Name: Valutazione dellinvasione batterica delle cellule cardiache in coltura e colonizzazione cardiaca nei topi infetti utilizzando listeria monocytogenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Scopri come valutare l'invasione batterica delle cellule cardiache e la colonizzazione cardiaca nei topi utilizzando Listeria monocytogenes. Questo metodo permette di studiare le infezioni microbiche in vitro e in vivo.

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<li>Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+extravillous+trophoblasts+restrict+intracellular+growth+and+spread+of+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes.</a> PLoS Pathog. 7, e1002005(2011).</li>
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<li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+Listeria+monocytogenes+07PF0776%2C+a+cardiotropic+serovar+4b+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain.</a> J Bacteriol. 194, 3552(2012).</li>
</ol>

Gli autori non segnalano interessi finanziari concorrenti.

L. monocytogenes è un agente patogeno umano diffuso e ben caratterizzato, in grado di causare una serie di diverse manifestazioni di malattia15. Il batterio è stato precedentemente descritto per la sua capacità di trasporre attraverso barriere, come la barriera ematico-encefalica e le barriere placentare-fetali, al fine di raggiungere e colonizzare il sistema nervoso centrale e sviluppare il feto, rispettivamente. La capacità in vivo dell'organismo di colonizzare questi tessuti è spesso compl...

La Listeria monocytogenes è un agente patogeno intracellulare gram-positivo in grado di causare gravi malattie nelle popolazioni sensibili, tra cui anziani, donne incinte, persone con HIV / AIDS e persone che ricevono la chemioterapia1. L'infezione in queste popolazioni è spesso il risultato dell'ingestione di prodotti alimentari contaminati e la maggior parte delle infezioni sono associate a focolai di origine alimentare su largascala 2,3. Nell'uomo e in altri mammiferi, L. monocytogenes è in grado di trasporre attraverso il confine epiteliale dell'intestino tenue, per poi essere trasportato al fegato4,5. I modelli animali suggeriscono che i batteri ingeriti si replicano all'interno dei villi intestinali e transitano al fegato attraverso la vena portale o si diffondono attraverso i linfonodi mesenterici nel flusso sanguigno, portando alla diffusione ematogena al fegato e alla milza6,7. Nel fegato e nella milza, il batterio è in grado di mediare l'assorbimento sia nei fagociti professionisti che nelle cellule parenchimali residenti e stabilisce rapidamente infezioni all'interno di questi organi. Con l'aumentare della carica batterica, numerosi batteri vengono dispersi nel sangue, dove sono in grado di colonizzare ulteriormente i tessuti sensibili tra cui il sistema nervoso centrale e la placenta (dove presente). La colonizzazione di questi siti preclude le manifestazioni più comuni di listeriosi negli esseri umani, tra cui meningite, encefalite e aborto fetale2.
Alcune sottopopolazioni di L. monocitogene hanno recentemente dimostrato di avere una maggiore capacità di invadere e replicare all'interno del tessuto cardiaco8. Le manifestazioni di coinvolgimento cardiaco sono varie e vanno dall'endocardite e pericardite, alla miocardite fulminante completa di anomalie di conduzione9-13. Il numero complessivo di casi cardiaci L. monocytogenes all'anno è basso, ma può essere sottovalutato in quanto questo aspetto dell'infezione non è generalmente ben riconosciuto. La colonizzazione del cuore da parte di agenti patogeni richiede spesso predisposizioni ospiti come danni valvulari preesiste o valvole cardiache artificiali. Esistono, tuttavia, isolati di L. monocytogenes che sono stati identificati che si notano per la loro capacità di colonizzare il cuore degli animali infetti in assenza di danni cardiaci e/o anomalie8.
Nel presente documento sono descritti metodi in vitro e in vivo per valutare la colonizzazione batterica del tessuto cardiaco all'interno di animali infetti utilizzando test di invasione nella coltura tissutale e infezioni animali vive. Questi metodi si sono dimostrati utili non solo per identificare ceppi con il potenziale di colonizzare il tessuto cardiaco negli animali infetti, ma dovrebbero anche essere utili per l'identificazione di prodotti genetici batterici che servono a migliorare l'invasione delle cellule cardiache e / o provocare cambiamenti nella patologia cardiaca. Questi metodi facilitano il confronto del cardiotropismo tra più ceppi. Per i metodi qui descritti, L. monocytogenes 10403S è usato come rappresentante ben studiato di un ceppo non cardiotropico e l'isolato clinico 07PF0776 è usato come esempio rappresentativo di un ceppo cardiotropico. Questi due ceppi sono stati scelti per fornire un confronto per l'invasione batterica di cellule cardiache in vitro e la colonizzazione dei cuori dei topi infetti in vivo. L'isolato 07PF0776 è un isolato clinico recuperato da un ascesso interventricolare che ha causato un'aritmia fatale in un paziente HIV+8. L. gli isolati monocitogeni possono variare nel loro potenziale di virulenza e, data la propensione della Listeria a infettare le persone con immunosoppressione e le donne incinte, le persone all'interno di queste popolazioni dovrebbero prestare attenzione nel valutare diversi isolati clinici.

