Name: Manipolazione e In Vitro Maturazione di Xenopus laevis ovociti, seguito da Iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi, per studiare lo sviluppo embrionale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Impara a manipolare e maturare ovociti di Xenopus laevis per studiare lo sviluppo embrionale. Questo metodo consente il knockdown di proteine materne e l'overespressione genica prima della fecondazione.

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Siamo grati ai membri del laboratorio Gurdon per l'utile discussione. K.M. è un ricercatore presso il Wolfson College ed è supportato dalla Herchel Smith Postdoctoral Fellowship e dalla Great Britain Sasakawa Foundation. Il laboratorio Gurdon è sostenuto da sovvenzioni del Wellcome Trust (RG69899) e MRC a J.B.G.

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<li>Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+Xenopus+oocytes+using+the+host+transfer+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis).</a> Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Sakane, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+multiple+and+paralogous+genes+in+Xenopus+laevis+using+two+pairs+of+transcription+activator-like+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases.</a> Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).</li>
<li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+RNA%2FCas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo qui i dettagli di un nuovo metodo per esaurire i fattori materni o iperespressione fattori esogeni prima della fecondazione. Questo sistema richiede due microiniezioni, ma salta la chirurgia di rane, utilizzato nel metodo di trasferimento ospitante 7,17. E &#39;ottimale per rimuovere il passo chirurgia rana in termini di cura degli animali. Inoltre, non dobbiamo prendere in considerazione per la qualità delle rane femminili accoglienza per gli esperimenti di trasferimento, il che significa che possiamo sbarazzarci di un fattore biologico che influenza il successo degli esperimenti. Pertanto in questo sistema la qualità degli ovociti ottenuti da rane PMSG-innescato è un importante fattore biologico che è fondamentale per gli esperimenti di successo. La qualità degli ovociti può essere giudicato dopo la raccolta di ovaio o dopo defolliculation. Se qualsiasi anomalia si osserva in queste fasi, è ottimale per raccogliere un&#39;altra ovaio da una nuova rana. Un altro punto in cui è possibile controllare la qualità degli ovociti è dopo la maturazione degli ovociti. Se meno di 80% di progesteronee-trattati ovociti mostrano segni di maturazione, non si può essere in grado di ottenere il numero sufficiente di embrioni per ulteriori analisi. L&#39;uso di defolliculation enzimatica anziché defolliculation manuale è anche un altro vantaggio di questo sistema per ridurre il lavoro necessario per defolliculation. Tuttavia, è ancora possibile che defolliculation manuale può dare uno sviluppo migliore del trattamento enzimatico. Come mostrato in Figura 3, quasi il 10% del maturato in vitro ovociti può raggiungere la fase di nuoto girino. Questi dati sono raccolti da 13 esperimenti indipendenti, compresi quelli riportati in 8 e nuovi esperimenti di iniezione. Metodo di trasferimento Host bisogno 75-150 ovociti in ogni trattamento per ottenere dati significativi dal 30-60% degli ovociti trasferiti può raggiungere la fase neurula 17. Il nostro metodo di solito inizia con 200-300 ovociti in ciascun gruppo sperimentale dal momento che circa il 40-60% degli embrioni spaccati può raggiungere ilfase risposta muscolare. Questi dati suggeriscono che entrambi i metodi supportano una velocità di sviluppo ragionevole. Finora abbiamo ottenuto 10 rane vive di controllo mRNA-iniezione e controllo antisenso ovociti oligo-iniettato con questa tecnica, che indica che questo approccio supporta lo sviluppo attraverso la metamorfosi. Il nostro metodo di manipolazione ovocita-ICSI offre l&#39;opportunità di verificare il ruolo dei fattori materni durante molto precoce dello sviluppo embrionale, subito dopo la fecondazione. Inoltre, la sovraespressione di fattori che modificano la cromatina prima della fecondazione può rendere possibile rimodellare la cromatina materna prima della fecondazione per comprendere gli stati cromatina materni necessari per lo sviluppo. Questa strategia può anche lavorare bene con gli attuali sistemi di editing gene come la trascrizione attivatore-like effettrici nucleasi (TALEN) 18,19 e CRISPR / CAS9 20,21 dal momento che questi può essere espresso anche prima della fecondazione. Pertanto, il nostro nuovo approccio ha un Potential da utilizzare per molte applicazioni in futuro.

