Una guida per generazione e l'uso hiPSC NPC derivati ​​per lo Studio delle Malattie Neurologiche

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule progenitrici neurali o NPC da cellule staminali pluripotenti indotte umane, o hPSC, come piattaforma per studiare i meccanismi cellulari e molecolari che contribuiscono alle malattie neurologiche. Ciò viene ottenuto innanzitutto differenziando le hPSC mediante inibitori duali di Smad in rosette neurali. Il secondo passaggio consiste nel raccogliere queste rosette neurali e consentire loro di svilupparsi in popolazioni espandibili di NPC.

Successiva trasduzione lentivirale con un'infezione mediante centrifugazione. Questo passaggio, volto a migliorare l'efficienza, viene utilizzato per manipolare l'espressione genica. L'ultimo passaggio consiste nel coltivare le NPC in sospensione in modo che formino spontaneamente neurosfere.

Infine, questa piattaforma può essere utilizzata per saggare una varietà di fenotipi cellulari. Ad esempio, misurare l'effetto della manipolazione genetica sulla neuro-migrazione. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui meccanismi cellulari come la migrazione.

È possibile applicarlo anche allo studio di altri processi biologici come la replicazione, lo stress ossidativo, l'apoptosi e l'allungamento dei neuriti. La differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule umane o di PSC elevate porta alla formazione di rosette neurali visibili, caratterizzate come aggregati rotondi di cellule neuroepiteliali con polarità apicobasale, per la selezione enzimatica delle rosette neurali al giorno 14. Aspirare il mezzo dai corpi embrionali aderenti o dagli EB e aggiungere un millilitro di reagente di selezione per rosette neurali per ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti, quindi incubare a 37 gradi Celsius per un'ora.

Dopo un'ora, utilizzare una pipetta P1000 per rimuovere delicatamente l'enzima da ogni pozzetto e aggiungere un millilitro di D-M-E-M-F12 per pozzetto. Per lavare le rosette, raccogliere il millilitro di D-M-E-M-F12 e riespellerlo rapidamente nel pozzetto, staccando così le rosette dalla piastra.

Raccogliere le rosette in una provetta falcon. Pipettare un altro millilitro di D-M-E-M-F 12 ed espellerlo rapidamente nella stessa pozzetta per staccare le rosette rimanenti. Non provare e cercare di non frammentare gli aggregati di rosette. Raccogliere le rosette neurali nella stessa provetta falcon.

Se le rosette non si staccano facilmente dopo aver raccolto tutte le rosette neurali, è possibile aggiungere ulteriore enzima e ripetere questa procedura. Centrifugare il tubo Falcon a 300 G per tre minuti. Aspirare il liquido di lavaggio e risospendere.

Sospendere le rosette in due millilitri di mezzo per cellule progenitrici neurali. Trasferire le cellule in una piastra a sei pozzetti rivestita con poli-L-ornitina laminata e coltivare a 37 gradi Celsius per una settimana. In questo laboratorio, le cellule progenitrici neurali, o NPC, vengono coltivate su piastre con matrigel, alimentate ogni due giorni e mantenute a densità molto elevata.

Per separare le NPC, aspirare prima il mezzo e quindi aggiungere un millilitro di accutase caldo per ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti, incubando a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. Trasferire delicatamente le cellule staccate in un tubo da 15 millilitri contenente D-M-E-M-F 12, usando il minimo stress meccanico possibile. Non tritare le cellule durante questa fase. Pellettizzare le cellule centrifugando a 1000 ×g per cinque minuti; dopo la centrifugazione, aspirare il soprannatante e risospendere le NPC.

In circa un millilitro di mezzo NPC per ogni pozzetto originale di una piastra a sei pozzetti, ci si aspetta che ogni pozzetto confluenziale contenga da cinque a dieci milioni di cellule dopo la risospensione e il conteggio cellulare. Ripiastrellare i NPC con circa uno-due milioni di cellule per pozzetto di una piastra a sei pozzetti per mantenere i NPC. L'efficienza di formazione dei neurosfere varia in base all'esperimento e alle linee cellulari, ma di solito si ottiene il risultato migliore se vengono seminate tra 200.000 e un milione di cellule per pozzetto in una piastra non aderente a sei pozzetti; se si verificano agglomerati, ridurre il numero di cellule seminate. Idealmente, entro uno-due giorni dal passaggio.

I NPC NP devono essere trasdotti con vettori lentivirali o retrovirali per aumentare la percentuale di cellule transfezionate. Utilizzare l'infezione mediante centrifugazione. Aspirare il mezzo da ogni pozzetto e sostituirlo con i rispettivi lentivirus o retrovirus di controllo o di sovraespressione, titolati alla multiplicità di infezione desiderata e diluiti.

