Una guida per generazione e l'uso hiPSC NPC derivati ​​per lo Studio delle Malattie Neurologiche

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare cellule neuro progenitrici o NPC da cellule staminali pluripotenti indotte umane o PSC alte come piattaforma per studiare i meccanismi cellulari e molecolari che contribuiscono alle malattie neurologiche. Ciò si ottiene differenziando prima le PSC alte utilizzando doppi inibitori di smad in rosette neurali. Il secondo passo consiste nel raccogliere queste rosette neurali e consentire loro di crescere in popolazioni di N PC espandibili.

Successiva trasduzione lentivirale con un'infezione da spin. Il passo per migliorare l'efficienza viene utilizzato per manipolare l'espressione genica. Il passo finale è quello di far crescere gli NPC in sospensione in modo che formino spontaneamente le neurosfere.

In definitiva, questa piattaforma può essere utilizzata per analizzare una varietà di fenotipi cellulari. Ad esempio, misurando l'effetto della manipolazione genetica sulla neuromigrazione. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sui meccanismi cellulari come la migrazione.

Può anche essere applicato per studiare altri processi biologici come la replicazione, lo stress ossidativo, l'apoptosi e la crescita dei neuriti. La differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo o di PSC elevate porta alla formazione di rosette neurali visibili, che sono caratterizzate come cluster rotondi di cellule neuroepiteliali con polarità basale aico per la selezione enzimatica delle rosette neurali al giorno 14. Aspirare i terreni dai corpi embrionali aderiti o ebs e aggiungere un millilitro di reagente di selezione del roset neurale per pozzetto di una piastra a sei pozzetti, incubare a 37 gradi Celsius per un'ora.

Dopo un'ora. Utilizzare un pipettatore P 1000 per rimuovere delicatamente l'enzima da ciascun pozzetto e aggiungere un millilitro di D-M-E-M-F 12 per pozzetto. Per lavare le rosette, raccogliere il millilitro di D-M-E-M-F 12 ed espellerlo velocemente nuovamente nella vasca, staccando così le rosette dalla piastra.

Raccogli le rosette in una provetta di falco, pipetta un altro millilitro di D-M-E-M-F 12 ed espellelo rapidamente nello stesso pozzetto per staccare le rosette rimanenti. Non tri e cerca di non rompere gli aggregati della rosetta. Raccogli le rosette neurali nello stesso tubo del falco.

È possibile aggiungere più enzima e ripetere questa procedura se le rosette non si staccano facilmente quando tutte le rosette neurali sono state raccolte. Centrifugare il tubo Falcon a 300 g per tre minuti. Aspirare il lavaggio e risus.

Sospendi le rosette in due millilitri di terreno cellulare progenitore neurale. Trasferisci le cellule in una piastra a sei pareti rivestita di laminato di poli L ornitina e cresci a 37 gradi Celsius per una settimana. In questo laboratorio, le cellule progenitrici neurali o NPC vengono coltivate su piastre matrigel, alimentate ogni due giorni e mantenute ad una densità molto elevata.

Per dividere gli NPC, aspirare prima il terreno e poi aggiungere un millilitro di accutane caldo per pozzetto di una piastra a sei pozzetti, incubare a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. Trasferire delicatamente le cellule staccate in una provetta da 15 millilitri contenente D-M-E-M-F 12 con il minor stress meccanico possibile. Non tritrare le cellule mentre si trovano nell'enzima pellettare le cellule centrifugando a 1000 G per cinque minuti dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere gli NPC.

In circa un millilitro di terreno NPC per pozzetto originale di una piastra a sei pozzetti, si prevede da cinque a 10 milioni di cellule per pozzetto confluente di una piastra a sei pozzetti dopo la risospensione e il conteggio delle cellule. Sostituire le NPC con una piastra di circa 1-2 milioni di cellule per pozzetto di una piastra a sei pozzetti per mantenere le NPC. L'efficienza della formazione delle neurosfere varia tra l'esperimento e le linee cellulari, ma di solito si verifica meglio se tra 200, 000 e un milione di cellule sono posizionate per pozzetto di una piastra non aderente a sei pareti se si verifica un aggregamento, ridurre il numero di cellule posizionate idealmente entro uno o due giorni dalla scissione.

Le NPC NP devono essere trasdotte con vettori lentivirali o retrovirali per aumentare la percentuale di cellule trasfettate. Usa l'infezione da spin. Aspirare il terreno da ciascun pozzetto e sostituirlo con la relativa sovraespressione o di controllo lentivirus o retrovirus titolati alla moltiplicazione desiderata di infezione diluita.

