Auto-assemblaggio di forme complesse bidimensionali da Campagna DNA a singolo filamento

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di formare complesse nanostrutture di DNA con tessere a singolo filamento. Ciò si ottiene mescolando filamenti di DNA sintetico accuratamente progettati nella soluzione tampone desiderata per formare la nanostruttura di DNA desiderata come seconda fase. Il campione è un inginocchiato durante il quale avviene l'autoassemblaggio della struttura.

Successivamente, vengono eseguite l'elettroforesi su gel agros nativo e l'imaging al microscopio a forza atomica per verificare il successo della formazione delle nanostrutture. I risultati mostrano nanostrutture di DNA autoassemblate sulla base di agro nativi, elettroforesi su gel e imaging al microscopio a forza atomica. In generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché la preparazione del campione di un tale autoassemblaggio sembrava essere complicata Prima di iniziare questa procedura ottenuta filamenti di componenti di DNA di sequenze specificate disciolti in RNA acqua libera da un produttore di oligonucleotidi in Vbo 96 piastre a pozzetti pipettare un microlitro da ciascuno dei 362 pozzetti per le 24 eliche per 28 giri.

Rettangolo: aggiungere 100 micromolari per filamento in una provetta da due millilitri. Quindi aggiungere 138 microlitri di acqua distillata deionizzata alla provetta per ottenere una soluzione stock. Ad una concentrazione di 200 nano molari per filamento.

Aggiungere 50 microlitri della soluzione madre da 200 ano-molari. 10 microlitri di 10 tampone di ricottura A e 40 microlitri di acqua distillata deionizzata in una provetta PCR da 0,2 millilitri. Successivamente un campione per 17 ore in un termociclatore che raffredda da 90 a 25 gradi Celsius.

Dopo aver preparato un gel nativo al 2% di agros prestato con SYBR safe, farlo funzionare per due ore a 100 volt in un bagno di acqua ghiacciata. Al termine, l'immagine del gel utilizzando uno scanner gel con un filtro appropriato per la colorazione sicura SYBR su un transluminatore a luce blu asporta la banda dominante con mobilità simile alla banda di 1.500 paia di basi di una scala di DNA kilobase utilizzando una lama di rasoio affilata e pulita. Posizionare i pezzi di gel desiderati in una colonna di centrifuga, quindi schiacciare il gel in pezzi sottili utilizzando una microprovetta Pele, quindi centrifugare a 438 G per tre minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione. Misurare la concentrazione del DNA utilizzando uno spettrofotometro ultravioletto a 260 nanometri. A questo punto, staccare la MICA attaccata a un disco metallico del campione utilizzando dello scotch per ottenere una superficie piana e posizionare un disco del campione sul tavolino di imaging del microscopio.

Aggiungere 40 microlitri di una x e il tampone in ginocchio A seguiti da cinque microlitri del campione purificato dei 24 HELOC per 28 giri rettangolari sulla superficie di Micah appena tagliata. Lasciare riposare il composto per circa due minuti. Installare un chip a sbalzo in nitrito di silicio A FM su un supporto a sbalzo, visualizzare il campione in modalità di maschiatura del fluido utilizzando una dimensione di scansione di due micrometri, 1024 linee per la risoluzione.

E una velocità di scansione da 0,5 a un hertz per la marcatura interna attaccata a tre segmenti primi di 17 nucleotidi a otto tessere interne e sei tessere di confine del rettangolo. Mescolare i 28 fili con le maniglie con il resto dei fili componenti dei 24 HELOC con un rettangolo di 28 giri per ottenere una soluzione madre da 200 NANOMOLAR per l'etichettatura dei confini. Mescolare i 14 fili con le maniglie con il resto dei fili componenti dei 24 mari del tallone per un rettangolo di 28 giri per ottenere una soluzione stock da 200 nanomolari per l'etichettatura interna.

Per l'etichettatura perimetrale, aggiungere 50 microlitri della soluzione madre 200 Nanomolar. 60 microlitri dei 100 micromolari di filamenti anti-impugnatura modificati con biotina. 10 microlitri di 10 tampone di ricottura A e 34 microlitri di acqua distillata deionizzata in una provetta PCR.

