Valutazione sperimentale del mouse Socialità con un approccio Image Processing automatizzata
15 maggio 2016
Questo protocollo descrive un metodo per quantificare socialità mouse. I topi sono videoregistrati mentre si muovono e interagiscono in una gabbia speciale. trasformazione di film consente la quantificazione automatizzata di socialità con ottima precisione e affidabilità.
L'obiettivo generale di questi esperimenti comportamentali abbinati ad analisi automatica è quantificare la socialità dei topi in modo efficiente in termini di tempo. Questo metodo può facilitare la rapida selezione di farmaci volti ad aumentare la socialità in modelli murini validati di disturbi dello spettro autistico. Il principale vantaggio dell'introduzione dell'analisi automatizzata è che accelera il processo e rende la selezione più efficiente.
La necessità di un metodo automatizzato per valutare il comportamento sociale nei topi è emersa perché lo screening visivo in tempo reale di una singola dose di un composto candidato richiede oltre 50 ore. Più avanti nel video, la mia studentessa laureata Frency Varghese mostrerà l'analisi automatizzata. Iniziare configurando la gabbia a tre compartimenti con pareti nere.
Per la prima sessione, posizionare una coppetta di filo metallico vuota e capovolta in ciascun compartimento alle estremità della gabbia. Preparare ora la videocamera in modo da visualizzare la gabbia dall'alto. Tutti e tre i compartimenti devono essere visibili con una risoluzione di almeno 720 per 480 pixel.
Quindi illuminare la gabbia con una luce incandescente indiretta in modo che l'interno della gabbia, misurato a partire dal pavimento, non superi i 3,5 lux. Fornire inoltre una luce infrarossa per illuminare la gabbia a un livello rilevabile dalla telecamera. Acquisire un'immagine a singolo fotogramma della gabbia vuota come riferimento.
Per la prima sessione, posizionare il topo da esaminare nella gabbia. Quindi, per avviare l'analisi automatizzata del video, passare una mano sopra la gabbia una sola volta. Lasciare che il topo esplori la gabbia di prova per 10 minuti.
Quindi riportarlo nella sua gabbia di origine. Per la seconda sessione, posizionare il topo stimolo sotto una delle due coppe capovolte. Selezionare quale coppa in modo bilanciato.
Nel software, indicare sotto quale coppetta è stato posto il topo stimolo. Per convenzione, la coppetta contenente il topo chiuso è definita coppetta sociale, mentre l'altra è la coppetta asociale. Anche i compartimenti sono denominati in modo analogo.
Fare partire l'inizio della seconda sessione con un gesto della mano, come nella prima sessione. Alla fine della seconda sessione, rimuovere i bicchieri capovolti per rilasciare il secondo topo. Utilizzare un altro gesto della mano per indicare l'inizio della terza sessione e permettere ai due topi di interagire nella gabbia di prova per 10 minuti.
Dopo 10 minuti, restituire entrambi i topi alle loro gabbie di provenienza. Questa sezione spiega come elaborare i filmati utilizzando l'interfaccia utente. Tuttavia, è anche possibile eseguire un'analisi rapida in modalità batch senza intervento dell'utente.
Cominciare caricando il filmato utilizzando il pulsante Carica. Quindi selezionare la configurazione della gabbia. Il programma di analisi individua i confini della gabbia, i compartimenti e le coppe.
Selezionare una delle quattro configurazioni preimpostate oppure regolare manualmente le coordinate. Ora, per ciascun fotogramma del filmato, eseguire i seguenti passaggi di elaborazione. Convertire innanzitutto i fotogrammi in scala di grigi.
In secondo luogo, sottrarre il fotogramma di riferimento in scala di grigi acquisito durante i preparativi, azzerando così i valori dei pixel ovunque tranne che nella posizione del topo. In terzo luogo, binarizzare i fotogrammi impostando su bianco tutti i pixel con luminosità superiore a una certa soglia e rendendo neri tutti gli altri. Regolare questa impostazione in base alle condizioni di illuminazione.
Ora rimuovi la coda dalle immagini utilizzando la funzione Erodi/Dilata. Erodi prima l'immagine binarizzata tre volte. Successivamente dilata il fotogramma sei volte.
Quindi erodere i fotogrammi altre tre volte. Questo potrebbe richiedere un aggiustamento se viene utilizzata una risoluzione in pixel diversa. I movimenti della mano sono facilmente identificabili come notevoli aumenti nel volume di pixel bianchi.
Questo consente la rilevazione automatica dell'inizio delle sessioni e dell'ordine delle sessioni. All'interno di ogni sessione, rilevare la componente più grande di pixel bianchi utilizzando il comando L/Comp. Questo elimina i pixel che non appartengono al topo.
Quindi utilizzare la funzione Trova estremità per determinare i due pixel più distanti all'interno della componente più grande di pixel bianchi. Questi rappresentano il naso e la coda. Il software determina il centro di gravità o COG dell'oggetto costituito da pixel bianchi e calcola la direzione del movimento da fotogramma a fotogramma.