Xenopus laevis è un diffuso, potente organismo modello per studiare lo sviluppo 1. Questo perché le uova di Xenopus sono insolitamente grande (circa 1,2-1,4 mm, in confronto alle controparti di mammifero essendo circa 0,1 mm) e abbondante. Le uova contengono componenti maternamente sintetizzati e conservati, che sono sufficienti per guidare lo sviluppo embrionale fino transizione a metà blastula (MBT, che si verificano nella fase 8-8.5 con 4.000-8.000 cellule). MBT è accompagnata da attivazione del genoma zygotic, che quindi produce prodotti genici embrionali che indirizzano un ulteriore sviluppo. Numerosi studi volti a identificare i fattori materni importanti per lo sviluppo. Molti studi si basano sulla iniezione di oligonucleotidi antisenso (oligonucleotidi) compresi oligonucleotidi morfolino in embrioni fecondati, nel qual caso la degradazione di proteine ​​materni può essere osservato nella fase gastrula 2-4. In alternativa, mRNA sono iniettati a em fecondatobryos a disturbare le funzioni del gene o di tracciare sorti di proteine ​​sovraespresse. Tuttavia, l&#39;iniezione in embrioni stadio unicellulare normalmente non influenza i livelli di espressione delle proteine ​​materne alle primissime fasi embrionali prima MBT. Heasman e Wylie stabilito il metodo di trasferimento dell&#39;host per superare questo problema 5. In loro metodo, gli ovociti defolliculated manualmente vengono iniettati con oligonucleotidi antisenso e trasferiti in femmine di accoglienza 6. Le proteine ​​sono inibiti prima della fecondazione in modo che i ruoli delle proteine ​​ha diminuito in sviluppo embrionale precoce possono essere esaminate. Questo metodo esaurimento materno ha portato all&#39;identificazione di numerosi ruoli di sviluppo uniche di proteine ​​materne, come rivisto in 7. In questo rapporto, abbiamo dettaglio il nostro metodo recentemente sviluppato, in cui è raggiunto l&#39;esaurimento materno o sovraespressione di mRNA prima della fecondazione, senza defolliculation manuale e trasferimento di accoglienza8. Defolliculation manuale richiede un sacco di tempo e di trasferimento di accoglienza spesso ha bisogno di tecniche abili e la licenza specifica per la chirurgia degli animali, ostacolando così l&#39;uso frequente del metodo di esaurimento materno. Defolliculation e trasferimento di accoglienza sono sostituite da defolliculation enzimatica 9,10 e iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI) 11-13, rispettivamente. ICSI alle uova è stato originariamente utilizzato per la produzione di rane transgeniche 12. Sperma ed embrionali nuclei sono stati trapiantati in in vitro ovociti maturati anfibi 11,14,15. Qui, dimostriamo il nostro metodo step-by-step per iniettare sperma al vitro ovociti maturati che sono stati pre-iniettato con oligonucleotidi antisenso o mRNA.

