Name: Condizionale genetica Transsynaptic Tracing nel cervello embrionali di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Scopri il tracciamento transsinaptico genetico nel cervello embrionale di topo per studiare i circuiti neurali. Questo metodo consente l'analisi a risoluzione di singola cella durante lo sviluppo embrionale.

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Ringraziamo Michael Candlish per i commenti critici sul manoscritto. Questo progetto è stato sostenuto dalle sovvenzioni BO1743/6 e SFB/TRR 152 P11 e Z02 della Deutsche Forschungsgemeinschaft a Ulrich Boehm.

NOTA: Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal comitato il benessere degli animali dell&#39;Università di Amburgo e l&#39;Università di Saarland. 1. Preparazione e fissaggio del tessuto embrionale <ol><li> Disporre tutte le attrezzature necessarie per sezionare gli embrioni e preparare soluzioni per il successivo fissaggio del tessuto prima di sacrificare gli animali. NOTA: preparare sempre una soluzione fresca 4% paraformaldeide (PFA) (4% PFA in 0.1 M tampone fosfato salino (PBS), regolare il pH a 7,4). </li><li> Euthanize cronometrato femmina incinta mouse con una procedura eticamente approvati. </li><li> Trasferire il mouse su una piattaforma. Bagnare la parte ventrale dell&#39;addome con il 70% di etanolo e fare una incisione verticale usando forbici affilate per esporre la cavità addominale. </li><li> Identificare la catena embrionale ed estrarlo con cautela utilizzando una pinza smussato e metterlo in ghiaccio freddo PBS. </li><li> Rimuovere i singoli embrioni dala catena embrionale con le forbici sottili e pinze. Rimuovere il tessuto in più intorno gli embrioni e lavarli in ghiacciata PBS. </li><li> Prendete una piccola biopsia coda (prima di trasferire l&#39;embrione in PFA) e incubare in coda tampone di lisi per l&#39;identificazione di genere e tracciante allele genotipizzazione PCR. </li><li> Avviare dall&#39;embrione al lato più laterale e trasferire ogni embrione separatamente in una provetta contenente ghiacciata 4% PFA su ghiaccio su un agitatore. </li><li> Immergere gli embrioni all&#39;età di E13.5 o più giovani per 1,5 ore sul ghiaccio con costante agitazione. Immergere gli embrioni a E14.5 età e E15.5 per 2,5 ore sul ghiaccio con costante agitazione. </li><li> Per E16.5 embrioni età o più anziani, decapitate e togliere la pelle esterna prima immersione della testa in soluzione PFA. Capi di embrioni E16.5 possono essere messi a bagno per 4,5 ore sul ghiaccio con costante agitazione. </li><li> Dopo la fissazione del caso, lavare gli embrioni tre volte con PBS freddo. Trasferire gli embrioni in 30% di saccarosio in soluzione PBS a 4 ° C fino affondanoal fondo. </li></ol> 2. Congelamento <ol><li> Disporre tutti i materiali necessari prima di iniziare il processo di congelamento: crio-muffa, crio-guanti, pinze piuma entomologia, pennarello e composti temperatura di taglio ottimale (OCT) </li><li> Etichettare la crio-stampo con un pennarello resistente all&#39;alcool permanente (citare l&#39;orientamento del tessuto, la data e il genotipo). Preparare una granita di ghiaccio secco tritato e il 100% di etanolo in un secchio di ghiaccio. Posizionare un bicchiere di vetro all&#39;interno contenente isopentano. Attendere 10 minuti per il isopentano raffreddare. </li><li> Nel frattempo rimuovere il tessuto dalla soluzione di saccarosio, eliminare l&#39;eccesso di saccarosio in tutto il tessuto con salviette di laboratorio. Trasferire il tessuto in una pre-etichettati crio-stampo con sufficiente ottobre per coprire il tessuto. Evitare eventuali bolle d&#39;aria nel ottobre; soprattutto intorno il tessuto. </li><li> Orientare il tessuto in ottobre con pinze entomologia piuma per evitare danni ai tessuti. Inizia congelamento trasferendo la crio-mold nel bagno isopentano pre-raffreddato. Non schizzare isopentano in ottobre in quanto non congelerà correttamente. Avvolgere i campioni in un foglio di alluminio e conservare a -80 ° C. </li></ol> 3. criosezionamento <ol><li> Tagliare 14 micron sezioni seriali sottili in serie &#39;di cinque con un criostato e raccogliere su SuperFrost® Plus Il vetrini per immunofluorescenza (IF) analisi. Conservare i vetrini a -80 ° C fino utilizzato. </li></ol> 4. Tracer visualizzazione Utilizzando la (TSA) Protocol Tyramide amplificazione del segnale <ol><li> Preparare i tamponi e reagenti necessari per la colorazione. Sempre fresco preparare il tampone Tris-NaCl-Tween (TNT) il giorno di utilizzo. <ol><li> Preparare tampone TNT usando 100 ml di 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml di NaCl 5 M e DDH 2 O fino ad un volume finale di 1 L. Aggiungere 500 ml di Tween 20 con una pipetta 1 ml. Aggiungere il Tween 20 lentamente e lavare la pipetta su e giù più