<table><tbody><tr><td>Difco</td><td>BHI Brodo Base</td><td>237200</td><td>2 kg di Brain Heart Infusion in polvere (senza agar)</td></tr><tr><td>Difco</td><td>Agar</td><td>214510</td><td>2 kg di Agar Granulato</td></tr><tr><td>Difco</td><td>BHI Agar</td><td>241810</td><td>2 kg di Brain Heart Infusion in Polvere con il 7,5% di Agar</td></tr><tr><td>in vitrogen</td><td>LB Broth Base</td><td>12975-084</td><td>2 kg di Luria Broth Base in Polvere (senza agar)</td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Glass Vetrini coprioggetti</td><td>12-545-80</td><td>Vetrini coprioggetti in vetro da 12 mm</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale Falcon a 24 pozzetti</td><td>35-3047</td><td>Piastra per coltura tissutale trattata al plasma a 24 pozzetti Tubo per coltura tissutale</td><td></td></tr><tr><td>Falcon</td><td>14 ml</td><td>352051</td><td>Provette in polistirene da 14 ml</td></tr><tr><td>Piastra con fondo a U a 96 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>35-3077</td><td>Piastra a 96 pozzetti non trattata per coltura tissutale</td></tr><tr><td>Corning</td><td>0,05% Tripsina, 0,53 mM EDTA (1X)</td><td>Soluzione madre 25-052-CI</td><td>di tripsina EDTA per coltura tissutale</td></tr><tr><td>Corning</td><td>DMEM (High glucose, high pyruvate)</td><td>15-013-CU</td><td>DMEM medium senza FBS, glutammina o antibiotici</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Pen/Strep/Glut Solution</td><td>30-009-CI</td><td>Miscela madre di penicillina, streptomicina e L-glutammina per la coltura tissutale</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Gentamicin</td><td>30-005-CR</td><td>50 mg/ml Soluzione madre di Gentamicina per coltura tissutale</td></tr><tr><td>Cellgro (Corning)</td><td>L-Glutammina</td><td>25005197</td><td>Soluzione madre di L-glutammina senza antibiotici</td></tr><tr><td>Denville</td><td>75cm^2 Flask</td><td>T1225</td><td>75 cm2 Flacone trattato per coltura tissutale</td></tr><tr><td>Denville</td><td>1,5mL</td><td>2013004</td><td>provette per microcentrifuga da 1,5 ml</td></tr><tr><td>ATCC</td><td>H9c2 Cardiaco Mioblasti</td><td>CRL-1446</td><td>Mioblasti cardiaci di ratto</td></tr><tr><td>Siero bovino fetale</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.63</td><td>Siero bovino fetale</td></tr></tbody></table>