Nel mezzo NPC, utilizzare 1,5 millilitri per pozzetto di una piastra a sei pozzetti, centrifugare a 1000 ×g e a temperatura ambiente per un'ora in una centrifuga per piastre. Dopo la centrifugazione, riposizionare la piastra nell'incubatore per ridurre la morte cellulare. Sostituire il mezzo entro otto ore dall'infezione mediante centrifugazione.

Iniziare questa procedura lavando una volta gli NEUROSFERE derivati da NPC nel mezzo per NPC per rimuovere i detriti cellulari. Inclinare la piastra a un angolo di 45 gradi e lasciare sedimentare le neurosfere, quindi rimuovere la maggior quantità possibile di mezzo senza aspirare le neurosfere. Sostituire con mezzo fresco.

Successivamente, selezionare manualmente le SFERE NEURALI derivate da NPC al microscopio utilizzando una pipetta P200, trasferendo una sfera neurale in ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti rivestita con matrigel. È importante selezionare sfere neurali di dimensioni simili per ridurre la variabilità dei risultati. Aggiungere ulteriori 0,5 milligrammi di matrigel diluiti in mezzo NPC freddo alle sfere neurali in ogni piastra da 96 pozzetti.

Utilizzando manualmente la punta di una pipetta, posizionare al centro di ogni pozzetto ciascun neurosfera individualmente. Lasciare che la migrazione della neurosfera avvenga per 48 ore. Dopo la fissazione e la colorazione delle cellule con i marcatori immunoistochimici desiderati, fotografare interamente le neurosfere utilizzando un obiettivo microscopico Forex. Per misurare la migrazione radiale, utilizzare il software ImageJ.

Utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per tracciare manualmente il bordo delle cellule che si sono spostate più lontano. Assicurarsi che l'area sia selezionata nella finestra di impostazione delle misurazioni, accessibile tramite la scheda analizza. Successivamente, utilizzare la funzione di misurazione per calcolare l'area della forma risultante.

Utilizzare il valore della misurazione dell'area e l'equazione dell'area di un cerchio per determinare il raggio esterno nello stesso modo, tracciando il bordo della neurosfera originale. Misurare l'area e calcolare il raggio interno. Calcolare la migrazione radiale totale come differenza tra i raggi esterno e interno.

Queste immagini mostrano le fasi della differenziazione neurale ad alta percentuale di PSC, dalle PSC agli embriocorpi, alle rose neurali, alle NPC e ai neuroni. Le NPC validate esprimono il marcatore delle NPC nesting e il fattore di trascrizione delle cellule staminali neurali SOX2 nella maggior parte delle cellule. La colorazione per la beta3-tubulina è inoltre visibile in tutte le popolazioni di NPC. Le NPC esprimono anche il fattore di trascrizione delle cellule staminali neurali PAC6 e il marcatore dei progenitori del quarto cervello.

TBR2, ma non marcatori del mesencefalo come LMX1A e FOXA2, le NPC possono differenziarsi in neuroni positivi per la beta3-tubulina, mostrati in verde, al 70-80% e in astrociti positivi per la proteina acida fibrillare gliale, mostrati in rosso, al 20-30%, a partire da PSC di alta qualità. Le NPC esprimono nestina e SOX2 nella maggior parte delle cellule, mentre le NPC di bassa qualità presentano aree di cellule negative per SOX2 e negative per la nestina. I neuroni di quattro settimane differenziati da NPC di alta qualità esprimono MAP2AB e beta3-tubulina.

Dopo una trasduzione avvenuta con successo mediante un vettore lentivirale o retrovirale ad alto titolo, oltre l'80% delle cellule risulta etichettato dal reporter fluorescente. L'inclusione del vettore nella generazione di neurosfere produce una popolazione di neurosfere di dimensioni relativamente omogenee, che possono mantenersi vitali in coltura per circa una settimana.

Con un'alimentazione regolare, la migrazione della neurosfera avviene in modo robusto nelle neurosfere sane, come illustrato da queste immagini in campo chiaro prima e dopo 48 ore di migrazione in Matrigel dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della schizofrenia per esplorare la migrazione neuronale in cellule progenitrici neurali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane. Non dimenticare che lavorare con un retrovirus può essere potenzialmente pericoloso e tutti i lavori di coltura tissutale devono essere eseguiti in condizioni di livello di biosicurezza 2 più quando è potenzialmente presente il virus.