volte per garantire che tutti Tween 20 è insoluzione. </li><li> Preparare Tris-NaCl-bloccante (TNB) tampone con 100 ml di 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml di NaCl 5 M e DDH 2 O fino ad un volume finale di 1 L. Aggiungere 5 g Blocking Reagent (disponibile con il kit) lentamente in piccoli incrementi nel buffer agitando. Riscaldare la soluzione gradualmente a 55 ° C con agitazione continua per sciogliere completamente i reagenti blocco (non dovrebbe richiedere più di 30-60 min). Per ottenere il riscaldamento omogeneo utilizzare un bagno d&#39;acqua a 55 ° C. La soluzione appare lattiginosa. Portare la soluzione a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. Aliquota e conservare a -20 ° C per la conservazione a lungo termine. </li><li> Ricostituire biotina reagente tiramide (fornito con il kit) in Biologia Molecolare / HPLC-grade DMSO. A seconda del kit viene utilizzato l&#39;appropriata quantità di DMSO può variare. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C. NOTA: Sezioni di animali eterozigoti per i rispettivi alleli Cre e R26 possono essere utilizzati per l&#39;analisi del circuito. Usa sessioni da littermates trasportano una Cre o un allele R26, rispettivamente, come controlli negativi. Trattare vetrini di controllo negativi esattamente come diapositive di animali doppi eterozigoti. Inoltre, include una diapositiva di controllo da una doppia animale eterozigote, ma lasciare fuori il reagente TSA (controllo non amplificato). </li></ol></li><li> Usando un bisturi affilato fresco rimuovere l&#39;eccesso di ottobre che circonda le sezioni di tessuto e segnare il confine intorno sezioni con una penna PAP. </li><li> Essiccare i vetrini per 2-3 minuti a temperatura ambiente (RT). Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuna. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 30 minuti a 0,3% H soluzione 2 O 2 in metanolo ghiacciata per placare la perossidasi endogena. </li><li> Lavare 3x con PBS per 5 minuti ciascuna a RT. Incubare per 10 minuti a 0,5% Triton X-100 in PBS per permeabilizzazione tessuto. Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuna. </li><li> Block con TNB (soluzione bloccante, 200-300 ml per vetrino) per 30min a RT in una camera umidificata. Assicurarsi che tutte le sezioni sono completamente coperti da TNB. Non lasciate che le diapositive asciugare tra le fasi. </li><li> Scolare il tampone di blocco in eccesso e applicare l&#39;antisiero primario riconoscere il tracciante (1: 1.000 capra anti-WGA per BL, 1: 15.000 coniglio anti-GFP per GTT) diluito in TNB per 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. Assicurarsi di utilizzare un volume sufficiente per coprire completamente la sezione di tessuto (200-300 ml per vetrino). NOTA: Le diluizioni sieri specifici primari raccomandati qui possono avere da regolare. </li><li> Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuno con agitazione. </li><li> Incubare le sezioni con biotinilato antisiero secondario riconoscono l&#39;ospite della prima dell&#39;antisiero (1: 500 cavalli IgG anti-capra anti-WGA, 1: IgG anti-coniglio di capra 5.000 per anti-GFP in TNB per 1 ora a RT). </li><li> Lavare 3x con TNT a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuno con agitazione. Incubare in 1: 100 streptavidina (SA) -conjugated perossidasi (SA-HRP, fornito with kit) in TNB per 30 minuti a RT in una camera umidificata. Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuna. Intanto scongelare il TSA. </li><li> Diluire TSA 1:50 TSA amplificazione diluente (fornito con il kit; utilizzare il kit TSA per la visualizzazione di BL e il kit + TSA per GTT). Incubare le sezioni di tessuto in diluita TSA proprio per 10 minuti a temperatura ambiente. Diluire TSA al momento dell&#39;uso, ideale durante la fase di lavaggio precedente, non utilizzare alcun residuo reattivo TSA diluito per futuri esperimenti; sempre preparare fresco. </li><li> Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuno con agitazione. Incubare con 1: 500 Alexa Fluor® 546 streptavidina coniugato in TNB per 30 minuti a RT. Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuno con agitazione. </li><li> Incubare per 10 min in soluzione Bisbenzimide 5% in PBS a temperatura ambiente per colorazione nucleare. Lavare i vetrini a RT 3x con TNT per 5 minuti ciascuno con agitazione. Montare con Fluromount G ed eseguire epifluorescenza o microscopia confocale. <em&gt; Risoluzione: Efficacia di trasferimento tracciante dipenderà dal livello di espressione del locus ROSA26 nelle cellule che producono (determinata dalla linea pilota Cre utilizzato) e sul circuito neurale analizzato (ad esempio numero di neuroni che producono il tracciante, convergenza etc.). Pertanto, le diluizioni sieri specifici primari raccomandati qui possono essere adeguati per evitare segnale basso o in eccesso. Background dovrebbe sempre essere analizzati utilizzando appositi vetrini di controllo (vedi sopra). </li></ol> 5. τlacZ colorazione per sezioni embrionali <ol><li> Preparare i tamponi e reagenti necessari per la colorazione. Sempre fresco preparare il LacZ tampone C prima dell&#39;uso. <ol><li> Preparare 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-gal) soluzione madre (40 mg / ml) aggiungendo 40 g di X-gal a 1 ml 70% dimetilformammide (DMF). Coprire con un foglio di alluminio e conservare a -20 ° C per la conservazione a lungo termine. </li><li> Preparare nitro blu tetrazolio (NBT) stock soluzione (50 mg / ml) aggiungendo 50 g di NBT per 1 ml 70% DMF. Coprire con un foglio di alluminio e conservare a -20 ° C per la conservazione a lungo termine. </li><li> Preparare LacZ fissativo utilizzando 80 ml ​​di 25% glutaraldeide, 5 ml di 4% PFA, 20 ml di 1 M MgCl 2, 100 ml di EGTA 500 ​​mM, 1 ml di 1 M tampone fosfato pH 7,4 e DDH 2 O fino a un finale volume di 10 ml. </li><li> Preparare tampone LacZ A con 1 ml di 1 M MgCl 2, 5 ml di EGTA 500 ​​mM, 50 ml di 1 M tampone fosfato pH 7,4 e DDH 2 O fino ad un volume finale di 500 ml. </li><li> Preparare LacZ tampone B con 1 ml di 1 M MgCl 2, 5 ml di EGTA 500 ​​mm, 5 ml di 1% sodio desossicolato, 100 ml di 10% NP-40, 50 ml di 1 M tampone fosfato pH 7,4 e DDH 2 O fino ad un volume finale di 500 ml. </li><li> Preparare LacZ tampone C con l&#39;aggiunta di 10 ml di soluzione madre NBT e 12,5 ml di soluzione madre X-gal a 1 ml di LacZ tampone B. Trucco fresco appena prima dell&#39;uso e coprire con un foglio di alluminio. </li></ol&gt; </li><li> Asciugare i vetrini a RT almeno per 10-15 minuti (nel frattempo preparare i vetrini con una penna PAP). </li><li> Fissare la sezione con LacZ fissante per 2 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata all&#39;interno di una sostanza chimica fumi-cappuccio. Lavare 3 volte con PBS completato con 2 mM MgCl 2. </li><li> Sciacquare i vetrini con LacZ tampone A. Lavare i vetrini con LacZ tampone A 3 volte per 10 minuti ciascuno a RT. Lavare 2 volte con LacZ tampone B per 5 minuti ciascuno. Incubare i vetrini in LacZ tampone C a 30-37 ° C per 6 ore o durante la notte in una camera umidificata. NOTA: Aggiungere un volume sufficiente di LacZ buffer di C; scivoli non devono asciugare durante l&#39;incubazione. </li><li> Dopo adeguata incubazione lavare i vetrini con PBS integrato con 2 mM MgCl 2. Sciacquare sezioni brevemente con DDH 2 O. Coverslip con glicina gelatina di Mayer. Adatta per un microscopio ottico equipaggiato con un contrasto interferenziale differenziale (DIC) di imaging set-up. </li></ol> 6. Gender e Tracer genotipizzazione <ol><li> Preparare coda tampone di lisi utilizzando 1 ml di 1 M Tris-HCl pH 8,5, 100 ml di EGTA 500 ​​mM, 200 ml di 10% SDS, 400 ml di NaCl 5 M e DDH 2 O per fare un volume finale di 10 ml. </li><li> Aggiungere 500 pl di tampone di lisi coda a ciascuna provetta Eppendorf contenente una biopsia coda. Aggiungere proteinasi K ad una concentrazione finale di 100 mg / ml. Incubare per una notte su un agitatore a 55 ° C. </li><li> Centrifugare i campioni a 17.000 xg per 10 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga. Aggiungere 500 ml di isopropanolo al supernatante. Mescolare per almeno 5 minuti invertendo i tubi su e giù. </li><li> Spin in centrifugare a 17.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante. Aggiungere 200 ml di etanolo al 70%. Agitare per almeno 5 minuti. </li><li> Centrifugare a 17.000 g per 5 min. Rimuovere il surnatante con una Pipetman (non versare off). Essiccare il pellet in una camera calda (37 ° C) per 15-30 min. </li><li> Risospendere pellet in 100 mlbassa TE pH 8,0 o acqua con punte ampio tunnel filtrata. Mettere in 55 ° C per 1 ora ea 37 ° C per una notte per una corretta dissoluzione. Conservare a 4 ° C. </li><li> Usare 1 ml di DNA per reazione PCR (miscela di reazione 50 microlitri contenente 1 ml di DNA coda, 2,5 microlitri DMSO, 10:00 di ciascun primer, 25 mM di ciascun dNTP, e betaina 1M). Primer PCR per la genotipizzazione e l&#39;identificazione di genere sono elencati nella tabella dei materiali. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Esprimendo traccianti transsynaptic come transgeni per rintracciare i circuiti neurali di popolazioni di neuroni geneticamente definiti ha diversi vantaggi rispetto alla iniezione stereotassica di traccianti o virus neurotopic. Innanzitutto, il tracciante viene prodotta come proteina endogena e pertanto non suscitare una risposta immunitaria e un percorso neurale selettiva può essere analizzato in diversi animali con elevata riproducibilità. In secondo luogo, perché questo è un metodo non invasivo può essere utilizzato ...

