Name: Auto-assemblaggio di forme complesse bidimensionali da Campagna DNA a singolo filamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Scopri l'auto-assemblaggio di nanostrutture DNA complesse utilizzando piastrelle di DNA a singolo filamento. Questo metodo combina elettroforesi su gel e microscopia a forza atomica per verificare la formazione delle strutture.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Office of Naval Research giovane Programma Investigator Award N000141110914, Office of Naval Research Grant N000141010827, NSF CARRIERA Premio CCF1054898, di direttore NIH Nuova Innovator Award 1DP2OD007292 e un Istituto Wyss per biologicamente Ispirato Facoltà di Ingegneria Fondo di avvio (a PY) e Tsinghua-Pechino Center for Life Sciences Fund avvio (BW).

1. DNA Sequenza di design <ol><li> Utilizzare software UNIQUIMER 27 per progettare una struttura SST-finite specificando il numero di doppie eliche, lunghezze di elica superiore e inferiore per ciascuna doppia elica, e il modello di crossover per creare un 24H × 28T tela. Dopo aver definito questi parametri, l&#39;architettura complessiva (composizione filamento e la disposizione complementarità) è illustrato graficamente nel programma. </li><li> Generare sequenze per i fili della struttura indicata per soddisfare la disposizione complementarità e requisiti aggiuntivi (se presenti). Progettare sequenze di DNA minimizzando la sequenza di simmetria 28 (per la maggior parte delle strutture). <ol><li> Generare nucleotidi (A, C, G e T) in modo casuale uno per uno. </li><li> Partita nucleotidi complementari a quelle generate a seguito della regola base-pairing: dalla A alla T e viceversa; C a G e viceversa. </li><li> Non utilizzare i segmenti che si ripetono al di là di otto o nove nucleotidi. Quando tale repmangiare segmenti emergono durante la progettazione, mutare i nucleotidi più recentemente generati fino a quando l&#39;obbligo di ripetere segmento è soddisfatto. </li><li> Non utilizzare quattro basi consecutive A, C, G e T. </li><li> Utilizzare nucleotidi pre-specificati nei punti di collegamento a singolo filamento (per esempio G T e come il ventunesimo e ventiduesimo nucleotidi, rispettivamente, per la maggior parte dei fili) per evitare basi scivolare attorno ai punti di collegamento (ad esempio, se entrambi ventunesimo e ventiduesimo nucleotidi erano T, è stato possibile per il XXI nucleotide di legarsi al nucleotide che la ventiduesima nucleotide dovrebbe legarsi a). </li></ol></li><li> Modifica sequenze di DNA manualmente per l&#39;etichettatura streptavidina, la trasformazione di rettangoli in tubi, la formazione di diversi rettangoli e tubi diverse scale differenti, e per prevenire l&#39;aggregazione causati da domini esposti su SST. <ol><li> Sostituire i domini esposte sul bordo della tela molecolare con poli-T Tracts. </li><li> Per l&#39;etichettatura streptavidina, progettare i segmenti manico (il segmento in più aggiunto al filone componente che può legarsi ad una controparte complementare, come un filo anti-maniglia), tali da poter ospitare un filo anti-maniglia con 3 &#39;modifica biotina. </li><li> Per la conversione di un rettangolo in un tubo, rimuovere le righe superiore e inferiore del rettangolo e inserire una nuova riga cui SST avere complementarità specifico ai corrispondenti piastrelle sul secondo per riga superiore e il secondo per fila inferiore. </li><li> Per un singolo dominio filamento esposto di forme diverse, sostituirlo con poli-T segmenti di lunghezza 10-11 nucleotidi, o coprire da paraspigoli che sono complementari al dominio esposta e terminano con un 10-11 nucleotidi segmenti lunghi poli-T. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione dei Canvas molecolare <ol><li> Ottenere filamenti di DNA dei componenti di sequenze specificate disciolti in acqua priva di RNasi da un oligonucleotide produttore in V fondo piastre da 96 pozzetti con oligonucleotidi sintetizzati in una scala di 10 nmol con desalinizzazione standard. Centrifugare le piastre a 96 pozzetti con i filamenti di DNA di circa 10 s a 600 x g. <ol><li> Pipettare 1 ml di ciascuna delle 362 pozzetti con filamenti di DNA per la 24H × 28T rettangolo (Figura 3A) a 100 mM per filo (specifica costruttore) in una provetta 2 ml. Aggiungere 138 ml di acqua distillata deionizzata H 2 O alla provetta 2 ml di prova per ottenere una soluzione stock di miscela filamento ad una concentrazione di 200 nM per filo. </li></ol></li><li> Aggiungere 50 ml della soluzione di 200 nM magazzino di miscela filamento, 10 ml di ricottura 10X tampone A (Tris 50 mM, pH 7,9, EDTA 10 mM, 250 mM MgCl 2), e 40 ml di acqua distillata deionizzata H 2 O a 0,2 Tubo ml PCR. Questo rende un campione di 100 microlitri della tela molecolare in 1X tampone di ricottura A (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 25 mM MgCl 2). </li><li> Anneal il SAMPLe per 17 ore in un termociclatore raffreddamento da 90 ° C a 25 ° C. Programmare il termociclatore come segue: rampa di discesa da 90 ° C a 61 ° C ad una velocità costante di 5 min per ° C; rampa di decelerazione da 60 ° C a 25 ° C ad una velocità costante di 20 min per ° C; e incubare a 4 ° C fino a che il campione può essere estratto dal termociclatore. </li><li> Preparare un 2% gel nativo. <ol><li> Misurare 2,4 g di agarosio in un becher da 600 ml. Aggiungere 120 ml di tampone TBE 0.5X (44.5 mM Tris-borato, pH 8,3, EDTA 1 mM) e 30 ml di