Condizionale genetica Transsynaptic Tracing nel cervello embrionali di topo
22 dicembre 2014
Capitalizzando su una strategia genetica binaria, forniamo un protocollo dettagliato per il tracciamento dei circuiti neurali nei topi che esprimono traccianti transsinaptici complementari dopo la ricombinazione mediata da Cre. Poiché la produzione di traccianti cellulo-specifici è geneticamente codificata, il nostro approccio sperimentale è adatto per studiare la formazione e la maturazione dei circuiti neurali durante lo sviluppo del cervello embrionale murino con una risoluzione di una singola cellula.
L'obiettivo del seguente esperimento è quello di visualizzare lo sviluppo di circuiti neurali nel cervello embrionale di topo utilizzando tre distinti sistemi di marcatura cellulare utilizzando un tracciante transsinaptico che viaggia in modo bidirezionale, un secondo tracciante che viaggia solo in modo retrogrado e una terza etichetta che non viaggia dalla cellula bersaglio. È possibile identificare il neurone bersaglio, i neuroni a monte e i neuroni a valle. I risultati dimostrano che questo protocollo sperimentale può essere utilizzato per analizzare la formazione di circuiti neurali nel cervello embrionale di topo femmina con una risoluzione di una singola cellula.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze dello sviluppo, come ad esempio quando si formano specifici circuiti neurali e come sono organizzati durante lo sviluppo embrionale. Questo metodo può essere utilizzato anche per tracciare i circuiti neurali nei topi adulti. In particolare, può essere utilizzato per analizzare l'attività sinaptica tra neuroni geneticamente identificati e può essere utilizzato per analizzare come diverse condizioni sperimentali possono modulare un circuito neurale nel tempo.
Inizia con un topo incinta appena soppresso. Pulisci il lato ventrale dell'addome con etanolo al 70%, quindi fai un'incisione verticale per esporre gli embrioni. Rimuovi la catena di embrioni e trasferiscili in un piatto di PBS ghiacciato nel piatto.
Rimuovere i singoli embrioni utilizzando una pinza smussata. Separare i singoli embrioni in soluzione utilizzando forbici sottili e pinze, rimuovendo il tessuto in eccesso durante il processo quando gli embrioni sono completamente puliti. Prelevare una piccola biopsia della coda da ciascun embrione e metterla in una provetta di tampone di lisi per raccogliere il DNA per l'identificazione del genere e la genotipizzazione.
Quindi trasferisci l'embrione in ghiaccio appena fatto, 4% di PFA su ghiaccio. Dopo aver processato ogni embrione, lasciarlo incubare nel PFA agitando per almeno 1,5 ore, a seconda delle sue dimensioni. Al termine dell'incubazione.
Lavare i fazzoletti fissati tre volte con PBS ghiacciato per almeno cinque minuti per lavaggio. Quindi trasferire gli embrioni in una soluzione di saccarosio al 30%, mantenuta a quattro gradi Celsius. Quando i tessuti sono completamente immersi nella soluzione, procedere con la criosezione.
Innanzitutto, inizia etichettando uno stampo criogenico utilizzando un pennarello permanente resistente all'alcol. Successivamente, preparare un impasto di ghiaccio secco tritato in etanolo al 100% in un secchiello per il ghiaccio utilizzando l'impasto liquido per raffreddare un becher di vetro di isop pentano per circa 10 minuti. Durante l'attesa, rimuovere i fazzoletti dalla soluzione di saccarosio e rimuovere il saccarosio in eccesso con una normale salvietta da laboratorio.
Quindi trasferire il fazzoletto in uno stampo criogenico pre-etichettato. Con una quantità sufficiente di OCT per coprire il tessuto. Non formare bolle d'aria nell'OCT, soprattutto intorno al tessuto.
Successivamente, orientare il tessuto utilizzando una pinza per entomologia a peso piumato per causare danni minimi. Congelare gli stampi criogenici nel bagno di pentano iso raffreddato senza causare schizzi, se necessario. Gli stampi congelati possono essere avvolti e conservati a meno 80 gradi Celsius per sezionare gli stampi.