Anatomico percorso tracciato è uno degli strumenti più comunemente utilizzati per decifrare il rapporto tra cervello e comportamento 1. Avanzamento in tecnologie dei circuiti neurali tracciatura ha concesso neuroscienziati con la possibilità di ricostruire i circuiti neurali da popolazioni di neuroni geneticamente identificati nei topi 2. Nonostante questi progressi tecnici rimane difficile da svelare la formazione dei circuiti neurali soprattutto durante la maturazione embrionale. Questo perché la maggior parte dei metodi di tracciamento sviluppati fino ad oggi sono basate su iniezione stereotassica di rivelatori transsynaptic o virus neurotropici geneticamente modificati (Figura 1) 2,3. Mentre queste tecniche raggiungono risoluzione spaziale e temporale della connettività, alcuni limiti intrinseci, come tecnicamente impegnativi iniezioni traccianti nel cervello in via di sviluppo, la riproducibilità del sito di iniezione, potenziale infiammazione al sito di iniezione e più importanza citotossicità causata da virus neurotropici limitare il loro utilizzo 4. Un metodo alternativo è quello di esprimere i traccianti transsynaptic come transgeni in topi geneticamente modificati. Abbiamo recentemente modificato questa tecnica e sviluppato un sistema binario transsynaptic genetico analisi per mappare i circuiti neurali di qualsiasi popolazione neuronale geneticamente identificato 5. La nostra strategia sperimentale si basa su due nuovi ceppi di topi knock-in, che esprimono sia la lectina bidirezionale tracciante orzo (BL) 6 o il tracciante retrogrado tossina tetanica frammento C fusa a GFP (GTT) 7 dalla ROSA 26 locus dopo Cre-mediata ricombinazione. Qui abbiamo usato questi ceppi di topi per esprimere selettivamente BL e GTT in neuroni che producono kisspeptin, un neuropeptide che è implicato nella regolazione della maturazione dell&#39;asse riproduttivo 8,9. Dimostriamo che questa tecnica è adatta per visualizzare lo sviluppo e la maturazione del baciopeptin circuiti neurali durante lo sviluppo embrionale del topo cervello femminile 5. Strategia di allevamento La R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) e R26-GFP-TTC (GTT) linee traccianti sono knock-in ceppi 5 che portano alleli ROSA26 ricombinanti. La R26-BIZ e gli alleli R26-GTT sono trascrizionalmente silente a causa della presenza di un forte segnale di arresto della trascrizione, che è affiancato da due siti loxP 5. Espressione del transgene BIZ e GTT è attivato dalla rimozione Cre-mediata del segnale di arresto trascrizionale. Gli alleli R26-BIZ e R26-GTT possono essere utilizzati indipendentemente attraversando semplicemente con una linea pilota Cre. Per gli animali di analisi eterozigoti per i rispettivi alleli Cre e R26 può essere utilizzato. Nidiata che trasportano una Cre o un allele R26, rispettivamente, dovrebbero essere utilizzati come controlli. In alternativa, è anche possibile generare tRiple knock-in animali portatori degli alleli Cre, R26-BIZ e R26-GTT, tuttavia ciò richiederà una croce supplementare.

