Manipolazione e In Vitro Maturazione di Xenopus laevis ovociti, seguito da Iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi, per studiare lo sviluppo embrionale

Lo scopo del seguente esperimento è quello di abbattere le proteine materne immagazzinate negli ovociti o sovraesprimere le proteine di interesse al punto di fecondazione delle uova di rana. Ciò si ottiene iniettando oligo antisenso o mRNA in ovociti immaturi enzimaticamente deregolati per degradare o sovraesprimere una proteina specifica. In una seconda fase, gli ovociti vengono trasferiti in un terreno contenente progesterone, che induce la maturazione degli ovociti in ovuli.

Successivamente, lo spermatozoo viene iniettato negli ovuli maturi in vitro per osservare l'effetto del knockdown o della sovraespressione sullo sviluppo embrionale. In definitiva, lo sviluppo di ovociti oligoiniettati nei girini nuotatori è il test funzionale del knockdown o della sovraespressione genica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai vasi esistenti come l'ospite per il trasferimento, è che possiamo saltare il processo di chirurgia della rana utilizzando protocolli standard.

Raccogli un'opera su SAC contenente citi sani in una capsula di Petro di nove centimetri contenente MBS più ps. Quindi separare l'ovaia in pezzi quadrati larghi uno o due centimetri. Raccogli circa cinque millilitri dell'ovaio strappato con i citi in una nuova provetta da 50 millilitri.

Quindi sciacquare i fazzoletti con MBS plus PS alcune volte e raccogliere gli ovuli in 15 millilitri di MBS plus ps fresco. Ora, aggiungere sette unità di enzima di defogliazione alla sospensione e incubare la sospensione con una vegetazione delicata fino a quando non sono almeno parzialmente defogliate. Questo richiederà almeno un'ora dopo l'incubazione.

Riempire il tubo con MBS plus Ps per fermare la reazione. Tirare la soluzione sulla parete del tubo e non direttamente sui citi. Lascia che i tessuti si depositino e scarta la zuppa e l'agente.

I piccoli citi immaturi galleggeranno e dovrebbero anche essere scartati. Ripetere questo passaggio di lavaggio per un totale di 10 volte dopo i lavaggi. Trasferire i citi in un piatto di nove centimetri con MBS plus ps.

Trasferire la capsula in un microscopio da dissezione e da qui in poi, mantenere i citi a una temperatura compresa tra 16 e 18 gradi Celsius il più possibile. Selezionare i citi di sesto stadio di buona qualità utilizzando la classificazione Dumont utilizzando una pipetta di vetro, raccoglierli in una nuova piastra con MBS più ps. Il cito di buona qualità dovrebbe avere una pigmentazione uniforme nell'emisfero animale e mostrare una netta separazione tra l'emisfero animale e quello vegetale.

Dovrebbero anche essere tutti della stessa dimensione, che sarebbe compresa tra 1,2 e 1,4 millimetri di diametro. Raccogli da due a 300 citi per ogni iniezione, per un totale di circa 1000 citi per esperimento. La qualità del sito O è la chiave del successo.

Se l'Oside mostra qualche anomalia durante la preparazione, ti consiglio di correggere un'ovaia di un altro gregge e ricominciare. In preparazione all'iniezione dell'oligo antisenso, posizionare lo stantuffo metallico di un microiniettore nella posizione più bassa e inserire un capillare di vetro riempito d'olio sullo stantuffo metallico. Sotto un microscopio da dissezione, tagliare la punta dell'ago usando piccole forbici chirurgiche.

Fai una punta più piccola possibile. Prossimo laser. Una striscia di paraforma sul tavolino del microscopio e su di essa erogare tre microlitri di soluzione di acido nucleico a un microgrammo per microlitro.

Con questo, riempi la punta dell'ago. Se l'aria viene intrappolata, l'apertura deve essere ingrandita. Ora fai un segno visibile sull'ago per iniezione a circa mezzo millimetro dalla punta.