valutazione dell'invasione batterica delle cellule cardiache in coltura e colonizzazione cardiaca nei topi infetti utilizzando listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes è un agente patogeno intracellulare facultativo Gram-positivo in grado di causare gravi infezioni invasive in pazienti immunocompro compromessi, anziani e donne in gravidanza. Le manifestazioni più comuni di listeriosi negli esseri umani includono meningite, encefalite e aborto fetale. Una sequela significativa ma molto meno documentata dell'infezione invasiva di L. monocytogenes coinvolge il cuore. Il tasso di mortalità per malattia cardiaca può essere fino al 35% nonostante il trattamento, tuttavia si sa molto poco per quanto riguarda la colonizzazione L. monocytogenes del tessuto cardiaco e le sue patologie risultanti. Inoltre, è recentemente diventato evidente che le sottopopolazioni di L. monocytogenes hanno una maggiore capacità di invadere e crescere all'interno del tessuto cardiaco. Questo protocollo descrive in dettaglio i metodi in vitro e in vivo che possono essere utilizzati per valutare il cardiotropismo degli isolati L. monocytogenes. Sono presentati metodi per l'infezione dei mioblasti cardiaci del ratto H9c2 nella coltura tissutale e per la determinazione della colonizzazione batterica dei cuori dei topi infetti. Questi metodi sono utili non solo per identificare i ceppi con il potenziale di colonizzare il tessuto cardiaco negli animali infetti, ma possono anche facilitare l'identificazione di prodotti genetici batterici che servono a migliorare l'invasione delle cellule cardiache e / o guidare cambiamenti nella patologia cardiaca. Questi metodi prevedono anche il confronto diretto del cardiotropismo tra più ceppi di L. monocytogenes.

Isolati selezionati di L. monocytogenes mostrano una maggiore invasione delle cellule cardiache nella coltura cellulare e nei modelli di infezione dei topi. La figura 1 mostra un esempio di come le colonie batteriche possano apparire a seguito della placcatura spot delle sospensioni sui mezzi agar. Questo metodo consente una valutazione accurata dei CFC all'interno di un campione senza utilizzare un gran numero di piastre di supporto agar. La figura 2 mostra un esempio di saggio...

La listeria monocytogenes causa infezioni fetali nelle donne in gravidanza e meningite nelle popolazioni sensibili. Le sottopopolazioni di batteri possono colonizzare il tessuto cardiaco, causando miocardite in pazienti e animali da laboratorio. Qui presentiamo un protocollo che descrive come valutare l'invasione delle cellule cardiache di L. monocytogenes in vitro e la colonizzazione cardiaca negli animali infetti.

Valutazione dell'invasione batterica delle cellule cardiache in coltura e colonizzazione cardiaca nei topi infetti utilizzando listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è fornire metodi efficienti per valutare l'infezione microbica delle cellule cardiache, utilizzando modelli in vivo e in vitro di colonizzazione cardiaca e invasione delle cellule cardiache. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando colture batteriche e raccogliendo, lavando e risospendendo le cellule batteriche in soluzione salina tamponata al fosfato. Successivamente, monoculti di cellule cardiache cresciute su coprislip di vetro vengono infettate con una sospensione batterica, oppure la sospensione batterica viene inoculata nei topi mediante iniezioni nella vena della coda.Successivamente, le cellule cardiache vengono incubate in presenza di gentamicina per eliminare i batteri extracellulari, seguita da lisi cellulare per il recupero. I batteri o gli animali infetti vengono monitorati per valutarne il benessere due o tre giorni dopo l'infezione, quindi sacrificati per l'isolamento degli organi bersaglio. Infine, le sospensioni cellulari e organiche vengono diluite e seminate utilizzando un metodo di semina a spot per determinare il numero di batteri vitali associati alle cellule o agli organi bersaglio.Infine, le colonie batteriche

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Listeria monocytogenes è un organismo modello per studiare le risposte immunitarie e la suscettibilità genetica a batteri intracellulari nei topi. Questo metodo permette di misurare la carica batterica e di generare monocellulari sospensioni del fegato e della milza di topi per l'analisi FACS per determinare cambiamenti nelle cellule del sistema immunitario dovuta a infezione da Listeria.

Misurazione della carica batterica e Risposte immunitarie in topi infettati con Listeria monocytogenes</em

Fonte: McMullen, P. D., Freitag, N. E. Valutazione dell'invasione batterica delle cellule cardiache in coltura e colonizzazione cardiaca in topi infetti utilizzando Listeria monocytogenes. J. Vis. Esp. (2015)Questo video mostra l'iniezione di Listeria monocytogenes nella vena caudale di un topo per stabilire un'infezione sistemica. Mostra la circolazione batterica, la colonizzazione degli organi e la quantificazione del carico batterico nel cuore omogeneizzando i tessuti, eseguendo diluizioni...