Per sessioni con due topi, è necessario tracciare due oggetti. Selezionare e orientare i due oggetti con la maggiore superficie di pixel bianchi utilizzando lo stesso insieme di comandi. Il software verifica automaticamente i baricentri da fotogramma a fotogramma.
Se uno dei due oggetti cambia dimensione di oltre il 20% o se un baricentro si sposta oltre la distanza percorribile da un topo, allora la soglia di binarizzazione viene aumentata automaticamente finché questi criteri non vengono soddisfatti. Il software verifica automaticamente i centri di gravità da un fotogramma all'altro. Se uno dei due oggetti cambia dimensione di oltre il 20% o se un centro di gravità si sposta oltre la distanza percorribile da un topo, allora la soglia di binarizzazione viene regolata automaticamente finché questi criteri non vengono soddisfatti.
Le interazioni vengono rilevate automaticamente quando gli oggetti sono entro due centimetri di distanza. Questi segmenti vengono riprodotti per l'inserimento da parte dell'utente. Per ogni segmento, etichettare la prospettiva del topo in esame come Evitamento sociale, Avvicinamento sociale o Nessuno dei due.
Per verificare l'analisi automatica, caricare il filmato utilizzando il pulsante Carica. Quindi fare clic su Avvia Sessione 1 per visualizzare il primo fotogramma di quella sessione. Utilizzare il comando Riproduci/Ferma per controllare la riproduzione.
I filmati elaborati mostrano ogni topo con un cerchio di colore diverso sulla testa e sulla coda. Inoltre, le misure di socialità vengono visualizzate a schermo e aggiornate durante la riproduzione. Correggere eventuali errori riscontrati nell'analisi automatizzata.
L'errore più comune è un'inversione testa-coda, che può essere corretta utilizzando uno strumento presente nell'interfaccia. Questo fenomeno si verifica in circa il 20% dei video. In rari casi di errori più complessi, di solito è possibile risolverli indicando manualmente la posizione del naso del topo in una determinata serie di fotogrammi video.
Dopo aver verificato, esportare i dati sulla socialità in un formato foglio di calcolo utilizzando la funzione Esporta. Per esportare i dati di più filmati come un unico foglio di calcolo, i filmati devono essere raggruppati in una singola cartella e l'operazione viene eseguita tramite la funzione Compila Dati. Nella sessione uno, un topo test BALB/c di quattro settimane è stato tracciato mentre si spostava tra i compartimenti 59 volte nel giro di 10 minuti.
Il tempo trascorso in ciascun compartimento è considerato un valore di base per la preferenza del compartimento in assenza di stimolo sociale. Nella seconda sessione, sono stati presentati un contenitore sociale e uno asociale con un topo ICR di quattro settimane nascosto. È stata osservata una chiara preferenza per il tempo trascorso nel compartimento sociale.
In particolare, il topo ha trascorso più tempo con la coppetta sociale rispetto a quella asociale. Nella terza sessione, le coppette sono state sollevate e ai topi è stato consentito interagire. In totale, sono stati effettuati 35 avvicinamenti sociali in 10 minuti.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica facilita uno screening più rapido di farmaci promettenti per migliorare il dominio sintomatologico principale rappresentato dalla sociabilità compromessa in modelli murini validati di disturbi dello spettro autistico. L'elaborazione automatizzata può essere adattata a diverse configurazioni di gabbie e specie. Qualsiasi comportamento di interesse può essere valutato, purché sia possibile sviluppare un algoritmo in grado di rilevarlo in modo affidabile.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per quantificare la socialità nei topi mediante l'analisi automatizzata di registrazioni video. L'approccio migliora l'efficienza dello screening della socialità nei modelli murini dei disturbi dello spettro autistico.
Componenti Chiave dello Studio
Settore Scientifico
- Neuroscienze
- Analisi del Comportamento
- Ricerca sull'Autismo
Sfondo
- La valutazione della socialità nei topi è fondamentale per comprendere i comportamenti sociali.
- I metodi tradizionali sono lunghi e richiedono molto lavoro.
- L'analisi automatizzata può ridurre in modo significativo il tempo necessario per le valutazioni della socialità.
- Questo metodo è particolarmente rilevante per lo screening farmacologico nella ricerca sull'autismo.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo efficiente in termini di tempo per la quantificazione della socialità nei topi.
- Facilitare lo screening rapido di composti che potrebbero potenziare la socialità.
- Migliorare l'accuratezza e l'affidabilità delle valutazioni della socialità.
Metodi Utilizzati
- Registrazione video di topi in una gabbia appositamente progettata con tre compartimenti.
- Elaborazione automatizzata dei dati video per la quantificazione della socialità.
- Confronto dei risultati con i metodi tradizionali di screening visivo.
- Dimostrazione del processo di analisi automatizzata.