acqua deionizzata distillata nel becher. </li><li> Forno a microonde per 3 minuti (o 40 - 60 sec dopo ebollizione). Ricostituire l&#39;acqua persa durante l&#39;evaporazione mediante aggiunta di 30 ml di acqua, che aiuta a mantenere la concentrazione di agarosio in gel al 2%. </li><li> Agitare il contenuto del bicchiere per 1 min in un bagno di acqua fredda. Aggiungere 1 ml di 1,2 M MgCl 2 (per fare un MgCl 10 mM concentrazione di 2 nel gel) e pre-macchia lo spirito gelh 6 ml di SYBR sicuro tintura (1: 20.000). </li><li> Versare la soluzione di gel in una scatola di gel secco e inserire un 1,5 millimetri di spessore 12 ben elettroforesi su gel pettine. Lasciare solidificare per 15 - 30 min su una piattaforma ancora. </li><li> Versare tampone gel running (44.5 mM Tris-borato, pH 8,3, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl e 2) nella scatola gel. Carico 2 - 3 ml di 1 kb DNA ladder in un pozzo del gel di agarosio. Mescolare 4 ml di 6X bromofenolo colorante blu (0,25% blu di bromofenolo, 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl 2 e 30% glicerolo) con 20 ml di campione della tela molecolare e caricare la soluzione in un altro pozzetto della gel di agarosio. </li></ol></li><li> Eseguire il nativo 2% agarosio per 2 ore a 100 V in un bagno di acqua ghiacciata (bromofenolo blu, in blu, corre più veloce di fili di componenti in modo che possa servire come indicatore che se il tempo di 2 ore di funzionamento è appropriato). </li><li> Immagine il gel utilizzando uno scanner gel con un filtro appropriato per il SYBR macchia di sicurezza (Figura 2B </strong&gt;). </li><li> Su un transilluminatore luce blu, accise la banda dominante mobilità simile alla banda di 1.500 paia di basi del DNA scala 1 kb con una lama di rasoio pulito tagliente. Posizionare il pezzo di gel desiderato (s) in una colonna di spin e poi schiacciare il gel in pezzi sottili con un pestello microtubo. Centrifugare a 438 xg per 3 min a 4 ° C. </li><li> Misurare la concentrazione del DNA utilizzando uno spettrofotometro ultravioletta a 260 nm. <ol><li> Utilizzare 2 ml di acqua distillata ultrapura DNasi / RNase-Free come bianco per calibrare la macchina. </li><li> Utilizzare un volume equivalente di campione prelevato dalla colonna di selezione per ottenere una stima della concentrazione di DNA. Il valore misurato di concentrazione (&quot;a&quot; = ng / ml) conseguito presso un assorbimento UV di 260 nm aiuterà a determinare il fattore di diluizione per AFM e di imaging TEM. </li><li> Convertire la concentrazione misurata da &quot;a&quot; (ng / ml) per &quot;b&quot; (nM) in seguito b = a × 10 6 / (330 &amp;# 215; numero di nucleotidi). NOTA: Il peso molecolare di un nucleotide è 330 g / mol. Il valore della concentrazione molare calcolato determina il fattore di diluizione per AFM e TEM imaging. Come per il caso di un 24H × 28T rettangolo, la misura comune per il campione purificato è intorno 10 - i 60 ng / ml. Poiché il numero di nucleotidi per una tale struttura è 14616 Da, la concentrazione molare è di circa 2 - 12 nM. La concentrazione finale è determinato dal rendimento di raccolta (~ 20 - 50%) da centrifugazione e il volume della banda gel asportato out (maggiore è il volume, più diluire il campione purificato). </li></ol></li></ol> 3. microscopia a forza atomica Imaging <ol><li> Staccare mica collegato a un disco dei campioni di metallo con nastro adesivo per ottenere una superficie piana e inserire il disco di preparato sul palco di imaging. </li><li> Aggiungere 40 ml di 1X tampone di ricottura A seguiti da 5 microlitri (2 - 5 nM) del campione purificato della 24H × 28Trettangolo sulla superficie mica appena spaccati. Lasciare il composto di stabilirsi per circa 2 minuti. </li><li> Installare AFM nitruro di silicio di chip a sbalzo su un supporto a sbalzo. Utilizzare una punta triangolare C (frequenza di risonanza, f 0 = 40-75 kHz; primavera costante, k = 0,24 Nm -1) per l&#39;imaging. </li><li> Immagine un campione nel modo fluido maschiatura. Utilizzare i seguenti parametri di imaging per la scansione: scansione dimensione di 2 micron, 1024 linee per la risoluzione e una velocità di scansione di 0,5 - 1 Hz (Figura 2C). </li><li> Se necessario, aggiungere 10 ml o più di 10 mM soluzione NiCl 2 per aumentare la forza di legame 29 DNA-mica. </li></ol> 4. Preparazione del campione per Streptavidin Etichettatura <ol><li> Progettare manualmente la 24H × 28T rettangolo tale che fili manico in luoghi specifici sono incorporati come complementari alle varie componenti anti-maniglia con modifica biotina, che a loro volta sono in grado di legarsi a streptavidin particolare. <ol><li> Modificare la tela molecolare collegando un &#39;segmento 3 17-nucleotide che consiste in una sequenza di due nucleotidi (TT) come distanziatore e una maniglia 15-nucleotide (GGAAGGGATGGAGGA) per le 14 tessere sulla fila superiore e 14 piastrelle sul fondo fila del rettangolo (Figura 3A) per etichettare confine. Questa sequenza è complementare ad una 3 &#39;biotina modificato strand anti-impugnatura (TCCTCCATCCCTTCC-biotina). </li></ol></li><li> Per l&#39;etichettatura interna, attaccare il segmento 3 &#39;17 nucleotidi a 8 tessere interne e 6 piastrelle di confine del rettangolo (figura 4A). <ol><li> Mescolare le 28 trefoli con manici (etichettatura confine) con il resto dei componenti che costituiscono il 24H × 28T rettangolo (334 fili) per fare una soluzione stock