Zebrafish Keratocyte espianti per studiare la migrazione delle cellule collettiva e riepitelizzazione in guarigione delle ferite cutanee

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire colture explan di cheratociti di zebrafish da utilizzare negli studi di migrazione cellulare collettiva e di guarigione delle ferite epiteliali. Ciò si ottiene rimuovendo prima le squame con tessuto epiteliale attaccato dal pesce zebra adulto anestetizzato. Le squame con il tessuto attaccato vengono poste in un piatto di coltura per consentire alle cellule di aderire.

Quindi viene aggiunto il terreno di coltura insieme a tutti i trattamenti indicati dal disegno sperimentale. Infine, le cellule vengono incubate e osservate al microscopio video per il periodo di tempo desiderato. In definitiva, è possibile utilizzare una varietà di saggi per dimostrare i cambiamenti nella migrazione o nella morfologia cellulare, nonché l'espressione di proteine o altri marcatori nel tempo.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente, come il metodo di coltura cellulare trasformata, è che le colture di espianti sono primarie, che si riassemblano strettamente alle proprietà della cellula in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della guarigione delle ferite epiteliali, come il ruolo della migrazione collettiva e della transizione da epiteliale a mesenchimale. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché le squame potrebbero non attaccarsi alla superficie di crescita o potrebbero non riuscire a crescere in un determinato piatto di coltura.

A dimostrare questa procedura saranno Jose Rap, studente di medicina PanIN, Chana TI e Agnes Pasquale, entrambi ricercatori senior associati nel mio laboratorio. Per prepararsi a questo esperimento, declorare circa 1,5 litri di acqua del rubinetto utilizzando un agente di declorazione commerciale o lasciando riposare l'acqua per 24 ore, quindi utilizzare 500 millilitri per riempire ciascuno dei tre becher da un litro. Etichettare un bicchiere per contenere il pesce prima di qualsiasi procedura e un secondo per il recupero al terzo bicchiere.

Aggiungere 100 microgrammi per millilitro di trica. Per anestetizzare i pesci, riempire una vaschetta poco profonda con ghiaccio. Scaldare il terreno di coltura a temperatura ambiente e raccogliere le pinzette pulite dei gioiellieri.

Pulire le pinzette immergendo le punte in etanolo al 70% e passandole attraverso un bruciatore bunsen, lasciando che l'etanolo si bruci. Catturare il numero desiderato di pesci e metterli in un bicchiere di contenimento. Trasferire un singolo pesce nel becher per anestesia.

Dopo aver anestetizzato il pesce secondo il protocollo di testo, trasferirlo nel ghiaccio e posizionarlo orizzontalmente con la coda rivolta verso la mano che tiene la pinzetta. Per rimuovere le squame, posizionare le pinzette parallelamente al pesce. Con la punta sul bordo di una squama, premere leggermente il lato piatto della pinzetta sul lato del pesce per far sollevare la squama dal corpo del pesce.

Usa le pinzette per afferrare la squama, quindi pizzicala e, senza capovolgerla, posizionala nel piatto di coltura dei tessuti. Ripetere la procedura, rimuovendo un massimo di 12 squame da un adulto di grandi dimensioni, evitando la regione branchiale, la linea laterale e le pinne. Metti il pesce nel bicchiere di recupero e monitoralo per assicurarti che si riprenda dagli effetti dell'anestesia.

Quindi trasferire il pesce in una vasca individuale e lasciare che il pesce si riprenda per 21 giorni per consentire la completa rigenerazione della squama. A seconda dell'esperimento, posiziona fino a 20 bilance per plastica. Piatto trattato con coltura tissutale da 35 millimetri o da quattro a sei scale per bicchiere.

Piatto inferiore, lasciare che le squame aderiscano al piatto prima di aggiungere delicatamente 1,2 millilitri di terreno completo a ciascun piatto di coltura. Incubare le colture X explan a 28 gradi Celsius per il periodo di tempo desiderato con o senza trattamento per eseguire la microscopia. Dopo aver rimosso un piatto contenente fogli di cellule dall'incubatore, posizionarlo nel tavolino del microscopio.