Tagliateli in sezioni seriali spesse 14 micron in serie di cinque. Raccogli ogni serie di cinque fette su un vetrino super frost plus. Quando si prepara la soluzione per questo protocollo, assicurarsi di aggiungere lentamente l'interpolazione 20 al tampone TNT, che deve essere preparato fresco.
Quindi sciacquare lentamente la soluzione su e giù per mescolare. Nella preparazione del tampone TNB, aggiungere lentamente il reagente bloccante con piccoli incrementi mescolando. Quindi riscaldare la soluzione a 55 gradi Celsius usando un bagnomaria.
La soluzione diventerà lattiginosa. Ora, per iniziare a lavorare sui tessuti, usa prima un bisturi per rimuovere l'OCT in eccesso che circonda le sezioni di tessuto. Quindi segna i confini di ogni sezione usando un penna.
Lasciare che i vetrini raggiungano la temperatura ambiente. Quindi lavarli a temperatura ambiente un tampone XPBS, tre volte ogni lavaggio dovrebbe durare cinque minuti. Successivamente, spegnere l'attività endogena della perossidasi incubando i vetrini per mezz'ora in acqua ghiacciata, perossido di idrogeno allo 0,3% in metanolo.
Seguire questo con tre lavaggi in PBS a temperatura ambiente per cinque minuti per lavaggio. Quindi incubare i vetrini per 10 minuti in PBST per permeare i tessuti. Questa volta, lavare i vetrini tre volte con TNT.
Ora in una camera umidificata, bloccare il tessuto in una quantità di TNB sufficiente a coprire ogni vetrino. Lasciare agire il blocco per mezz'ora a temperatura ambiente. Non lasciare che le guide si secchino.
Dopo aver drenato il tampone di blocco, coprire completamente il vetrino con l'anticorpo primario contenuto in TNB per legare il tracciante. Incubare per due ore a RT o per una notte a quattro gradi Celsius. Per rimuovere l'anticorpo primario, lavare il vetrino con TNT tre volte a temperatura ambiente per cinque minuti per lavaggio.
Durante questi lavaggi, agitare delicatamente. Quindi, incubare le sezioni nella soluzione di anticorpi secondari per un'ora. Successivamente a temperatura ambiente, utilizzare tre lavaggi di TNT per rimuovere l'anticorpo secondario non legato.
Quindi, in una camera umidificata, incubare i tessuti in una a 100 perossidasi di rafano coniugata con havein spogliato in TNB per 30 minuti a temperatura ambiente mentre si lavano i vetrini in TNT. Dopo l'incubazione, effettuare una nuova diluizione della soluzione TSA. Ora applica la diluizione TSA appena fatta sui tessuti per esattamente 10 minuti a temperatura ambiente.
La tempistica precisa dell'incubazione della TSA è fondamentale. Pertanto, non cercare di elaborare troppe diapositive alla volta nella nostra mano. È possibile gestire fino a 10 vetrini in un solo passaggio.
I vetrini aggiuntivi possono attendere nel buffer di lavaggio TNT fino a quando non vengono lavorati Dopo un altro ciclo di lavaggi. Incubare i fazzoletti con uno a 500 Alexa floor 5 46 stripped. Tenerlo in coniugato in TNB per 30 minuti.
A temperatura ambiente, rimuovere il coniugato abitante spogliato con altri tre bagni di TNT. Quindi, per la colorazione nucleare, applicare una soluzione di BIS benza al 5% in PBS a temperatura ambiente per 10 minuti, rimuovere la colorazione BIS benzo con tre lavaggi TNT. Montare quindi i vetrini con fluoro Mount G e procedere con la loro analisi.
Utilizzando il protocollo descritto, è stata analizzata la maturazione dei circuiti neurali che regolano l'asse riproduttivo in topi portatori degli alleli R 26 BIZ e R 26 GTT. L'espressione dei transgeni è stata attivata dalla ricombinazione dipendente dal credo nei neuroni embrionali della kisspeptina nel nucleo arcuato utilizzando una doppia immunofluorescenza della linea driver specifica per la kisspeptina in verde e BL in rosso da un bacio. IC R 26 BIZ.