di 200 nM. Mescolare le 14 trefoli con maniglie (etichettatura interna) con il resto dei componenti che costituiscono il 24H × 28T rettangolo (348 filamenti) per ottenere una soluzione madre di 200 nM. </li></ol></li><li> Per boetichettatura undary, aggiungere 50 ml di soluzione madre di 200 nM dei trefoli, 6 ml di 100 mM biotina modificato anti-maniglia trefoli, 10 ml di ricottura 10X tampone A, e 34 ml di acqua distillata deionizzata ad una 0,1-0,2 provetta ml PCR. La concentrazione finale del filo componente è 100 nm e la concentrazione finale del filamento modificato anti-handle biotina è di 6.000 nM. Si noti che 28 molecole anti-gestiscono biotina modificato filo si legano a una 24 ore × 28T rettangolo in modo che il filo anti-gestire biotina modificata è superiore al 100% per rendere il legame favorevole. </li><li> Per l&#39;etichettatura interna, aggiungere 50 ml di soluzione di riserva 200 Nm dei fili, 3 ml di anti-gestire biotina filo modificato interna a 100 micron, 10 ml di 10X buffer di ricottura A, 37 ml di acqua deionizzata distillata a un 0,1 - 0,2 ml provetta PCR. La concentrazione finale del filo componente è 100 nm e la concentrazione finale di anti-handle biotina modifi<html> ed filone è 3.000 nm. Si noti che 14 molecole anti-handle biotina modificato filo legano ad una 24H × 28T rettangolo così anti-gestire biotina filo modificato è superiore al 100% per rendere il legame favorevole. </li><li> Ricottura entrambi i campioni in un termociclatore per 17 ore utilizzando la procedura descritta in 2.3. </li><li> Preparare un 2% gel nativo come descritto nei punti 2.4. </li><li> Purificare entrambi i campioni come descritto ai punti 2.5. </li><li> Misurare le concentrazioni delle strutture di DNA desiderati come descritto ai punti 2.6. </li></ol> 5. microscopia a forza atomica per l&#39;etichettatura Streptavidin <ol><li> Immagine ogni campione con un AFM, come descritto al punto 3 (figure 3B e 4B). </li><li> Dopo il primo turno delle immagini, aggiungere 40 ml di 1X tampone di ricottura A seguita da 1 ml di streptavidina a 10 mg / ml per il campione. Lasciare il composto di stabilirsi per circa 2 minuti prima di re-imaging (Figure 3C e 4C). </li></ol>_title &quot;&gt; 6. La conversione di un rettangolo in un tubo <ol><li> Per progettare un tubo sulla base del rettangolo, mantenere tutti gli SST componenti in posto tranne le file superiore e inferiore. Introdurre una nuova riga cui SST sono progettati concatenando le mezze tegole superiori e inferiori delle rispettive colonne ciclizzare il rettangolo originale in una conformazione tubo (Figura 5A). </li><li> Mescolare la nuova riga di fili (14 fili) con i fili che compongono il 24H × 28T rettangolo escluse le righe superiore e inferiore (336 linee) per ottenere una soluzione stock 200 Nm. </li><li> Seguire la purificazione gel passaggi 2,2-2,7 (Figura 5B). </li></ol> 7. Transmission Electron Microscope Imaging <ol><li> Pesare 0,06 g di formiato di uranile in 3 ml di acqua distillata per preparare una soluzione acquosa di uranile macchia formiato 2%. Filtrare la soluzione acquosa macchia uranile formiato 2% utilizzando un filtro da 0,2 micron attaccato ad una siringa. <ol><li> Aggiungere 5 ml di5 N NaOH al 1 ml di soluzione macchia filtrata. Brevemente agitare la soluzione e centrifugare a 20000 x g. </li></ol></li><li> Glow scaricare le griglie di carbonio rivestite (lato rivestito verso l&#39;alto) con le seguenti impostazioni: 25 mA, 45 s, 0,1 mbar e polarità negativa High Tension. </li><li> Utilizzare pinze a chiusura automatica per afferrare una griglia trattata bagliore scaricatore dal bordo. </li><li> Pipettare 3,5 ml di campione sulla griglia per 4 min. Usare un pezzo di carta da filtro per favorire off campione portando la carta da filtro a contatto con la griglia di lato. </li><li> Aggiungere immediatamente 3,5 ml di soluzione macchia sulla griglia per 1 min. </li><li> Wick via la macchia come in 7.4 e tenere la carta da filtro contro la rete del 1 - 2 min. </li><li> Trasferire la griglia di un titolare TEM campione e immagine utilizzando un JEOL JEM-1400 funzionare a 80 kV con ingrandimento variabile da 10 K a 80 K (Figura 5C). </li></ol> 8. Costruire forme arbitrarie utilizzando la Molecular Canvas <ol><li> Identificare una forma e selezionare i fili che corrispondono alla forma sulla tela molecolare. Per una forma triangolare per esempio, selezionare 206 su 362 capi per la tela molecolare. </li><li> Sostituire il dominio esposta (cioè lungo l&#39;ipotenusa del triangolo) con un segmento di poli-T 10 - 11 nucleotidi (disegno 1 nella Figura 6A), o aggiungere una protezione bordo che è complementare al dominio esposta e terminare con 10 - segmento lungo poly-T 11 nucleotide (disegno 2 nella Figura 6A) per prevenire l&#39;aggregazione. NOTA: Semplicemente ricottura gli SST che corrispondono ai pixel del triangolo (senza utilizzare fili protettore) porterà ad aggregazione e senza formazione di bande distinte prodotto su un gel. Utilizzare il disegno paraspigoli per varie forme in quanto è più efficiente delle risorse; richiede solo quattro set aggiuntivi di filamenti (Figura 6C) rispetto a 14 set aggiuntivi nella progettazione di sostituzione (Figure 6B). </li><li> Creare una libreria filo per la tela molecolare 310-pixel, che comprende il nucleo (la tela 362 SST), Set 1 * (paraspigoli che si legano al dominio 1 di una SST), Set 2 * (paraspigoli che si