In terreni NPC Utilizzare 1,5 millilitri per pozzetto di una centrifuga a sei pozzetti a 1000 G e temperatura ambiente per un'ora in una centrifuga a piastre. Dopo la centrifuga, riposizionare la piastra nell'incubatrice per ridurre la morte cellulare. Sostituire il supporto entro otto ore dall'infezione da spin

Inizia questa procedura lavando una volta le NEUROSFERE derivate da NPC in terreni NPC per rimuovere i detriti cellulari. Inclinare la piastra con un angolo di 45 gradi e lasciare che le neurosfere si depositino, quindi rimuovere quanto più terreno possibile senza aspirare le neurosfere. Sostituire con un nuovo supporto.

Successivamente, prelevare manualmente le NEUROSFERE derivate da NPC al microscopio utilizzando una pipetta P 200 e trasferire una sfera di neuros in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti rivestita di matrigel. È importante scegliere neurosfere di dimensioni simili per ridurre la variabilità dei risultati. Aggiungere altri 0,5 milligrammi di gel matri diluito in terreni NPC freddi alle neurosfere in ciascuna piastra a 96 pozzetti.

Utilizzando manualmente la punta di una pipetta, centrare manualmente ogni singola sfera neurologica al centro del pozzetto, consentire la migrazione della sfera neurologica per 48 ore. Dopo aver fissato e colorato le cellule con i marcatori immunoistochimici desiderati, fotografare le neurosfere nella loro interezza utilizzando un obiettivo per microscopio Forex. Per misurare la migrazione radiale, utilizzare il software J dell'immagine.

Usa lo strumento di selezione a mano libera per tracciare manualmente il bordo delle celle in migrazione più lontane. Assicurati che l'area sia selezionata nella finestra di impostazione delle misure che si trova nella scheda Analizza. E poi usa la funzione di misura per calcolare l'area della forma risultante.

Usa il valore della misura dell'area e l'equazione per l'area di un cerchio per determinare il raggio esterno allo stesso modo, traccia il bordo della sfera neuros originale. Misura l'area e calcola il raggio interno. Calcola la migrazione radiale totale come la differenza tra il raggio esterno e quello interno.

Queste immagini mostrano gli stadi di differenziazione neurale di PSC elevata da PSC elevate a corpi embrionali, rosette neurali, NPC e neuroni convalidati NPCs esprimono, l'annidamento del marcatore NPC e il fattore di trascrizione delle cellule staminali neurali SOX due nella maggior parte delle cellule. La colorazione con tubulina beta tre è visibile anche in tutte le popolazioni di NPC. Le NPC esprimono anche il fattore di trascrizione delle cellule staminali neurali PAC 6 e il marcatore progenitore delle quattro cervelloni.

TBR due, ma non i marcatori del mesencefalo come LMX uno A e FOX A due NPC possono differenziare dal 70 all'80% di beta tre neuroni positivi alla tubulina mostrati in verde e dal 20 al 30% di astrociti positivi alla proteina fibrillare gliale mostrati in rosso, PSC alta di alta qualità. Le NPC esprimono nestone e SOX due nella maggior parte delle cellule, mentre le NPC di bassa qualità hanno chiazze di SOX due negative e nidificano solo nelle cellule negative. I neuroni di quattro settimane che si differenziano dagli NPC di alta qualità esprimono la mappa due AB e la beta tre turbolenta.

A seguito di trasduzione riuscita con un vettore lentivirale o retrovirale ad alto titolo. Più dell'80% delle cellule viene marcato dal reporter fluorescente. Inclusa nella generazione di neurosfere vettoriali si ottiene una popolazione di neurosfere di dimensioni relativamente omogenee, che possono rimanere sane in coltura per circa una settimana.

Con l'alimentazione regolare, la migrazione delle neurosfere avviene in modo robusto nelle neurosfere sane, come illustrato da queste immagini in campo chiaro prima e dopo 48 ore di migrazione in matrigel dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della schizofrenia per esplorare la neuromigrazione nelle NPC derivate da cellule staminali ponenti PL indotte dall'uomo. Non dimenticare che lavorare con un retrovirus può essere potenzialmente pericoloso e tutto il lavoro di coltura tissutale dovrebbe essere svolto in condizioni di BL due più quando il virus è potenzialmente presente.