<table><tbody><tr><td>Bisbenzimmide (colorante Hoechst 33258)</td><td>Sigma</td><td>14530-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>Stampo criogenico (Peel-a-way)</td><td>Polyscience Inc.</td><td>18646A-1</td><td>22 x 22 x 20 mm</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformammide (DMF)</td><td>VWR Chemicals</td><td>23470,293</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Sigma</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Sigma</td><td>34988-7</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano (Metil 2-butano)</td><td>Sigma</td><td>M32631-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina glicina di Kaiser</td><td>Merck</td><td>1092420100</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma</td><td>494437-1L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ROTH</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Sigma</td><td>298-83-9</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 sostituto</td><td>Fluka</td><td>743.85</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>PAP penna</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Parafarmaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodio desossicolato</td><td>Sigma</td><td>D6750-25G</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Kit guide Superfrost</td><td>Thermo Scientific</td><td>FT4981GLPLUS</td><td></td></tr><tr><td>TSA</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL700</td><td></td></tr><tr><td>TSA plus kit</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL749A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>ROTH</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ROTH</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>ROTH</td><td>2315.1</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico dotato di imaging DIC</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 dotato di software</td><td></td>Axio Vision</tr><tr><td>Microscopio a fluroscenza</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 dotato di software</td><td></td>Axio Vision</tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-WGA (riconosce BL)</td><td>Vector Laboatories</td><td>AS-2024</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorio vettoriale IgG anti-capra biotinilata</td><td></td><td>di cavallo BA-9500</td><td></td></tr><tr><td>Laboatori vettoriali</td><td>IgG di capra biotinilata</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti-GFP (riconosce GTT)</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Reagente bio di affinità</td><td>anti-GnRH di coniglio</td><td>PA1-121</td><td></td></tr><tr><td>Dylight488-donkey anti-coniglio IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10038</td><td></td></tr><tr><td>SA-Alexa Fluor 546</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Primers</td></tr><tr><td>BL Fwd (per la genotipizzazione BIZ)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC</td></tr><tr><td>BL Rev (per la genotipizzazione BIZ)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCCCTCGCCGCAGAACTC</td></tr><tr><td>Cre Fwd (per la genotipizzazione Cre)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG</td></tr><tr><td>Cre Rev (per la genotipizzazione Cre)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC</td></tr><tr><td>TTC Fwd (per la genotipizzazione GTT)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT</td></tr><tr><td>TTC Rev (per la genotipizzazione GTT)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA</td></tr><tr><td>XY Fwd (per la genotipizzazione di genere)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>TGAAGCTTTTGGCTTTGA</td></tr><tr><td>XY Rev (per la genotipizzazione di genere)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCGCTGCCAAATTCTTTG</td></tr><tr><td>ROSA26 Fwd</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCCTCTGAGTTGTTATC</td></tr><tr><td>ROSA26 Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GCAGATGGAGCGGGAGAGAAAT</td></tr><tr><td>SA Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr></tbody></table>