legano al dominio 2 di una SST), Set 3 * (paraspigoli che si legano al dominio 3 di un SST), e Set 4 * (paraspigoli che si legano al dominio di un 4 SST) per dare un totale di 1.344 paraspigoli. </li><li> Centrifugare le piastre a 96 pozzetti per i diversi set per circa 10 s. Pipettare i fili desiderati dalle piastre in modo da ottenere una soluzione stock di una certa forma. <ol><li> Per la forma di un triangolo con paraspigoli, pipetta 1 ml di 206 fili dal nucleo, 0 della serie 1 *, 0 della serie 2 *, 0 della serie 3 * e 24 fili della serie 4 * in una centrifuga 2 ml tubo. Aggiungere 20 ml di acqua distillata deionizzata al tubo per ottenere una soluzione stock di 400 nM dei filamenti di DNA. </li></ol></li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione di 400 NM di stra DNA<html> nds, 10 ml di 10X buffer di ricottura B (50 mM Tris, pH 7.9, EDTA 10 mm, 125 mM MgCl 2) soluzione madre e 40 ul distillata H 2 O deionizzata in una provetta da 0,2 ml PCR. Questo rende un campione di 100 microlitri del triangolo in 1X tampone di ricottura B (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 12,5 mM MgCl 2) con trefoli a una concentrazione di circa 200 nM per filo. </li><li> Anneal il composto in un termociclatore per 17 ore come descritto al punto 2.3. </li><li> Preparare un 2% gel nativo come descritto al punto 2.4. </li><li> Purificare il campione come descritto al punto 2.5. </li><li> Misurare la concentrazione del DNA come descritto al punto 2.6. </li><li> Immagine del campione sotto AFM come descritto al punto 3 (Figura 7C e 7D). </li><li> Scegli e mescolare capi per forme diverse utilizzando la stessa libreria filamento. Ricuocere le diverse soluzioni e combinare campioni purificati di forme diverse per risparmiare tempo durante l&#39;imaging AFM. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 9. Optional: Robot di automazione di disegno di figura e miscelazione liquido <ol><li> Utilizzare un programma MATLAB personalizzato per aiutare la progettazione di forme complesse. </li><li> Utilizzare il software per fornire indicazioni, sotto forma di una sequenza di dispensazione di un gestore di robot liquido. Utilizzare il gestore liquido robot di selezionare e miscelare i fili che costituiscono la forma di destinazione. NOTA: la progettazione e la ciocca di miscelazione è stato automatizzato per ridurre l&#39;errore umano e rendere intensa la costruzione meno lavoro. </li></ol> 10. Rettangoli e tubi Across diverse scale <ol><li> Costruire rettangoli di diverse dimensioni (Figura 10) semplicemente modificando il numero di eliche parallele (H) e il numero di spire elicoidali (T). </li><li> Eseguire il punto 3 per un rettangolo dimensione specifica. </li><li> Eseguire il punto 6 per un tubo di dimensione specifica. </li></ol>

<ol><li>Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+junctions+and+lattices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid junctions and lattices.</a> J. Theor. Biol. 99 (2), 237-247 (1982).</li>
<li>Fu, T. J., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-crossover+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA double-crossover molecules.</a> Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).</li>
<li>Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+self-assembly+of+two-dimensional+DNA+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals.</a> Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).</li>
<li>Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-templated+self-assembly+of+protein+arrays+and+highly+conductive+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires.</a> Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).</li>
<li>Rothemund, P. W. K., Papadakis, N., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithmic+self-assembly+of+DNA+Sierpinski+triangles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Algorithmic self-assembly of DNA Sierpinski triangles.</a> PLoS Biol. 2 (12), e424(2004).</li>
<li>Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1.7-kilobase+single-stranded+DNA+that+folds+into+a+nanoscale+octahedron%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron.</a> Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).</li>
<li>Chworos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+programmable+jigsaw+puzzles+with+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Building programmable jigsaw puzzles with RNA.</a> Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite-size%2C+fully-addressable+DNA+tile+lattices+formed+by+hierarchical+assembly+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Finite-size, fully-addressable DNA tile lattices formed by hierarchical assembly procedures.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45 (5), 735-739 (2006).</li>
<li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li>
<li>Schulman, R., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+crystals+with+a+programmable+kinetic+barrier+to+nucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Synthesis of crystals with a programmable kinetic barrier to nucleation.</a> Proc. Natl Acad. Sci. USA. 104 (39), 15236-15241 (2007).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li>
<li>Yin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+DNA+tube+circumferences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321 (5890), 824-826 (2008).</li>
