Mass spettrometrica Approcci alla struttura studio e interazioni proteina in liofilizzati Polveri

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di monitorare la struttura di una proteina ad alta risoluzione utilizzando l'emissione di idrogeno e lo scambio di deuterio e la marcatura litica a catena laterale accoppiata alla spettrometria di massa. Ciò si ottiene liofilizzando prima la proteina in presenza di diversi eccipienti. Nello scambio di idrogeno e deuterio allo stato solido, la proteina liofilizzata è esposta al vapore di ossido di deuterio in un essiccato sigillato a umidità relativa e temperatura controllate.

Per la marcatura litica, la proteina viene liofilizzata con eccipienti e un agente fotoreattivo. La fiala viene quindi irradiata con la luce UV per legare in modo covalente l'agente alla proteina. Per ogni metodo, i campioni vengono ricostituiti e analizzati utilizzando uno spettrometro di massa con risoluzione sia a livello di proteina intatta che di peptide.

Questi due metodi forniscono informazioni complementari. Le formulazioni in cui la struttura proteica è altamente mantenuta, mostrano una diminuzione dell'assorbimento del deuterio e un aumento della marcatura litica, mentre quelle con struttura perturbata mostrano un aumento dell'assorbimento del deuterio e una diminuzione della marcatura litica. La marcatura chimica, come lo scambio idrogeno-deuterio e la fotoreticolazione accoppiata con l'analisi spettrometrica di massa, è stata recentemente adattata per studiare la struttura e le interazioni delle proteine in supporti vivaci.

Il vantaggio principale di queste tecniche rispetto ai metodi esistenti come la spettroscopia CD e FDIR è che la struttura e l'ambiente delle proteine possono essere sondati con alta risoluzione allo stato solido. Per iniziare, metti 200 millilitri di ossido di deuterio nello scomparto inferiore di un essiccante e aggiungi 400 grammi di carbonato di potassio Per ottenere una soluzione satura, posiziona la piastra essiccante in porcellana all'interno e sigilla ermeticamente l'essiccato. Lasciarlo equilibrare a cinque gradi Celsius per raggiungere un'umidità relativa stabile vicina al 43%Quindi, posizionare le fiale senza tappo contenenti proteine liofilizzate nello scomparto superiore dell'essiccato, sigillare l'essiccato e incubare a cinque gradi Celsius.

Per avviare la reazione di scambio idrogeno-deuterio per raccogliere un campione, tappare la fiala subito dopo averla rimossa dall'essiccato, quindi spegnere la reazione congelando la fiala e l'azoto liquido. Conservare la fiala a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino all'analisi spettrometrica di massa. Utilizzare la spettrometria di massa ad alta risoluzione per analizzare i campioni e ridurre al minimo lo scambio di ritorno.

Com'è il sistema cromatografico liquido all'interno di una scatola refrigerata? Per configurare prima lo strumento, collegare il circuito del campione e la trappola proteica alla valvola che controlla i processi di desalinizzazione ed eluizione. Quindi, calibrare il sistema iniettando la miscela di sintonizzazione a bassa concentrazione nello spettrometro di massa e impostando l'intervallo del rapporto massa/carica da 200 a 3.200.

Quindi raffreddare il sistema refrigerato a una temperatura di esercizio stabile di circa zero gradi Celsius. Preparare il tampone di tempra contenente lo 0,2% di acido formico e il 5% di metanolo in acqua e raffreddarlo con ghiaccio. Dopo aver trasferito i campioni in azoto liquido, rimuovere con cura una fiala e ricostituire il campione con l'aggiunta di due millilitri di tampone di spegnimento.

Successivamente, caricare un metodo HPLC e spettrometria di massa appropriato. Per analizzare il campione qui, dissalare 20 picomoli di mioglobina nella trappola proteica per 1,7 minuti con il 5% di acetil nitrile e lo 0,1% di acido formico. Quindi eluire la proteina con un gradiente di 3,3 minuti, aumentando all'80% di nitrile di aceto e allo 0,1% di acido formico.

Iniettare il campione e raccogliere gli spettri di massa in un intervallo compreso tra 200 e 3, 200 rapporto massa/carica. Per determinare la massa della proteina intatta come riferimento, utilizzare lo stesso metodo con un campione di proteina non debitamente valutato. Ottenere la massa proteica deconvolundo gli spettri grezzi utilizzando un software di analisi dei dati Per l'analisi del campione di mioglobina, impostare l'intervallo di massa da 15 a 18, kilodalton, la risoluzione della massa a un Dalton e l'aquilone di picco al 90%Per l'analisi dei peptidi, preparare i campioni utilizzando lo stesso protocollo utilizzato per le proteine intatte.

Quando i campioni sono pronti per essere analizzati, collegare una colonna di pepina immobilizzata e una colonna analitica alla valvola e sostituire la trappola proteica con una trappola peptidica. Calibrare il sistema per i peptidi ha eseguito per le proteine intatte, ma impostando l'intervallo di rapporto massa/carica da 100 a 1700, quindi raffreddare il sistema refrigerato a una temperatura di esercizio stabile di circa zero gradi. Una volta calibrato il sistema, programmare il metodo HPLC e di spettrometria di massa appropriato.