condizionale genetica transsynaptic tracing nel cervello embrionali di topo

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Il tracciamento del percorso anatomico è di fondamentale importanza per decifrare la relazione tra cervello e comportamento. Svelare la formazione di circuiti neurali durante la maturazione embrionale del cervello, tuttavia, è tecnicamente impegnativo perché la maggior parte dei metodi di tracciamento transsinaptico sviluppati fino ad oggi dipendono dall'iniezione di traccianti stereotassici. Per superare questo problema, abbiamo sviluppato una strategia genetica binaria per il tracciamento genetico transsinaptico condizionale nel cervello del topo. A tal fine, abbiamo generato due ceppi murini knock-in complementari per esprimere selettivamente il tracciante transsinaptico bidirezionale lectina d'orzo (BL) e il tracciante transsinaptico retrogrado Tetanus Toxin fragment C dal locus ROSA26 dopo ricombinazione mediata da Cre. La produzione di traccianti cellulo-specifici in questi topi è geneticamente codificata e non dipende dall'iniezione meccanica di traccianti. Pertanto, il nostro approccio sperimentale è adatto per studiare la formazione dei circuiti neurali nel cervello murino embrionale. Inoltre, poiché il trasferimento del tracciante attraverso le sinapsi dipende dall'attività sinaptica, questi ceppi di topo possono essere utilizzati per analizzare la comunicazione tra popolazioni neuronali geneticamente definite durante lo sviluppo del cervello con una risoluzione di una singola cellula. Qui forniamo un protocollo dettagliato per il tracciamento transsinaptico in embrioni di topo utilizzando i nuovi alleli ricombinanti ROSA26. Abbiamo utilizzato questa tecnica sperimentale per delineare i circuiti neurali alla base della maturazione dell'asse riproduttivo nel cervello di topo femmina in via di sviluppo.

Questa sezione mostra i risultati rappresentativi che possono essere ottenuti lavorando con la R26-BIZ (B L- I RES-τlac Z) e la R26-GTT (G FP TT C) alleli. Qui usiamo la R26-BIZ e gli alleli R26-GTT per analizzare la maturazione dei circuiti neurali che regolano l&#39;asse riproduttivo. La riproduzione in vertebrati è controllata centralmente da un piccolo sottogruppo di neuroni dell&#39;ipotalamo, che secernono l&#39;ormone di rilascio delle gonadotropine ...

Capitalizzando su una strategia genetica binaria, forniamo un protocollo dettagliato per il tracciamento dei circuiti neurali nei topi che esprimono traccianti transsinaptici complementari dopo la ricombinazione mediata da Cre. Poiché la produzione di traccianti cellulo-specifici è geneticamente codificata, il nostro approccio sperimentale è adatto per studiare la formazione e la maturazione dei circuiti neurali durante lo sviluppo del cervello embrionale murino con una risoluzione di una singola cellula.

Condizionale genetica Transsynaptic Tracing nel cervello embrionali di topo

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

L'obiettivo del seguente esperimento è visualizzare lo sviluppo dei circuiti neurali nel cervello del topo embrionale utilizzando tre distinti sistemi di marcatura cellulare: un tracciante transsinaptico che si sposta in modo bidirezionale, un secondo tracciante che si sposta esclusivamente in senso retrogrado e un terzo marcatore che non si sposta dalla cellula bersaglio. È possibile identificare il neurone bersaglio, i neuroni a monte e i neuroni a valle. I risultati dimostrano che questo protocollo sperimentale può essere utilizzato per analizzare la formazione dei circuiti neurali nel cervello embrionale della topo femmina con risoluzione a singola cellula.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neuroscienza dello sviluppo, ad esempio quando si formano specifici circuiti neurali e come vengono organizzati durante lo sviluppo embrionale. Questo metodo può inoltre essere utilizzato per tracciare i circuiti neurali nei topi adulti. In particolare, può essere impiegato per analizzare l'attività sinaptica tra neuroni geneticamente identificati, e può essere usato per studiare come diverse condizioni sperimentali possano modulare un circuito