<li>Sharma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+self-assembly+of+DNA+tubules+through+integration+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of self-assembly of DNA tubules through integration of gold nanoparticles.</a> Science. 323 (5910), 112-116 (2009).</li>
<li>Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li>
<li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li>
<li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li>
<li>Zheng, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+molecular+to+macroscopic+via+the+rational+design+of+self-assembled+3D%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+crystal.+Nature%22%5BJournal%5D)">From molecular to macroscopic via the rational design of self-assembled 3D.</a> DNA crystal. Nature. 461 (7260), 74-77 (2009).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+origami+with+complex+curvatures+in+three-dimensional+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space.</a> Science. 332 (6024), 342-346 (2011).</li>
<li>Liu, W., Zhong, H., Wang, R., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystalline+two-dimensional+DNA+origami+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Crystalline two-dimensional DNA origami arrays.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (1), 264-267 (2011).</li>
<li>Zhao, Z., Liu, Y., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+DNA+origami+tiles+into+larger+structures+using+preformed+scaffold+frames%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Organizing DNA origami tiles into larger structures using preformed scaffold frames.</a> Nano Lett. 11 (7), 2997-3002 (2011).</li>
<li>Woo, S., Rothemund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+molecular+recognition+based+on+the+geometry+of+DNA+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures.</a> Nat. Chem. 3 (8), 620-627 (2011).</li>
<li>Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+intracellular+reactions+with+rationally+designed+RNA+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies.</a> Science. 333 (6041), 470-474 (2011).</li>
<li>Lin, C., Liu, Y., Rinker, S., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+tile+based+self-assembly%3A+building+complex+nanoarchitectures%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">DNA tile based self-assembly: building complex nanoarchitectures.</a> ChemPhysChem. 7 (8), 1641-1647 (2006).</li>
<li>Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterials+based+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanomaterials based on DNA.</a> Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 65-87 (2010).</li>
<li>Voigt, N. V., Nangreave, J., Yan, H., Gothelf, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+origami%3A+a+quantum+leap+for+self-assembly+of+complex+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">DNA origami: a quantum leap for self-assembly of complex structures.</a> Chem. Soc. Rev. 40 (12), 5636-5646 (2011).</li>
<li>Wei, B., Dai, M., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+Shapes+self-assembled+from+single+stranded+DNA+tiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex Shapes self-assembled from single stranded DNA tiles.</a> Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).</li>
<li>Wei, B., Wang, Z., Mi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniquimer%3A+software+of+de+novo+DNA+sequence+generation+for+DNA+self-assembly%3A+an+introduction+and+the+related+applications+in+DNA+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Theor.+Nanosci%22%5BJournal%5D)">Uniquimer: software of de novo DNA sequence generation for DNA self-assembly: an introduction and the related applications in DNA self-assembly.</a> J. Comput. Theor. Nanosci. 4 (1), 133-141 (2007).</li>
<li>Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+design+of+sequences+for+nucleic+acid+structural+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Struct.+Dyn%22%5BJournal%5D)">De novo design of sequences for nucleic acid structural engineering.</a> J. Biomol. Struct. Dyn. 8 (3), 573-581 (1990).</li>
<li>Hansma, H. G., Laney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+binding+to+mica+correlates+with+cationic+radius%3A+assay+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">DNA binding to mica correlates with cationic radius: assay by atomic force microscopy.</a> Biophys. J. 70 (4), 1933-1939 (1996).</li>
<li>Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-free+nucleic+acid+logic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzyme-free nucleic acid logic circuits.</a> Science. 314 (5805), 1585-1588 (2006).</li>
<li>Yin, P., Choi, H. M. T., Calvert, C. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+biomolecular+self-assembly+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming biomolecular self-assembly pathways.</a> Nature. 451 (7176), 318-322 (2008).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Nella fase formazione della struttura, è importante mantenere un&#39;adeguata concentrazione di cationi magnesio (ad es., 15 mm) nella miscela filamento di DNA di nanostrutture di DNA di auto-assemblaggio. Analogamente, nella fase di caratterizzazione gel di agarosio / purificazione, è importante mantenere un adeguato concentrazione di cationi di magnesio (ad es., 10 mM) nel gel e il buffer gel running mantenere le nanostrutture di DNA durante l&#39;elettroforesi. Per la 24H × struttura 28T rettangolo,...