Quindi procedi con l'iniezione dei citi per iniettarne uno prima, trova un'area priva di cellule follicolari in cui l'ago può penetrare in quest'area. Inserire la punta lungo il bordo equatoriale puntando al punto centrale sotto la vescicola germinale. Allo stesso tempo, stabilizzare il cita con una pinza sul lato opposto.

Ora utilizzando il comando a pedale, espellere la soluzione, espellere tra 4,6 e 9,2 nanogrammi di oligo antisenso o tra 250 picogrammi e 13,8 nanogrammi di RNA messaggero. Dopo aver iniettato tutti i citi, trasferirli nel terreno di incubazione e lasciarli incubare per alcuni giorni in modo che possano avvenire dei cambiamenti. Nel proteasoma.

Successivamente, trasferire i citi con una quantità minima di terreno in piatti rivestiti di agros di sei centimetri contenenti da cinque a otto millilitri di terreno di maturazione. Quindi lasciare che i citi si sviluppino in questo terreno per 16 ore prima di iniettarli con lo sperma. Per questo protocollo, è necessario preparare lo stock di sperma congelato.

Consultare il protocollo del testo dopo 16 ore di incubazione per la maturazione. Trasferisci con molta attenzione i citi in un piatto di sei centimetri ricoperto di uova grossolane con MBS più PS per lavarli via. Se i citi vengono maneggiati male, possono attivarsi spontaneamente prima dell'ixy.

Ora, conta i citi maturi e cerca le macchie bianche che indicano che la vescicola germinale del cita si è rotta. Se meno dell'80% è buono, collettivamente non è abbastanza sano da sopravvivere alla procedura ixy. Procedere.

Riempire una nuova piastra con il mezzo di iniezione e trasferire delicatamente tutti i citi nella piastra dopo mezz'ora. Procedere con l'iniezione dei citi maturi con la soluzione di sperma utilizzando la stessa preparazione iniettiva descritta per gli oligo. Idealmente, ci dovrebbero essere uno o due spermatozoi per 4,6 nanolitri nella soluzione iniettabile.

Per testare questa soluzione iniettabile, fare gocce di soluzione DPI a 0,3 microgrammi DPI per millilitro e iniettare 4,6 nanolitri in quelle gocce. Quindi contare il numero di spermatozoi in ogni goccia mediante microscopia a fluorescenza. Dopo aver confermato la concentrazione di spermatozoi, iniettare i citi con 4,6 nanolitri di soluzione di spermatozoi.

Assicurarsi che il tempo necessario per iniettare le soluzioni rimanga costante e iniettare gli ovociti in modo costante con pause minime tra le iniezioni. Dopo ogni 100 iniezioni di scambio, la soluzione di sperma. Dopo che tutti gli ovociti maturi sono stati iniettati, la piastra deve essere incubata per quattro o cinque ore, quindi ispezionata.

Per gli embrioni che hanno subito la scissione, i solchi di scissione potrebbero non essere così chiari come quelli dei normali embrioni fecondati: trasferire tutti gli embrioni tagliati in un terreno di incubazione e lasciarli incubare durante la notte. Il giorno successivo, gli embrioni sopravvissuti dovrebbero essere trasferiti allo sviluppo embrionale 0,1 XMMR di embrioni ixy. Utilizzando ovociti maturati in vitro è stato esaminato in buoni esperimenti, quasi il 100% degli ovociti delle vescicole germinali ha risposto al progesterone e ha mostrato segni di maturazione.

Circa il 25% ha subito la scissione. Il 60-80% degli embrioni scissi ha raggiunto lo stadio di blast gast e circa un terzo di questi ha raggiunto lo stadio di girino che nuotava. Gli embrioni ixy erano una miscela di embrioni normali e anormali che dimostravano che l'iniezione del sogo antisenso nei citi vecali germinali, seguita da IVM e Dixie, consentiva uno sviluppo embrionale precoce.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come manipolare le proteine materne prima della fattorizzazione.