<table><tbody><tr><td>Gonadotropina sierica di cavalla incinta (PMSG)&nbsp;</td><td>MSD Animal Health</td><td>Vm 01708/4309</td><td>PMSG-Intervet 5000iu polvere e solvente per soluzione iniettabile</td></tr><tr><td>Etile 3-amminobenzoato metanosolfonato sale (MS222)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Per anestesia</td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>Per la defollicolazione degli ovociti. Negozio a -20&nbsp; &#176;C.</td></tr><tr><td>Drummond Nanoject</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-205/206</td><td>Per microiniezione</td></tr><tr><td>capillare in vetro&nbsp;</td><td>Laboratori Alpha</td><td>7" Drummond #3-000-203-G / XL</td><td>per</td></tr><tr><td>estrattore per micropipette per microiniezione&nbsp;</td><td>Strumento SUTTER</td><td>Modello D-97</td><td>Per microiniezione</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>Per in vitro maturazione e</td></tr><tr><td>provetta da centrifuga ultra-trasparente ICSI da 14 ml&nbsp;</td><td>Beckman Coulter Regno Unito Ltd</td><td>344060</td><td>Per la purificazione dello sperma</td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol)</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>Per la purificazione dello sperma</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Reagente per permeabilizzazione cellulare</td></tr><tr><td></td><td>Agitatore Hybaid&nbsp;</td><td>HB-SHK-1</td><td>Per la defollicolazione degli ovociti</td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione (Stereomicroscopio zoom)</td><td>ZEISS</td><td>Semi SV6</td><td>Per la raccolta degli ovociti e la microiniezione</td></tr><tr><td>50 &mu; filtro per pori</td><td>m CellTrics</td><td>04-0042-2317</td><td>Per purificazione dello sperma</td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100XP</td><td>Per la purificazione dello sperma</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 50 ml</td><td>Cellstar Greiner Bio-One</td><td>227261 o 210261</td><td>Reazione di raccolta e defollicolazione degli ovociti</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 15 ml</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td>Per la purificazione dello sperma</td></tr><tr><td>Petri da 90 mm piatto&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>101VR20/C</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari di facile presa, 60&nbsp; x&nbsp; Piatto</td><td>per</td> colture cellulari FALCON <td>353004</td><td></td>da 15 mm</tr> di <tr><td>facile presa, 35&nbsp; x&nbsp; 15 mm</td><td>FALCON</td><td>351008</td><td></td></tr></tbody></table>

manipolazione e<em&gt; in vitro</em&gt; maturazione di<em&gt; xenopus laevis</em&gt; ovociti, seguito da iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi, per studiare lo sviluppo embrionale

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Le uova di anfibi sono state ampiamente utilizzate per studiare lo sviluppo embrionale. Lo sviluppo embrionale precoce è guidato da fattori immagazzinati dalla madre accumulati durante l'ovogenesi. Al fine di studiare i ruoli di tali fattori materni nello sviluppo embrionale precoce, è auspicabile manipolare le loro funzioni fin dall'inizio dello sviluppo embrionale. I metodi convenzionali di interferenza genica si ottengono mediante l'iniezione di oligonucleotidi antisenso (oligo) o mRNA in uova fecondate, consentendo rispettivamente la sotto- o la sovra-espressione di proteine specifiche. Tuttavia, questi metodi richiedono normalmente più di diverse ore prima che l'espressione proteica sia influenzata e, quindi, l'interferenza delle funzioni geniche non è efficace durante le prime fasi embrionali. Qui, introduciamo un sistema sperimentale in cui i livelli di espressione delle proteine materne possono essere alterati prima della fecondazione. Gli ovociti di Xenopus laevis ottenuti dalle ovaie vengono defollicolati mediante incubazione con enzimi. Gli oligo antisenso o mRNA vengono iniettati negli ovociti defollicolati allo stadio di vescicola germinale (GV). Questi ovociti vengono maturati in vitro in ovuli allo stadio di metafase II (MII), seguiti da iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI). In questo modo, fino al 10% degli embrioni ICSI può raggiungere lo stadio di girino natatorio, consentendo così test funzionali di knockdown o sovraespressione di geni specifici. Questo approccio può essere un modo utile per studiare i ruoli dei fattori immagazzinati dalla madre nello sviluppo embrionale precoce.

