Manipolazione e

Lo scopo del seguente esperimento è ridurre le proteine materne accumulate negli oociti o sovraesprimere proteine di interesse al momento della fecondazione delle uova di rana. Questo viene ottenuto iniettando oligonucleotidi antisenso o mRNA in oociti immaturi deregolati enzimaticamente, al fine di degradare o sovraesprimere una proteina specifica. Come secondo passaggio, gli oociti vengono trasferiti in un mezzo contenente progesterone, che induce la maturazione degli oociti in uova.

Successivamente, lo sperma viene iniettato nelle uova matured in vitro al fine di osservare l'effetto dell'abbattimento o della sovraespressione sullo sviluppo embrionale. In definitiva, lo sviluppo delle oociti iniettate con oligonucleotidi fino a girini nuotanti rappresenta il test funzionale dell'abbattimento o della sovraespressione genica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il trasferimento nell'ospite, è che possiamo evitare il processo chirurgico sulle rane utilizzando protocolli standard.

Raccogliere un opus su SAC contenente citi sani in una piastra di Petri da nove centimetri contenente MBS più ps. Quindi sminuzzare l'ovaio in pezzi quadrati larghi da uno a due centimetri. Raccogliere circa cinque millilitri dell'ovaio lacerato con i citi in un nuovo tubo da 50 millilitri.

Quindi risciacquare i tessuti con MBS più PS per alcune volte e raccogliere le uova in 15 millilitri di MBS fresco più ps. Ora, aggiungere sette unità di enzima defoliazione alla sospensione e incubare la sospensione con agitazione delicata fino a quando non risultino almeno parzialmente defogliati. Questo richiederà almeno un'ora dopo l'incubazione.

Riempire il tubo con MBS più Ps per arrestare la reazione. Versare la soluzione sulla parete del tubo e non direttamente sui citi. Lasciare sedimentare i tessuti e scartare il liquido e l'agente.

I citi piccoli e immaturi galleggeranno e devono essere scartati. Ripetere questo passaggio di lavaggio un totale di 10 volte dopo i lavaggi. Trasferire i citi in una piastra da nove centimetri con MBS più ps.

Trasferire la piastra su un microscopio stereoscopico e, da questo momento in avanti, mantenere i citi a una temperatura compresa tra 16 e 18 gradi Celsius per quanto possibile. Selezionare i citi di buona qualità allo stadio sei utilizzando la classificazione di Dumont mediante una pipetta di vetro, raccoglierli in una nuova piastra con MBS più ps. Un cito di buona qualità deve presentare una pigmentazione uniforme nell'emisfero animale e mostrare una chiara separazione tra l'emisfero animale e quello vegetale.

Dovrebbero inoltre essere tutti di dimensioni simili, comprese tra 1,2 e 1,4 millimetri di diametro. Raccogliere circa da due a 300 cellule per ogni iniezione, per un totale di circa 1000 cellule per esperimento. La qualità del sito O è fondamentale per il successo.

Se l'ovide presenta delle anomalie durante il preparato, consiglio di correggere un ovaio proveniente da un altro gruppo e ricominciare. In preparazione all'iniezione dell'oligonucleotide antisenso, posizionare lo stantuffo metallico di un microiniettore nella posizione più bassa ed inserire una capillare di vetro riempita di olio sullo stantuffo metallico. Sotto un microscopio stereoscopico, tagliare la punta dell'ago utilizzando piccole forbici chirurgiche.

Realizzare una punta il più piccola possibile. Successivo laser. Posizionare una striscia di paraform sulla piastra del microscopio e depositarvi sopra tre microlitri di soluzione di acido nucleico a un microgrammo per microlitro.

Con questo, riempire la punta dell'ago. Se viene intrappolata aria, l'apertura dovrebbe essere allargata. Ora fare un segno visibile sull'ago di iniezione a circa mezzo millimetro dalla punta.