Il topo mostra l'attivazione di BL nel KISS IC R 26 GTT La doppia immunofluorescenza del topo mostra la KISSPEPTINA in verde e la GTT attivata dal driver Cree in rosso. Questi e altri strumenti diagnostici hanno dimostrato che i transgeni erano funzionali negli embrioni sperimentali E 18.5. I suoi neuroni pepina nel nucleo arcuato sono stati trovati già in comunicazione con il GNRH.
I neuroni privi di Z erano confinati ai neuroni kisspeptina che esprimevano CRE, mentre BL era trans trasferito sinapticamente ai neuroni a monte e a valle. Alcuni, ma non tutti. I neuroni GNRH contenevano bl.
Quindi solo un sottogruppo di neuroni GNRH embrionali è sinapticamente connesso ai neuroni kisspeptina del nucleo arcuato. I neuroni GNRH non contenevano il tracciante retrogrado. GTT dimostrando che questi neuroni sono a valle dei neuroni della kisspeptina.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un giorno dopo questa procedura. Altri metodi, come la doppia immunofluorescenza, possono essere utilizzati per identificare la natura biochimica dei neuroni collegati. Questa tecnica dovrebbe aprire la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze e della biologia dello sviluppo per esplorare la connettività neurale con una risoluzione di una singola cellula sia durante lo sviluppo che negli animali adulti.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare la formazione e la maturazione dei circuiti neurali nei topi.
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Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo per la tracciatura dei circuiti neurali nel cervello del topo embrionale mediante traccianti transsinaptici codificati geneticamente. Il metodo consente la visualizzazione dello sviluppo dei circuiti neurali con risoluzione a livello di singola cellula.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Circuiti neurali
Sfondo
- Comprendere la formazione dei circuiti neurali è fondamentale per la neuroscienza dello sviluppo.
- I traccianti transsinaptici permettono lo studio della connettività neuronale.
- Il cervello del topo embrionale rappresenta un modello per lo studio dello sviluppo neurale.
- La produzione di traccianti specifici per cellula consente un'analisi mirata.
Scopo dello studio
- Visualizzare lo sviluppo dei circuiti neurali nel cervello del topo embrionale.
- Analizzare l'organizzazione di circuiti neurali specifici durante lo sviluppo.
- Fornire un protocollo applicabile sia a topi embrionali che adulti.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di tre sistemi distinti di marcatura cellulare.
- Applicazione di un tracciante transsinaptico bidirezionale.
- Uso di un tracciante retrogrado e di un marcatore non diffusibile.
- Analisi a risoluzione singola cellulare dei circuiti neurali.
Risultati principali
- Il protocollo identifica con successo i neuroni a monte e a valle.
- I risultati dimostrano la formazione di circuiti neurali nel cervello embrionale del topo femmina.
- Il metodo può analizzare l'attività sinaptica in neuroni identificati geneticamente.
- Permette di esaminare come le condizioni sperimentali influenzino i circuiti neurali nel tempo.
Conclusioni
- Questo protocollo sperimentale è efficace per lo studio dello sviluppo dei circuiti neurali.
- Fornisce informazioni sui tempi e sull'organizzazione dei circuiti neurali.
- Il metodo è versatile per l'analisi dei circuiti neurali sia nell'embrione che nell'adulto.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere la formazione dei circuiti neurali durante lo sviluppo embrionale fornisce informazioni meccanicistiche sui disturbi dello sviluppo neurologico e supporta la validazione degli obiettivi nella scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale. Questo approccio di tracciamento transsinaptico basato su codifica genetica permette la mappatura dipendente dall'attività delle connessioni sinaptiche con risoluzione a livello di singola cellula, offrendo un sistema riproducibile per ridurre i rischi associati a ipotesi terapeutiche relative alla connettività neurale. Eliminando la necessità di iniezioni stereotassiche, il metodo migliora la standardizzazione e la scalabilità attraverso diversi punti temporali dello sviluppo e diversi background genetici, favorendo una preparazione costante dei saggi per studi sull'interazione con il bersaglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione della connettività sinaptica tra popolazioni neuronali geneticamente definite durante finestre critiche dello sviluppo.