Lo sviluppo embrionale di embrioni ICSI con ovociti in vitro maturazione è stata esaminata (Figura 3A). Tassi maturazione degli ovociti GV alla fase MII sono variabili e dipende in gran parte la qualità degli ovociti. In buone esperimenti, quasi il 100% degli ovociti GV rispondere alle progesterone e mostrano segni di maturazione degli ovociti, diventando infine le uova in fase MII. Tutti ovociti maturati sono stati sottoposti a ICSI e circa il 25% di uova iniettate spaccati (Figura 3A, n = 13 per il controllo scrambled ovociti oligo-iniettato e n = 7 per non ovociti oligo-iniezione). Circa il 60% o 80% degli embrioni spaccati, prodotti a partire da ovociti oligo-iniettato controllo o ovocita non per iniezione, rispettivamente, hanno raggiunto la fase blastula / gastrula. Tra gli embrioni blastula / gastrula, circa la metà degli embrioni in campioni oligo-iniettato erano di buona qualità (quasi segni di scissione anormale e apoptosi), mentre l&#39;82% degli embrioni blastula / gastrula erano di buona qualità in ncampioni on-iniettati (Figura 3A). Infine, il 41% e l&#39;11% degli embrioni spaccati in campioni oligo-iniettato raggiunsero la risposta muscolare e le fasi di nuoto girino, rispettivamente, mentre il 60% e il 29% degli embrioni spaccati in campioni non iniettato fatto (Figura 3A). Questi embrioni ICSI sono la miscela di embrioni normali e patologici (Figura 3B). Alcuni di loro subiscono metamorfosi e si sviluppano a maturare rane 8. Questi risultati suggeriscono che l&#39;iniezione di oligonucleotidi antisenso in ovociti GV, seguiti da IVM e ICSI, permette efficiente sviluppo embrionale precoce. Anche se l&#39;iniezione di oligonucleotidi antisenso si diminuisce lo sviluppo embrionale, siamo ancora in grado di ottenere un numero sufficiente di embrioni per molti scopi sperimentali come il controllo i tassi di sviluppo, RT-PCR, Western Blot e così via. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig1highres.jpg" /> Fico<html> ure 1: Esempi tipici di Xenopus laevis ovociti di buona qualità o di cattiva qualità per esperimenti di maturazione in vitro. (A) Un esempio di ovociti di qualità cattiva. Ad esempio, gli ovociti mostrano pigmentazione frammentarie non vengono utilizzate per gli esperimenti successivi. Ogni Xenopus laevis ovocita è di circa 1,2-1,4 mm di diametro. (B) Un ovocita parzialmente defolliculated. La metà destra del ovocita è coperta da cellule follicolari, che possono essere distinti dalla presenza di vasi sanguigni. Una freccia indica una zona priva di cellule del follicolo e in cui l&#39;ago di iniezione viene iniettato. (C) Un esempio di ovociti di buona qualità, che sono altrettanto dimensioni e mostrano emisferi animali uniformemente pigmentate con netto contrasto tra l&#39;emisfero animale e l&#39;emisfero vegetale. 2496 / 52496fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figura 2:. Xenopus laevis ovociti prima e dopo la maturazione degli ovociti dopo la maturazione, macchie bianche chiare appaiono nella parte superiore degli emisferi animali e cellule follicolari sono staccata. Ogni Xenopus laevis ovocita è di circa 1 mm di diametro. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig3highres.jpg" /> Figura 3: Sviluppo di embrioni ICSI, prodotti da ovociti in vitro maturato. (A) Sviluppo di ICSI embrioni per ogni fase è riassunta. Gli oociti sono stati iniettati con controllo strapazzate oligonucleotidi antisenso (iniezione oligo di controllo) o senza iniezione (non iniezione), seguiti da IVM e ICSI. Il corrispondente numero di embrioni in ciascuna fase è indicata sopra le barre. Media ± SEM è mostrato. N = 4-13 esperimenti indipendenti / diverso females. (B) Esempi di sopravvivere embrioni ICSI. Questi embrioni tailbud fase sono stati prodotti in un esperimento, in cui circa 200 ovociti sono stati usati come materiale di partenza.

Descriviamo i metodi di manipolazione degli ovociti immaturi di Xenopus laevis, la maturazione in vitro degli ovociti in ovuli e l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi. Questo protocollo consente la degradazione di alcune proteine materne e la sovraespressione di geni di interesse alla fecondazione, e quindi è prezioso per studiare il ruolo di fattori specifici nello sviluppo embrionale precoce.

Manipolazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturazione di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; ovociti, seguito da Iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi, per studiare lo sviluppo embrionale

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Lo scopo del seguente esperimento è ridurre le proteine materne accumulate negli oociti o sovraesprimere proteine di interesse al momento della fecondazione delle uova di rana. Questo viene ottenuto iniettando oligonucleotidi antisenso o mRNA in oociti immaturi deregolati enzimaticamente, al fine di degradare o sovraesprimere una proteina specifica. Come secondo passaggio, gli oociti vengono trasferiti in un mezzo contenente progesterone, che induce la maturazione degli oociti in uova.Successivamente, lo sperma viene iniettato nelle uova matured in vitro al fine di osservare l'effetto dell'abbattimento o della sovraespressione sullo sviluppo embrionale. In definitiva, lo sviluppo delle oociti iniettate con oligonucleotidi fino a girini nuotanti rappresenta il test funzionale dell'abbattimento o della sovraespressione genica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il trasferimento nell'ospite, è che possiamo evitare il processo chirurgico sulle rane utilizzando protocolli standard.Raccogliere un opus su SAC contenente citi sani in una piastra di Petri da nove centimetri contenente MBS più ps. Quindi sminuzzare l'ovaio in pezzi quadrati larghi da uno a due centimetri. Raccogliere circa cinque millilitri dell'ovaio lacerato con i citi in un nuovo tubo da 50 millilitri.Quindi risciacquare i tessuti con MBS più PS per alcune volte e raccogliere le uova in 15 millilitri di MBS fresco più ps. Ora, aggiungere sette unità di enzima defoliazione alla sospensione e incubare la sospensione con agitazione delicata fino a quando non risultino almeno parzialmente defogliati. Questo richiederà almeno un'ora dopo l'incubazione.Riempire il tubo con MBS più Ps per arrestare la reazione. Versare la soluzione sulla parete del tubo e non direttamente sui citi. Lasciare sedimentare i tessuti e scartare il liquido e l'agente.I citi piccoli e immaturi galleggeranno e devono essere scartati. Ripetere questo passaggio di lavaggio un totale di 10 volte dopo i lavaggi. Trasferire i citi in una piastra da nove centimetri con MBS più ps.Trasferire la piastra su un microscopio stereoscopico e, da questo momento in avanti, mantenere i citi a una temperatura compresa tra 16 e 18 gradi Celsius per quanto possibile. Selezionare i citi di buona qualità allo stadio sei utilizzando la classificazione di Dumont mediante una pipetta di vetro, raccoglierli in una nuova piastra con MBS più ps. Un cito di buona qualità deve presentare una pigmentazione uniforme nell'emisfero animale e mostrare una chiara separazione tra l'emisfero animale e quello vegetale.Dovrebbero inoltre essere tutti di dimensioni simili, comprese tra 1,2 e 1,4 millimetri di diametro. Raccogliere circa da due a 300 cellule per ogni iniezione, per un totale di circa 1000 cellule per esperimento. La qualità del sito O è fondamentale per il successo.Se l'ovide presenta delle anomalie durante il preparato, consiglio di correggere un ovaio proveniente da un altro gruppo e ricominciare. In preparazione all'iniezione dell'oligonucleotide antisenso, posizionare lo stantuffo metallico di un microiniettore nella posizione più bassa ed inserire una capillare di vetro riempita di olio sullo stantuffo metallico. Sotto un microscopio stereoscopico, tagliare la punta dell'ago utilizzando piccole forbici chirurgiche.Realizzare una punta il più piccola possibile. Successivo laser. Posizionare una striscia di paraform sulla piastra del microscopio e depositarvi sopra tre microlitri di soluzione di acido nucleico a un microgrammo per microlitro.Con questo, riempire la punta dell'ago. Se viene intrappolata aria, l'apertura dovrebbe essere allargata. Ora fare un segno visibile sull'ago di iniezione