Qui digerire 20 picomoli di mioglobina sulla colonna di pepina con acido formico allo 0,1% in acqua, programmare il metodo per intrappolare e desalinare i peptidi nella trappola peptidica per 1,7 minuti con il 10% di acetil nitrile e lo 0,1% di acido formico, e per eluire i peptidi in quattro minuti con un gradiente che aumenta al 60% di acetil nitrile e allo 0,1% di acido formico. Quindi, iniettare il campione e raccogliere gli spettri di massa in un intervallo di rapporto massa/carica compreso tra 100 e 1700. Analizzare un campione peptidico non datato con la spettrometria di massa tandem per identificare i frammenti peptici.

Quindi effettua un controllo incrociato del frammento determinato sperimentalmente con le masse previste generate dal software. Quindi, impostare il taglio di massa a 10 parti per milione per eliminare le masse con errore elevato per i peptidi con corrispondenze. Annotare lo stato di carica della sequenza peptidica e il tempo di ritenzione.

Utilizzare i dati peptidici compilati per calcolare il numero medio di deutero incorporati per frammento peptico Utilizzando il software di analisi dei dati Innanzitutto, liofilizzare la proteina con l'eccipiente e la lucina come indicato nel protocollo di testo. Dopo aver preparato i campioni, accendere un reticolante UV contenente lampade UV a 365 nanometri. Lasciare scaldare le lampade per cinque minuti.

Una volta che le lampade si sono riscaldate, spegnerle e posizionare le fiale senza tappo contenenti la formulazione all'interno della camera di reticolazione. Irradiare i campioni con luce UV per 40 minuti e includere campioni senza fotoleucina come controllo Dopo l'irradiazione, chiudere e conservare le fiale a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino all'analisi spettrometrica di massa. Preparare i campioni per l'analisi aggiungendo acqua distillata per spettrometria di massa per ottenere una concentrazione proteica finale di due micromolari.

Successivamente, analizzare i campioni utilizzando lo stesso metodo di spettrometria di massa utilizzato per le proteine deuterate intatte. Ma non utilizzare il sistema lc refrigerato. Acquisizione di dati di spettrometria di massa per un campione proteico non marcato per determinare la massa nativa della proteina.

Eseguire l'analisi dei dati come per i campioni DERATED per l'analisi del livello di peptidi. Innanzitutto, eseguire la marcatura fotolitica allo stato solido con proteine intatte e conservarle a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Quindi, ricostituire il campione con 100 millimolare di tampone bicarbonato di ammonio per ottenere una concentrazione proteica finale di 10 micromolari.

Mescolare il campione con la tripsina in un rapporto molare di 10 a uno tra proteine e tripsina e incubare questa miscela a 60 gradi Celsius per 16 ore. Nel frattempo, collegare il circuito del campione, la trappola peptidica e la colonna analitica alla valvola del sistema HPLC. Dopo aver digerito la proteina, estinguere la reazione aggiungendo lo 0,1% di acido formico in acqua per ottenere una concentrazione proteica finale di due micromolari.

Successivamente programmare il sistema con i metodi HPLC e spettrometria di massa. Qui, iniettare e dissalare 20 picomoli della mioglobina digerita nella trappola peptidica per 1,5 minuti con il 5% di aceto nitrile e lo 0,1% di acido formico, eluire i peptidi aumentando il gradiente in 22 minuti al 55% di acetil nitrile e raccogliere gli spettri di massa in un intervallo da 100 a 1700 rapporto massa/carica. Utilizzare lo strumento online per calcolare la massa teorica del peptide.

Fotoleucina addotto con i numeri di fotoleucina precedentemente ottenuti dall'analisi delle proteine intatte. Includi almeno quattro scollature mancate. Crea un elenco di massa in Excel per l'addotto della leucina fotografica del peptide.

Successivamente, abbina l'elenco delle masse teoriche con le masse osservate sperimentalmente impostando un punto di cutoff per identificare le masse con un errore basso. Durante lo scambio idrogeno-deuterio, il dispiegamento della proteina consente la sostituzione dell'idrogeno con proteine del deuterio che mantengono la loro struttura sono meno inclini allo scambio di deuterio. Quando la spettrometria di massa a scambio di idrogeno e deuterio allo stato solido è stata eseguita su formulazioni contenenti talosio e sorbitolo contenenti mioglobina, la formulazione contenente sorbitolo ha mostrato un assorbimento di deuterio maggiore del 46%, suggerendo che la struttura della mioglobina nel sorbitolo è più perturbata durante il processo litico.

La fotoleucina si lega alle catene laterali accessibili degli amminoacidi. L'analisi della spettrometria di massa fotolitica allo stato solido del sorbitolo e dei TLO contenenti formulazioni di mioglobina ha mostrato un maggiore assorbimento di fotoeina nella formulazione di TLO rispetto alla sua controparte. Ciò suggerisce che le catene laterali sono rimaste accessibili nella formulazione dei TLO.

Sia lo scambio idrogeno-deuterio che la marcatura litica utilizzano regioni disponibili in commercio e strumentazione MS prontamente disponibile per caratterizzare le proteine allo stato solido per una data formulazione. Il tempo totale che intercorre tra la preparazione del campione e l'analisi completa dei dati è inferiore a due settimane. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere informazioni ad alta risoluzione sulla struttura delle proteine e sulla sua importanza nella progettazione di formulazioni proteiche liofilizzate stabili.