da due millilitri. Aggiungere 20 microlitri di acqua distillata deionizzata al tubo per ottenere una soluzione madre di 400 nanomolari dei filamenti di DNA.

Successivamente, aggiungere 50 microlitri della soluzione madre di 400 nanomolar. 10 microlitri di buffer di annealing 10 x B e 40 microlitri di acqua distillata deionizzata in un tubo PCR da 0,2 millilitri e la miscela nel termociclatore per 17 ore come descritto in precedenza. Dopo aver purificato il campione e misurato l'immagine della concentrazione di DNA, analizzare il campione utilizzando una FM nello stesso modo di prima per costruire infine rettangoli di dimensioni diverse semplicemente modificando il numero di heoc paralleli e il numero di giri elicoidali.

L'autoassemblaggio di piastrelle a singolo filamento produrrà una sequenza di DNA rettangolare composta da 24 HELOCs per 28 giri; le sequenze di singolo filamento possono essere modificate e ottimizzate per consentire la divisione mediante streptavidina e la marcatura, nonché la trasformazione di un rettangolo in un tubo. L'autoassemblaggio programmabile di piastrelle a singolo filamento per formare tubi e rettangoli di dimensioni variabili, e la costruzione di forme arbitrarie bidimensionali mediante l'uso del telaio molecolare, sono stati testati con due strategie progettuali per prevenire l'aggregazione lungo domini esposti di forme arbitrarie: la sostituzione di dominio e la protezione dei bordi. Entrambe le strategie presentano resa elettroforetica e integrità strutturale comparabili, ma il design con protezione dei bordi è più economico poiché richiede un numero minore di specie ausiliarie.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come realizzare nanostrutture di DNA complesse basate su tasselli a filamento singolo.