Risultati principali
- Il metodo automatizzato fornisce misurazioni della socialità accurate e affidabili.
- Riduce in modo significativo il tempo necessario per le valutazioni della socialità.
- Consente uno screening efficiente di farmaci in modelli murini.
- Efficacia dimostrata in un reale contesto sperimentale.
Conclusioni
- L'analisi automatizzata è uno strumento prezioso per valutare la socialità nei topi.
- Questo metodo può accelerare la ricerca nei disturbi dello spettro autistico.
- Studi futuri possono basarsi su questo approccio per ulteriori indagini comportamentali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La quantificazione automatizzata della socialità nei topi consente uno screening rapido di composti mirati a deficit del comportamento sociale in modelli validati dei disturbi dello spettro autistico. Riducendo il tempo di valutazione da oltre 50 ore per dose a un'elaborazione efficiente in lotti, questo metodo supporta la validazione ad alto rendimento di bersagli e l'identificazione di composti promettenti. Fornisce letture comportamentali quantitative e riproducibili che migliorano l'affidabilità predittiva nelle decisioni iniziali della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Quantifica la socialità attraverso il tempo trascorso vicino a stimoli sociali rispetto a stimoli non sociali e attraverso i conteggi di avvicinamento sociale, consentendo un'analisi meccanicistica delle ipotesi terapeutiche.
- Valore operativo: Il tracciamento automatico del muso e l'analisi del movimento eliminano la valutazione manuale, aumentando la produttività e riducendo la variabilità tra osservatori.
- Valore predittivo: Genera metriche di socialità dose-dipendenti che supportano la riduzione del rischio sui bersagli e la selezione del portafoglio nella scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Un apparato standardizzato a tre compartimenti con analisi video automatizzata crea una piattaforma riproducibile per la valutazione della sociabilità.
- Risultati quantitativi: Misura le transizioni tra compartimenti, il tempo trascorso nella zona sociale e gli eventi di avvicinamento/evitamento sociale come variabili continue per lo screening di composti.
- Scalabilità: La capacità di elaborazione in batch consente di valutare più composti in parallelo, supportando il passaggio da hit a lead.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella direttamente l'alterazione della socialità, un dominio sintomatico centrale nei disturbi dello spettro autistico, consentendo l'allineamento traslazionale dei biomarcatori.
- Continuità preclinica: Permette la valutazione longitudinale dei cambiamenti nella socialità in diversi regimi terapeutici utilizzando modelli murini validati.
- Decisioni basate sul rischio: Dati oggettivi sulla socialità guidano decisioni di avanzamento o interruzione riducendo l'ambiguità meccanicistica nei fenotipi comportamentali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del capostipite fino alla valutazione dell'efficacia preclinica, fornendo la socievolezza come parametro quantificabile per composti che modulano il comportamento sociale.
- Biologia della scoperta: Permette la valutazione basata su ipotesi dei meccanismi della socialità quantificando la preferenza per l'interazione sociale e i comportamenti di avvicinamento.
- Screening: Fornisce punteggi di socialità standardizzati e automatizzati che supportano la riproducibilità dei saggi e il confronto tra composti su diverse piastre e giorni.
- Analisi dati: Genera indici numerici di socialità (tempo, transizioni, numero di avvicinamenti) che facilitano l'analisi statistica e la modellizzazione delle relazioni struttura-attività.
- Ricerca traslazionale: Stabilisce un collegamento con la rilevanza clinica modellando un dominio diagnostico fondamentale dell'autismo, sostenendo la validazione preclinica allineata ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Il flusso di lavoro automatizzato si adatta a diversi design di gabbie e specie, consentendo applicazioni trasversali nei programmi di farmacologia comportamentale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce misure oggettive e quantitative della sociabilità che riducono la soggettività e aumentano la fiducia nel coinvolgimento del bersaglio.
- Valore operativo: L'automazione riduce il tempo di manipolazione diretta per saggio da ore a minuti, consentendo campagne di screening ad alto rendimento.
- Valore strategico: Accelera l'ottimizzazione del composto fornendo un rapido riscontro sulla sociabilità, migliorando l'efficienza del capitale nei programmi del sistema nervoso centrale.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei composti aggiustata per il rischio, basata su profili robusti di sociabilità in modelli pertinenti alla malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in neuroscienze comportamentali e algoritmi di tracciamento video per la configurazione e la validazione.
- Necessita di un'illuminazione standardizzata, di capacità in infrarosso e di una telecamera con risoluzione minima di 720x480 per un rilevamento affidabile del naso.
- Richiede tempistiche costanti delle sessioni e un posizionamento dei stimoli bilanciato per evitare bias di posizione.
- Comporta una verifica manuale dell'orientamento testa-coda in circa il 20% dei video per correggere errori di tracciamento automatico.
- Dipende dall'adeguamento della soglia di binarizzazione per mantenere l'accuratezza del tracciamento in condizioni variabili di illuminazione e tra diverse linee di topi.