Per l'etichettatura interna, aggiungere 50 microlitri della soluzione madre da 200 nanomolari. Tre microlitri del filamento interno anti-impugnatura modificato con biotina a 100 micromolari. 10 microlitri di 10 tampone di ricottura A e 37 microlitri di acqua deionizzata distillata in una provetta PCR.

Successivamente pesare 0,06 grammi di formiato per orinatoio in tre millilitri di acqua distillata. Per preparare una soluzione acquosa al 2% di formiato di formiato per orinatoio, filtrare la soluzione colorante utilizzando un filtro da 0,2 microlitri collegato alla siringa. Aggiungere cinque microlitri di idrossido di sodio normale a un millilitro della soluzione di colorante filtrata.

Dopo aver agitato brevemente la soluzione, centrifugare a 20, 000 G di bagliore. Scaricare le griglie rivestite di carbonio con il lato rivestito rivolto verso l'alto utilizzando le seguenti impostazioni Al termine, pipettare 3,5 microlitri di campione sulla griglia trattata con scarico a incandescenza. Dopo quattro minuti, utilizzare un pezzo di carta da filtro per rimuovere il campione portando la carta da filtro a contatto con la griglia dal lato.

Successivamente, aggiungere immediatamente 3,5 microlitri di soluzione colorante sulla griglia. Dopo un minuto, rimuovere la macchia e tenere la carta da filtro contro la griglia per uno o due minuti. Trasferire la griglia in un portacampioni TEM.

Un'immagine che utilizza A-J-E-O-L GM 1400, operata a 80 kilovolt con ingrandimento che varia da 10 K a 80 K.Una volta identificata la forma, selezionare i filamenti che corrispondono alla forma sulla tela molecolare. Sostituire il dominio esposto con un segmento poli T, lungo da 10 a 11 nucleotidi, oppure aggiungere una protezione per i bordi complementare al dominio esposto e terminarlo con un segmento poli T lungo da 10 a 11 nucleotidi. Per evitare l'aggregazione, creare una libreria di filamenti per l'area di disegno molecolare da 310 pixel, che include il corsetto.

Set di una stella set di due stelle, tre stelle e set di quattro stelle per un totale di 1.344 protezioni per i bordi. Dopo aver centrifugato le piastre a 96 pozzetti per i diversi set, pipettare un microlitro di 206 filamenti dal set di base, zero dal set una stella zero dal set zero, due stelle zero dal set zero, tre stelle e 24 filamenti dal set quattro stelle in una provetta da centrifuga da due millilitri. Aggiungere 20 microlitri di acqua distillata deionizzata al tubo per ottenere una soluzione stock a 400 nanomolari dei filamenti di DNA.

Quindi, aggiungere 50 microlitri della soluzione madre da 400 nanomolari. 10 microlitri di 10 tampone di ricottura B e 40 microlitri di acqua distillata deionizzata in una provetta PCR da 0,2 millilitri e la miscela nel termociclatore per 17 ore come descritto in precedenza. Dopo aver purificato il campione e misurato l'immagine della concentrazione di DNA, il campione utilizzando un FM nello stesso modo di prima costruisce infine rettangoli di dimensioni diverse semplicemente modificando il numero di heoc paralleli e il numero di giri elicoidali.

L'autoassemblaggio di piastrelle a singolo filamento produrrà un rettangolo di 24 HELOC per 28 giri, le sequenze di DNA per le diverse piastrelle a singolo filamento possono essere modificate e ottimizzate per consentire la divisione dello streptococco e l'etichettatura della trasformazione di un rettangolo in un tubo. L'autoassemblaggio programmabile di piastrelle a trefoli singoli per formare tubi e rettangoli di varie dimensioni e la costruzione di forme arbitrarie bidimensionali utilizzando il design a sostituzione di dominio su tela molecolare e il design del protettore dei bordi sono stati testati come soluzioni per l'aggregazione lungo domini esposti di forme arbitrarie. Entrambi i design hanno una resa di gel e un'integrità strutturale comparabili, ma il design della protezione dei bordi è più conveniente poiché richiede meno specie ausiliarie.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come realizzare nanostrutture complesse di DNA basate su tessere a filamento singolo.