Quindi procedere con l'iniezione delle cellule, iniettandone innanzitutto una singola, individuando un'area priva di cellule follicolari attraverso la quale l'ago possa penetrare. Inserire la punta lungo il confine equatoriale puntando verso il punto centrale al di sotto della vescicola germinale. Allo stesso tempo, stabilizzare la cellula con una pinzetta sul lato opposto.

Ora, utilizzando il controllo a pedale, espellere la soluzione, iniettando tra 4,6 e 9,2 nanogrammi di oligonucleotidi antisenso o tra 250 picogrammi e 13,8 nanogrammi di RNA messaggero. Dopo aver iniettato tutte le cellule, trasferirle nel mezzo di incubazione e lasciarle incubare per alcuni giorni in modo che possano verificarsi dei cambiamenti. Nel proteasoma.

In seguito, trasferire le cellule con una quantità minima di mezzo in piatti da sei centimetri rivestiti con agros e contenenti da cinque a otto millilitri di mezzo di maturazione. Lasciare quindi sviluppare le cellule in questo mezzo per 16 ore prima di iniettarle con spermatozoi. Per questo protocollo, è necessario preparare una riserva di spermatozoi congelati.

Consultare il protocollo scritto dopo 16 ore di incubazione per la maturazione. Trasferire con molta attenzione i citi in una piastra da sei centimetri rivestita con uovo intero in MBS più PS per lavarli via. Se i citi vengono manipolati in modo improprio, potrebbero attivarsi spontaneamente prima dell'ixy.

Ora, conta i citi maturati e cerca macchie bianche che indicano la rottura del vescicolo germinale del cite. Se meno dell'80% è buono, nel complesso non sono abbastanza sani da sopravvivere alla procedura ixy. Per procedere.

Riempire una nuova piastra con il mezzo di iniezione e trasferire delicatamente tutti i citi nella piastra dopo mezz'ora. Procedere con l'iniezione dei citi maturi con soluzione di sperma utilizzando la stessa preparazione dell'iniettore descritta per gli oligos. Idealmente, dovrebbe esserci uno o due spermatozoi per ogni 4,6 nanolitri nella soluzione di iniezione.

Per testare questa soluzione di iniezione, preparare gocce di soluzione DPI a 0,3 microgrammi di DPI per millilitro e iniettare 4,6 nanolitri in ciascuna goccia. Quindi contare il numero di spermatozoi in ogni goccia mediante microscopia a fluorescenza. Dopo aver confermato la concentrazione di spermatozoi, iniettare le cellule con 4,6 nanolitri della soluzione di spermatozoi.

Assicurarsi che il tempo necessario per iniettare le soluzioni rimanga costante e iniettare gli oociti in modo regolare, con pause minime tra un'iniezione e l'altra. Dopo ogni 100 iniezioni, sostituire la soluzione di spermatozoi. Una volta iniettati tutti gli oociti maturati, la piastra deve essere incubata per quattro o cinque ore, quindi ispezionata.

Per gli embrioni che hanno subito la segmentazione, le solcature di segmentazione potrebbero non essere chiare come quelle degli embrioni fertilizzati normali; trasferire tutti gli embrioni segmentati nel mezzo di incubazione e lasciarli incubare per tutta la notte. Il giorno successivo, gli embrioni sopravvissuti devono essere trasferiti nel mezzo di sviluppo embrionale 0,1 XMMR per embrioni ixy. L'uso di ovociti maturati in vitro è stato esaminato in esperimenti accurati, in cui quasi il 100% degli ovociti con vescicola germinale ha risposto alla progesterone e ha mostrato segni di maturazione.

Circa il 25% ha subito la segmentazione. Dal 60 all'80% degli embrioni segmentati ha raggiunto lo stadio di blastagaste, e circa un terzo di questi ha raggiunto lo stadio di girino nuotante. Gli embrioni ixy erano una miscela di embrioni sia normali che anomali, dimostrando che l'iniezione dell'oligonucleotide antisenso sogo in cellule germinali veicolate, seguita da IVM e Dixie, ha permesso lo sviluppo embrionale precoce.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come manipolare le proteine materne prima della fattorizzazione.