Usa un obiettivo quattro volte per mettere a fuoco inizialmente per facilitare lo scatto dell'immagine nel tempo. Segna la posizione di ogni foglio di celle e/o l'orientamento del piatto sul tavolino. Fotografare i fogli cellulari in vari punti temporali secondo il protocollo sperimentale e, se sono necessarie solo immagini fisse per l'esperimento, rimetterli nell'incubatore.

Per fissare i campioni per la microscopia a immunofluorescenza, preparare e preriscaldare le soluzioni a temperatura ambiente. Per visualizzare i siti OSE sotto fluorescenza, utilizzare piastre di coltura con fondo in vetro da 35 millimetri per coltivare melanzane come descritto in precedenza in questo video, senza rimuovere il terreno di coltura, aggiungere 0,8 millilitri di paraldeide al 4% in 1,1 XPBS a ciascuna piastra. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.

Quindi aspirare la soluzione. Aggiungere altri 0,8 millilitri di fissativo a ciascun piatto e, dopo una seconda incubazione di cinque minuti, aspirare la soluzione. A meno che non si utilizzino ligandi o epitopi esterni, permeare le cellule aggiungendo 0,5 millilitri di TRITTON X 100 allo 0,2% in un'incubazione XPBS per cinque minuti.

Prima di rimuovere la soluzione, aggiungere 0,5 millilitri di 1%BSA in un XPBS e incubare a temperatura ambiente per un'ora o a quattro gradi Celsius durante la notte dopo l'incubazione, aspirare la soluzione e procedere con la colorazione degli anticorpi. In alternativa, aggiungere uno o due millilitri di 1% BSA in un XPBS e conservare a quattro gradi Celsius per tre o quattro settimane. Eseguire l'immunofluorescenza.

Secondo il protocollo di testo qui illustrato, si possono osservare fogli di cheratociti che migrano da sotto la scala entro poche ore dall'istituzione della coltura EXPLAN. Occasionalmente, si può osservare un cheratinocita che migra individualmente, che si è staccato dal foglio che migra collettivamente. La velocità iniziale di avanzamento del foglio è estremamente rapida, ma questa velocità rallenta rapidamente man mano che le cellule si diffondono durante le prime 48 ore di coltura.

Il rapido aumento non è associato alla proliferazione cellulare poiché dopo la marcatura per 24 ore con l'EDU fluorescente, circa il 10% delle cellule mostra evidenza di divisione cellulare a un tasso di gran lunga inferiore a quello osservato nelle linee cellulari trasformate. Quando il trattamento viene aggiunto nel momento in cui X explan sono stabiliti, alcuni composti alterano la migrazione cellulare collettiva. Ad esempio, come mostrato qui, alcuni inibitori delle MMP riducono l'area del foglio cellulare dopo 24 ore.

In coltura, quando il peptide solubile contenente RGD viene aggiunto al terreno di coltura per interrompere la formazione di adesione, la zoppia sul bordo anteriore del foglio si restringe rapidamente e successivamente il bordo anteriore del foglio si stacca e si ritrae e meno di due minuti per valutare la localizzazione delle proteine all'interno del foglio o all'interno di litri e cellule follower, L'intero foglio può essere fissato e colorato come mostrato in questa figura. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 10-15 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di aggiungere il terreno di coltura preriscaldato solo dopo aver lasciato il tempo ai citi di aderire al piatto di coltura Seguendo questa procedura.

Altri metodi come la QPCR possono essere eseguiti per rispondere a qualsiasi domanda aggiuntiva, come i cambiamenti nell'espressione genica in relazione al tempo e/o alle condizioni del trattamento. Dopo aver osservato questa procedura, si dovrebbe avere un'idea molto migliore di come stabilire le impostazioni cultura explan dell'IDE per l'uso in una varietà di procedure.