- Valore operativo: Fornisce un sistema codificato geneticamente e privo di iniezioni che garantisce un'espressione costante del tracciante e riduce la variabilità negli esperimenti di mappatura dei circuiti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative del segnale transsinaptico dipendenti dall'attività, che riflettono la comunicazione sinaptica funzionale tra neuroni a monte e a valle.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione dei saggi mediante espressione dipendente da Cre e specifica per locus dal locus ROSA26, consentendo la preparazione riproducibile del tessuto nervoso per analisi a valle.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico consentendo ai ricercatori di tracciare come perturbazioni genetiche o farmacologiche influenzino la formazione dei circuiti neurali nel tempo in modelli embrionali rilevanti per la malattia.
- Valore operativo: Offre un flusso di lavoro compatibile con piattaforme che può essere integrato con procedure di immunofluorescenza, genotipizzazione e analisi dell'immagine per una validazione multiparametrica dell'interazione con il bersaglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo supporta i flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta consentendo una mappatura dei circuiti guidata da ipotesi prima dell'identificazione del capostazione, fornendo output che informano sul livello di fiducia del bersaglio e sulla prontezza allo screening fenotipico nei programmi di sviluppo neurologico.
- Biologia della scoperta: Supporta la riduzione del rischio biologico visualizzando la formazione e la maturazione di circuiti neurali specifici, come quelli che regolano l'asse riproduttivo, con risoluzione a singola cellula.
- Screening: Permette la preparazione di sistemi neurali standardizzati e geneticamente tracciabili, adatti per valutare gli effetti di composti sulla connettività sinaptica nel cervello embrionale o adulto.
- Analisi: Produce letture quantitative basate sulla fluorescenza (ad esempio, trasferimento del segnale BL, GTT) che consentono il confronto dell'attività sinaptica tra diverse condizioni, genotipi o stadi di sviluppo.
- Ricerca traslazionale: Collega la formazione dei circuiti embrionali alla funzione postnatale permettendo un'analisi longitudinale di come le perturbazioni precoci dello sviluppo influenzino la connettività neurale nell'adulto.
- Riutilizzo aziendale: Le linee con doppio inserimento in ROSA26 rappresentano una piattaforma genetica riutilizzabile, applicabile a diversi bersagli del sistema nervoso centrale e modelli di malattia, senza necessità di interventi chirurgici ripetuti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi fornendo prove dirette, dipendenti dall'attività, della connettività sinaptica tra popolazioni di neuroni geneticamente definite.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità e riduce la variabilità tecnica grazie all'espressione dipendente da Cre e controllata dal locus, eliminando le incongruenze legate alle iniezioni.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione nella selezione di bersagli del sistema nervoso centrale, consentendo una visualizzazione precoce degli effetti a livello di circuito derivanti da modulazioni genetiche o farmacologiche.
- Impatto sul portafoglio: Sostiene la progressione con rischio calibrato generando dati meccanicistici sulla formazione dei circuiti neurali, utili per la priorizzazione dei bersagli nelle indicazioni neurosviluppativi e psichiatriche.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in embriologia del topo, genotipizzazione e microscopia a fluorescenza per una corretta manipolazione degli embrioni, sezionamento e rilevamento del segnale.
- È subordinato alla disponibilità di linee con promotore Cre e sistemi reporter fluorescenti per l'etichettatura cellulare specifica e la validazione multimodale.
- Necessita di protocolli standardizzati di fissazione, criosezionamento e immunohistochimica per preservare il segnale del tracciante e garantire una qualità riproducibile dei tagli.
- L'adattamento ad altri sistemi modello dipende dalla conservazione della funzionalità del tracciante transsinaptico e della specificità del promotore in specie non murine.
- I limiti pratici includono la dipendenza dall'attività sinaptica per il trasferimento del tracciante, il che potrebbe influenzare la sensibilità nei circuiti a bassa attività o immaturi.