Quantificazione del carico batterico nel cuore del topo dopo l'iniezione nella vena caudale di Listeria monocytogenes

Questo video mostra un metodo per stabilire un modello di infezione nei tessuti placentari per studiare la propagazione dell'infezione. Una coltura di organi placentari ex vivo è infettata da Listeria monocytogenes, un parassita intracellulare facoltativo. I batteri invadono i trofoblasti extravillosi (EVT) per entrare nel tessuto placentare e quindi propagarsi ad altre cellule attraverso la diffusione da cellula a cellula.

Una tecnica per stabilire un modello di infezione batterica in una coltura d'organo ex vivo

Questo video dimostra la quantificazione della carica batterica infettiva dal cervello di topo perfuso infettato da Listeria monocytogenes.

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Questo documento descrive un nuovo metodo per l'infezione orale di topi...

Trasmissione orale di<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Nei topi tramite ingestione di alimenti contaminati

Listeria monocytogenes è un batterio patogeno Gram positivi frequentemente usato come modello importante per lo studio di parassitismo intracellulare. Imaging tardi L. monocytogenes fasi di infezione nel contesto di schermi piccole interferenti RNA permette per lo studio globale di vie cellulari necessarie per infezione batterica delle cellule ospiti bersaglio.

Imaging InlC secrezione per Indagare infezione Cellular dalla batterica patogeni<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Lo Streptococcus pneumoniae forma lesioni microscopiche discrete non purulente nel cuore. Viene delineato il protocollo per un modello murino di formazione di microlesioni cardiache. Vengono fornite istruzioni sulla visualizzazione delle microlesioni mediante microscopia, sulla discriminazione tra microlesioni precoci e tardive e sui metodi per rilevare il rimodellamento cardiaco nei cuori degli animali convalescenti.

Visualizzazione<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Entro cardiache microlesioni e successive rimodellamento cardiaco

Questo protocollo descrive come inoculare topi C57BL / 6J con il ceppo EGD di Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) e per misurare l'interferone-γ (IFN-γ) risposte da parte delle cellule natural killer (NK), cellule T natural killer (NKT), e adattiva linfociti T dopo l'infezione. Questo protocollo descrive anche come condurre studi di sopravvivenza in topi dopo l'infezione con una versione modificata del DL 50 dosi del patogeno.

Infezione sperimentale con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Come modello per lo studio Host Interferone-gamma Risposte

Un protocollo dettagliato di un modello murino per enteroemorragica e. coli (enteroemorragico EHEC) colonizzazione tramite bioluminescenza-identificati batteri è presentato. La rilevazione di questi batteri bioluminescenti di un non-invasiva in vivo imaging sistema animali vivi può avanzare la nostra comprensione corrente della colonizzazione di EHEC.

Rilevamento della colonizzazione di Escherichia Coli enteroemorragica in murino Host di sistema Non invasivo In Vivo bioluminescenza

Durante l'infezione, la Listeria monocytogenes è in grado di attraversare la barriera ematomeningea per colonizzare il cervello. In questo protocollo, dimostriamo come valutare la colonizzazione batterica degli organi a seguito di infezione dei topi. È disponibile una procedura per eseguire perfusione d'organo intero per determinazione specifica di numeri batterici nel parenchima del cervello.

Listeria monocytogenes Infezione del cervello

Descriviamo entrambe le analisi in vitro e in vivo di infezione che possono essere utilizzate per analizzare le attività dei fattori ospite-codifica.

Utilizzando un agente patogeno batterico alla sonda per le risposte cellulari e organismica-livello Host

Scopri come valutare l'invasione batterica delle cellule cardiache e la colonizzazione cardiaca nei topi utilizzando Listeria monocytogenes. Questo metodo permette di studiare le infezioni microbiche in vitro e in vivo.

Valutazione dellinvasione batterica delle cellule cardiache in coltura e colonizzazione cardiaca nei topi infetti utilizzando listeria monocytogenes (Video) | JoVE Journal

Valutazione dell'invasione batterica delle cellule cardiache in coltura e colonizzazione cardiaca nei topi infetti utilizzando listeria monocytogenes

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