Acido nucleico precedente lavoro autoassemblaggio 1-25 ha portato alla costruzione di successo di una varietà di strutture complesse, compreso il DNA 2 - 5,8,10 - 13,17,23 o RNA 7,22 3,4,7 periodica, 22 e algoritmico 5 bidimensionali reticoli, nastri 10,12 e tubi 4,12,13, cristalli 3D 17, poliedri 11 e finite, 2D forme 7,8. Un metodo particolarmente efficace è ponteggi origami di DNA, per cui un singolo filo impalcatura viene piegato da molti corti filamenti ausiliari fiocco per formare una forma complessa 9,14 - 16,18 - 21,25. Recentemente abbiamo segnalato un metodo per costruire nanostrutture discreti con forme 2D prescritte con piastrelle a singolo filamento (SST), e dimostrato strutture con complessità paragonabile a origami di DNA 26. Questo article è un adattamento del nostro lavoro precedente 26 e descrive in dettaglio i protocolli per l&#39;organizzazione di SST indirizzabili individualmente in sofisticate forme 2D finiti con dimensioni prescritte con precisione (larghezze e lunghezze) e morfologie. Uno dei principali vantaggi del metodo SST è la sua modularità. Ogni SST componente di una struttura serve come unità di costruzione modulare nell&#39;assemblaggio, e diversi sottoinsiemi di questi SST produrre forme distinte. Così, abbiamo stabilito una piattaforma generale per costruire nanostrutture con dimensioni e forme prescritte dalla corte, filamenti di DNA sintetico. SST contengono quattro domini, ciascuno lungo 10 o 11 nucleotidi (Figura 1A). Le SST legano in modo tale che le loro eliche parallele creano un reticolo di DNA tenuti insieme da legami incrociati. Ogni crossover è fosfato tra i domini 2 e 3. Il fosfato è allungato artificialmente nei diagrammi per chiarezza visiva. I crossover sono distanziati due spire elicoidali (21 basi) a parte (&lt;strong&gt; Figura 1B). I rettangoli compositi sono indicati con le dimensioni del numero di eliche e spire elicoidali. Ad esempio, un rettangolo che è di sei eliche e otto elicoidale gira lungo viene fatto riferimento come 6H × 8T rettangolo. SST può essere lasciato fuori, ha aggiunto, o comunque riorganizzate per creare strutture di forme arbitrarie e dimensioni (Figura 1C). Per esempio, un disegno rettangolare può essere arrotolato in un tubo con una lunghezza e raggio desiderato (Figura 1D). In alternativa, il SST reticolo rettangolare può essere visto come una tela molecolare costituito da SST pixel, ogni 3 nm da 7 nm. In questo studio, usiamo una tela molecolare di 310 full-length SST interne, 24 SST full-length che costituiscono i confini sinistro e destro, e 28 SST a mezzo busto che costituiscono le delimitazioni superiore e inferiore. La tela ha 24 doppie eliche legate da crossover e ogni elica contiene 28 spire elicoidali (294 basi) ed è quindi indicato comeuna 24H × 28T rettangolare tela. Il 24H × 28T tela ha un peso molecolare simile a quella di una struttura origami di DNA ricavato da un fago M13 ponteggio.

<table><tbody><tr><td>Filamenti di DNA&nbsp;</td>Tecnologia <td></td><td>del DNA integrata</td><td>Sezione 3.1</td></tr><tr><td>Colorazione in gel di DNA sicura SYBR</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Sezione 3.4.2</td></tr><tr><td>Freeze'N Squeeze Colonne di centrifuga per l'estrazione del gel di DNA</td><td>BIO-RAD</td><td>731-6166</td><td>Sezione 3.6</td></tr><tr><td>Sonde a leva per nitruro affilato di Bruker</td><td>Sonde AFM Bruker</td><td>SNL10</td><td>Sezione 4.3</td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 Transilluminatore a luce blu</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td>Sezione 3.6</td></tr><tr><td>Centrifuga 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428 000.414</td><td>Sezione 3.6</td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione&nbsp;</td><td>Jeol</td><td>Jem 1400</td><td>Sezione 7.4</td></tr><tr><td>Multimodale 8</td><td>Veeco</td><td></td><td>Sezione 4</td></tr><tr><td>Tifone FLA 9000 Laser Scanner</td><td>GE Heathcare Life Sciences</td><td>28-9558-08</td><td>Sezione 3.5</td></tr><tr><td>Acqua distillata ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td>Sezione 3.7.1</td></tr><tr><td>Disco di mica</td><td>SPI Supplies</td><td>12001-26-2</td><td>Sezione 4.1</td></tr><tr><td>Disco di montaggio in acciaio</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16218</td><td>Sezione 4.1</td></tr><tr><td>griglia in rame rivestito di carbonio per TEM</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FCF400-Cu</td><td>Sezione 7.2</td></tr><tr><td>pinzette</td><td>Dumont</td><td>0203-N5AC-PO</td><td>Sezione 7.31</td></tr><tr><td>sistema di scarica a bagliore</td><td>Quorum Technologies</td><td>K100X</td><td>Sezione 7.2</td></tr><tr><td>Motore DNA Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler</td><td>BIO-RAD</td><td>PTC... 0240G</td><td>Sezione 3.3</td></tr><tr><td>Owl Easycast B2 Mini Sistemi di elettroforesi su gel</td><td>ThermoScientific</td><td>B2</td><td>Sezione 3.4.3</td></tr><tr><td>Seekam LE Agarose 500G</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td>Sezione 3.4.1</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder, pronto all'uso 75-20000bp</td><td>ThermoScientific</td><td>SM1333</td><td>Sezione 3.4.4</td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV-vis Nanodrop 2000c</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td>Sezione 3.7</td></tr><tr><td>Filtro da 0,2 um</td><td>Corning Inc.</td><td>431219</td><td>Sezione 7.1.2</td></tr></tbody></table>

auto-assemblaggio di forme complesse bidimensionali da campagna dna a singolo filamento

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Gli attuali metodi di nano-architettura del DNA hanno ingegnerizzato con successo una varietà di strutture 2D e 3D utilizzando principi di auto-assemblaggio. In questo articolo, descriviamo protocolli dettagliati su come fabbricare sofisticate forme 2D attraverso l'autoassemblaggio di tessere di DNA a singolo filamento indirizzabili in modo univoco che agiscono come pixel molecolari su una tela molecolare. Ogni piastrella a filamento singolo (SST) è un filamento di DNA a 42 nucleotidi composto da quattro domini modulari concatenati che si legano a quattro vicini durante l'autoassemblaggio. La tela molecolare è una struttura rettangolare autoassemblata da SST. Una forma 2D complessa prescritta viene formata selezionando i pixel molecolari costituenti (SST) da una tela molecolare di 310 pixel e quindi sottoponendo i filamenti corrispondenti alla ricottura one-pot. Grazie alla natura modulare dell'approccio SST, dimostriamo la scalabilità, la versatilità e la robustezza di questo metodo. Rispetto ai metodi alternativi, il metodo SST consente una selezione più ampia di polimeri e sequenze di informazioni attraverso l'uso di filamenti di DNA corti progettati e sintetizzati de novo.