a circa mezzo millimetro dalla punta.Quindi procedere con l'iniezione delle cellule, iniettandone innanzitutto una singola, individuando un'area priva di cellule follicolari attraverso la quale l'ago possa penetrare. Inserire la punta lungo il confine equatoriale puntando verso il punto centrale al di sotto della vescicola germinale. Allo stesso tempo, stabilizzare la cellula con una pinzetta sul lato opposto.Ora, utilizzando il controllo a pedale, espellere la soluzione, iniettando tra 4,6 e 9,2 nanogrammi di oligonucleotidi antisenso o tra 250 picogrammi e 13,8 nanogrammi di RNA messaggero. Dopo aver iniettato tutte le cellule, trasferirle nel mezzo di incubazione e lasciarle incubare per alcuni giorni in modo che possano verificarsi dei cambiamenti. Nel proteasoma.In seguito, trasferire le cellule con una quantità minima di mezzo in piatti da sei centimetri rivestiti con agros e contenenti da cinque a otto millilitri di mezzo di maturazione. Lasciare quindi sviluppare le cellule in questo mezzo per 16 ore prima di iniettarle con spermatozoi. Per questo protocollo, è necessario preparare una riserva di spermatozoi congelati.Consultare il protocollo scritto dopo 16 ore di incubazione per la maturazione. Trasferire con molta attenzione i citi in una piastra da sei centimetri rivestita con uovo intero in MBS più PS per lavarli via. Se i citi vengono manipolati in modo improprio, potrebbero attivarsi spontaneamente prima dell'ixy.Ora, conta i citi maturati e cerca macchie bianche che indicano la rottura del vescicolo germinale del cite. Se meno dell'80% è buono, nel complesso non sono abbastanza sani da sopravvivere alla procedura ixy. Per procedere.Riempire una nuova piastra con il mezzo di iniezione e trasferire delicatamente tutti i citi nella piastra dopo mezz'ora. Procedere con l'iniezione dei citi maturi con soluzione di sperma utilizzando la stessa preparazione dell'iniettore descritta per gli oligos. Idealmente, dovrebbe esserci uno o due spermatozoi per ogni 4,6 nanolitri nella soluzione di iniezione.Per testare questa soluzione di iniezione, preparare gocce di soluzione DPI a 0,3 microgrammi di DPI per millilitro e iniettare 4,6 nanolitri in ciascuna goccia. Quindi contare il numero di spermatozoi in ogni goccia mediante microscopia a fluorescenza. Dopo aver confermato la concentrazione di spermatozoi, iniettare le cellule con 4,6 nanolitri della soluzione di spermatozoi.Assicurarsi che il tempo necessario per iniettare le soluzioni rimanga costante e iniettare gli oociti in modo regolare, con pause minime tra un'iniezione e l'altra. Dopo ogni 100 iniezioni, sostituire la soluzione di spermatozoi. Una volta iniettati tutti gli oociti maturati, la piastra deve essere incubata per quattro o cinque ore, quindi ispezionata.Per gli embrioni che hanno subito la segmentazione, le solcature di segmentazione potrebbero non essere chiare come quelle degli embrioni fertilizzati normali; trasferire tutti gli embrioni segmentati nel mezzo di incubazione e lasciarli incubare per tutta la notte. Il giorno successivo, gli embrioni sopravvissuti devono essere trasferiti nel mezzo di sviluppo embrionale 0,1 XMMR per embrioni ixy. L'uso di ovociti maturati in vitro è stato esaminato in esperimenti accurati, in cui quasi il 100% degli ovociti con vescicola germinale ha risposto alla progesterone e ha mostrato segni di maturazione.Circa il 25% ha subito la segmentazione. Dal 60 all'80% degli embrioni segmentati ha raggiunto lo stadio di blastagaste, e circa un terzo di questi ha raggiunto lo stadio di girino nuotante. Gli embrioni ixy erano una miscela di embrioni sia normali che anomali, dimostrando che l'iniezione dell'oligonucleotide antisenso sogo in cellule germinali veicolate, seguita da IVM e Dixie, ha permesso lo sviluppo embrionale precoce.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come manipolare le proteine materne prima della fattorizzazione.

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