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Un metodo di trasferimento genico nel cervello del mouse di sviluppo è descritta utilizzando un metodo unico chirurgico e la forma speciale di elettrodi. Questa tecnica unica consente la trasfezione di DNA plasmidico temporalmente e spazialmente, che aiuterà molti neuroscienziati a studiare lo sviluppo del cervello.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo per elettroporare in utero della corteccia cerebrale e l'ippocampo a E14.5 nei topi. Abbiamo anche dimostrato che questo è un metodo valido per studiare dendriti e spine in queste due regioni cerebrali.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

Un metodo di tracciare neuroni sinapticamente collegate è descritto. Usiamo specificità TVA di una cella a monte per sondare se una popolazione di cellule riceve input sinaptico da tipi di cellule geneticamente definiti.

Viral Tracciamento di geneticamente definito circuiti neurali

Fonte: Denaxa, M., el al., Trapianto di progenitori interneuronali corticali chemiogeneticamente modificati in cervelli di topo postnatali precoci. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra la procedura per iniettare un vettore plasmidico che trasporta il gene di interesse nei progenitori degli interneuroni in una fetta di cervello embrionale, seguita dall'elettroporazione per l'ingresso nel plasmide e l'espressione genica. Questi progenitori modificati possono essere successivamente utilizzati...

Trasferimento genico assistito da elettroporazione incorporato in agarosio nei progenitori degli interneuroni corticali di topo

Come le reti neuronali sono stabiliti nel cervello embrionale è una questione fondamentale nella neurobiologia dello sviluppo. Qui abbiamo combinato una tecnica di elettroporazione con nuovi strumenti genetici, come ad esempio Cre / Lox-plasmidi e PiggyBac-mediata sistema trasposizione del DNA nel romboencefalo aviaria di etichettare interneuroni dorsali e monitorare le loro proiezioni assonali e traguardi sinaptiche a vari stadi di sviluppo.

Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo

Nonostante l'importanza funzionale e mediche...

La manipolazione genetica del topo sviluppo dell&#39;ipotalamo attraverso<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

Descriviamo una tecnica per etichettare i neuroni ei loro processi tramite iniezioni anterograda o traccianti retrogradi in nuclei cerebrali con una preparazione in vitro. Abbiamo modificato un metodo esistente di i n vitro tracciante elettroporazione sfruttando fluorescente mutanti di topo attrezzatura ottica e di base al fine di aumentare la precisione di etichettatura.

Neuronal Tracing negli espianti cerebrali a guida laser

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell'utilizzo dell'elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l'imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

Cella-autonome funzioni dei geni nel cervello possono essere studiate inducendo perdita o guadagno di funzione in popolazioni sparse delle cellule. Qui, descriviamo in utero elettroporazione per consegnare la Cre ricombinasi nelle popolazioni sparse di sviluppare neuroni corticali con floxed geni per causare la perdita di funzione in vivo.

Induzione della ricombinazione di Cre-lox nella corteccia cerebrale del Mouse attraverso elettroporazione In Utero

La combinazione di microscopia elettronica di trasmissione e trasduzione nell'utero è un approccio potente per studiare i cambiamenti morfologici nell'ultrastruttura bene del sistema nervoso durante lo sviluppo. Questo metodo combinato consente approfondimenti cambiamenti nei dettagli strutturali sottostanti la neuroplasticità rispetto alla loro rappresentazione topografica.

Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturali dopo In Utero trasduzione del Mouse cervello e midollo spinale

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Scopri il tracciamento transsinaptico genetico nel cervello embrionale di topo per studiare i circuiti neurali. Questo metodo consente l'analisi a risoluzione di singola cella durante lo sviluppo embrionale.

Condizionale genetica Transsynaptic Tracing nel cervello embrionali di topo

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