L&#39;auto-assemblaggio di SST (Figura 1) produrrà un 24H × 28T rettangolo, come illustrato in figura 2. Sequenze di DNA per i diversi SST possono essere modificati / ottimizzata per abilitare l&#39;etichettatura streptavidina (Figura 3 e 4), la trasformazione di un rettangolo in un tubo (figura 5), programmabile autoassemblaggio di SST per formare tubi e rettangoli di diverse dimensioni (Figura 10), e la costruzione di...

Il tassellamento del DNA è un approccio efficace per realizzare nanostrutture programmabili. Descriviamo i protocolli per costruire forme bidimensionali complesse mediante l'autoassemblaggio di tessere di DNA a filamento singolo.

Auto-assemblaggio di forme complesse bidimensionali da Campagna DNA a singolo filamento

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è formare nanostrutture di DNA complesse mediante tessere a filamento singolo. Questo risultato si ottiene mescolando filamenti di DNA sintetici attentamente progettati in una soluzione tampone desiderata per formare la nanostruttura di DNA desiderata come secondo passaggio. Il campione viene incubato, durante il quale avviene l'autoassemblaggio della struttura.Successivamente, vengono eseguite l'elettroforesi su gel di agarosio nativo e l'analisi mediante microscopia a forza atomica al fine di verificare la corretta formazione delle nanostrutture. I risultati mostrano che le nanostrutture di DNA si sono assemblate autonomamente, come confermato dall'elettroforesi su gel di agarosio nativo e dall'analisi mediante microscopia a forza atomica. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà poiché la preparazione del campione per tale autoassemblaggio può sembrare complessa. Prima di iniziare questa procedura, ottenere le catene di DNA con sequenze specifiche disciolte in acqua priva di RNA da un fornitore di oligonucleotidi in piastre Vbo a 96 pozzetti; pipettare un microlitro da ciascuno dei 362 pozzetti per le 24 eliche di 28 giri.Aggiungere 100 micromolari per filamento in un tubo da prova da due millilitri. Quindi aggiungere 138 microlitri di acqua distillata deionizzata al tubo da prova per ottenere una soluzione madre a una concentrazione di 200 nanomolari per filamento.Aggiungere 50 microlitri della soluzione stock di 200 ano molar, 10 microlitri di buffer di annealing 10x A e 40 microlitri di acqua distillata deionizzata in un tubo PCR da 0,2 millilitri. Successivamente, incubare il campione per 17 ore in un termociclatore con raffreddamento da 90 a 25 gradi Celsius.Dopo aver preparato un gel di agarosio nativo al 2% precolorato con SYBR safe, farlo correre per due ore a 100 volt in un bagno di ghiaccio e acqua. Al termine, acquisire l'immagine del gel utilizzando uno scanner per gel con un filtro appropriato per la colorazione SYBR safe su un transilluminatore a luce blu, quindi escindere la banda dominante con mobilità simile a quella della banda di 1.500 paia di basi della scala di DNA di un chilobase utilizzando una lama di rasoio pulita e affilata. Posizionare i frammenti di gel desiderati in una colonna centrifuga, quindi frantumare il gel in piccoli pezzi usando un pellet microtubulare, quindi centrifugare a 438 ×g per tre minuti a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, misurare la concentrazione del DNA utilizzando uno spettrofotometro a ultravioletti a 260 nanometri. A questo punto, staccare la MICA attaccata a un disco metallico campione utilizzando del nastro adesivo in modo da ottenere una superficie piatta e posizionare il disco campione sullo stadio di imaging del microscopio.Aggiungere 40 microlitri di un tampone A x e in posizione genuflessa seguiti da cinque microlitri del campione purificato dei 24 HELOCs mediante 28 giri rettangolari sulla superficie appena scollata di Micah. Lasciare riposare la miscela per circa due minuti. Installare un chip in nitruro di silicio per la sonda AFM su un supporto per sonda ed eseguire l'immagine del campione in modalità tapping in fluido utilizzando una dimensione di scansione di due micrometri e 1024 linee per la risoluzione.E una velocità di scansione di 0,5 a un hertz per l'etichettatura interna collegata al segmento di 17 nucleotidi in posizione tre prime, a otto tessere interne e a sei tessere perimetrali del rettangolo. Mescolare i 28 filamenti con maniglie con il resto dei filamenti componenti dei 24 HELOCs mediante il rettangolo di 28 giri per ottenere una soluzione madre di 200 NANOMOLARE per l'etichettatura perimetrale. Mescolare i 14 filamenti con maniglie con il resto dei filamenti componenti dei 24 heel seas mediante il rettangolo di 28 giri per ottenere una soluzione madre di 200 Nanomolare per l'etichettatura interna.Per l'etichettatura del limite, aggiungere 50 microlitri della soluzione madre da 200 nanomolari, 60 microlitri delle catene marcate con biotina anti-handle da 100 micromolari, 10 microlitri di buffer di annealing 10x A e 34 microlitri di acqua distillata deionizzata in un tubo PCR.Per l'etichettatura interna, aggiungere 50 microlitri della soluzione stock di 200 nanomolar. Tre microlitri della catena interna anti-handle modificata con biotina a 100 micromolar. 10 microlitri di buffer di annealing 10 x A e 37 microlitri di acqua distillata deionizzata in un tubo da PCR.Successivamente pesare 0,06 grammi di formiato di uranile in tre millilitri di acqua distillata. Per preparare una soluzione acquosa di formiato di uranile al 2%, filtrare la soluzione colorante utilizzando un filtro da 0,2 microlitri applicato alla siringa. Aggiungere cinque microlitri di idrossido di sodio 5 N a un millilitro della soluzione colorante filtrata.Dopo aver agitato brevemente la soluzione mediante vortex, centrifugare a 20.000 G. Scaricare le griglie rivestite di carbonio con il lato rivestito rivolto verso l'alto utilizzando le seguenti impostazioni. Al termine, pipettare 3,5 microlitri di campione sulla griglia trattata con scarica al plasma. Dopo quattro minuti, utilizzare un pezzo di carta da filtro per asportare il campione ponendo la carta a contatto con la griglia lateralmente.Aggiungere immediatamente 3,5 microlitri della soluzione di colorante sulla griglia. Dopo un minuto, asportare il colorante con carta da filtro e tenere la carta contro la griglia per uno o due minuti. Trasferire la griglia in un portacampioni per microscopio elettronico a trasmissione.Un'immagine ottenuta con A-J-E-O-L GM 1400, operato a 80 chilovolt con un ingrandimento compreso tra 10 K e 80 K. Una volta identificata la forma, selezionare i filamenti che corrispondono alla forma sulla tela molecolare. Sostituire il dominio esposto con un segmento poli T lungo da 10 a 11 nucleotidi, oppure aggiungere un protettore di estremità complementare al dominio esposto e terminarlo con un segmento poli T lungo da 10 a 11 nucleotidi. Per prevenire l'aggregazione, creare una libreria di filamenti per la tela molecolare di 310 pixel, che includa il bustino.Impostare un set stella, due set stella, tre set stella e quattro set stella per ottenere un totale di 1.344 protezioni perimetrali. Dopo aver centrifugato le piastre a 96 pozzetti per i diversi set, pipettare un microlitro di 206 filamenti dal set principale, zero dal set una stella, zero dal set due stelle, zero dal set tre stelle e 24 filamenti dal set quattro stelle in un tubo da centrifuga da due millilitri. Aggiungere 20 microlitri di acqua distillata deionizzata al tubo per ottenere una soluzione madre di 400 nanomolari dei filamenti di DNA.Successivamente, aggiungere 50 microlitri della soluzione madre di 400 nanomolar. 10 microlitri di buffer di annealing 10 x B e 40 microlitri di acqua distillata deionizzata in un tubo PCR da 0,2 millilitri e la miscela nel termociclatore per 17 ore come descritto in precedenza. Dopo aver purificato il campione e misurato l'immagine della concentrazione di DNA, analizzare il campione utilizzando una FM nello stesso modo di prima per costruire infine rettangoli di dimensioni diverse semplicemente modificando il numero di heoc paralleli e il numero di giri elicoidali.L'autoassemblaggio di piastrelle a singolo filamento produrrà una sequenza di DNA rettangolare composta da 24 HELOCs per 28 giri; le sequenze di singolo filamento possono essere modificate e ottimizzate per consentire la divisione mediante streptavidina e la marcatura, nonché la trasformazione di un rettangolo in un tubo. L'autoassemblaggio programmabile di piastrelle a singolo filamento per formare tubi e rettangoli di dimensioni variabili, e la costruzione di forme arbitrarie bidimensionali mediante l'uso del telaio molecolare, sono stati testati con due strategie progettuali per prevenire l'aggregazione lungo domini esposti di forme arbitrarie: la sostituzione di dominio e la protezione dei bordi. Entrambe le strategie presentano resa elettroforetica e integrità strutturale comparabili, ma il design con protezione dei bordi è più economico poiché richiede un numero minore di specie ausiliarie.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come realizzare nanostrutture di DNA complesse basate su tasselli a filamento singolo.

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