Determinazione Membrane Protein Topologia Usando fluorescenza Protease Protection (FPP)

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la topologia delle proteine integrali di membrana. Ciò si ottiene mediante l'espressione del versamento, delle proteine tra la proteina fluorescente verde o GFP e le code amminiche o carbossiliche della membrana. Proteina di interesse nelle cellule a scopo di controllo, possono essere espresse proteine fluorescenti solubili come RFP.

Successivamente, la membrana plasmatica è soggetta a permeazione selettiva. Utilizzando il detergente dig, le proteine fluorescenti solubili usciranno dalla cellula, mentre le proteine fluorescenti legate alla membrana verranno trattenute all'interno della cellula. La fase finale è l'applicazione di una proteasi alle cellule permeabili e la determinazione della ritenzione o della perdita del segnale fluorescente.

In definitiva, i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza osservati utilizzando l'imaging al microscopio a fluorescenza vengono utilizzati per mostrare la topologia e l'orientamento delle proteine integrali della membrana. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la mappatura degli epitopi, è che la procedura non richiede molte attrezzature specializzate o vari reagenti che potrebbero essere difficili da reperire. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia delle proteine di membrana, come ad esempio quali domini di una proteina integrale di membrana possono essere localizzati all'interno del citosol rispetto a quali domini possono essere situati all'interno del lume di organelli come il reticolo endoplasmatico G d'oro o gli endosomi.

Iniziare questa procedura con la generazione e la convalida della proteina fluorescente KY come descritto nel protocollo di testo. Quindi trasfettare la proteina fluorescente KY in cellule renali embrionali umane o cellule HEK 2 93 utilizzando qualsiasi metodo di trasfezione standard ad alta efficienza e bassa tossicità, comprese le tecnologie basate su lipidi, virali o elettroporazione per generare un'espressione transitoria o stabile, le cellule vengono quindi piastrate su vetrini coprioggetti rivestiti di polilisina. Mantenere le cellule per un periodo compreso tra cinque e 48 ore in un incubatore per colture tissutali appropriato a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture tissutali compatibile con anidride carbonica.

Monitorare le cellule per l'espressione della proteina di fusione GFP utilizzando la microscopia a epifluorescenza e il segnale fluorescente intrinseco del segnale fluorescente GFP di solito raggiunge un massimo entro 24-72 ore. Dopo la trasfezione. L'uso delle cellule quando il segnale fluorescente raggiunge un livello massimo di espressione proteica può anche essere monitorato mediante analisi immuno blot utilizzando anticorpi diretti contro la proteina di interesse o la porzione GFP.

Per iniziare, impostare il sistema di perfusione alimentato a gravità per il trattamento delle cellule. Preparare siringhe da 50 millilitri per soluzioni con tubo in polietilene collegato a serbatoi indipendenti e a un collettore con un'unica uscita nel bagno. Posizionare una pipetta di aspirazione per mantenere un volume costante del bagno e ottenere lo scambio di soluzione passando manualmente tra i serbatoi di perfusione per la permeazione della membrana plasmatica.

Innanzitutto, rimuovere il terreno di coltura cellulare dalle cellule. Lavare le celle tre volte per un minuto ciascuna. Nel tampone KHM, posizionare i vetrini coprioggetti su un tavolino per microscopio a fluorescenza e raccogliere la prima immagine, che rappresenta l'immagine non permeabile di controllo per permeare selettivamente la membrana plasmatica.

Aggiungere la digit toin nel tampone KHM alle celle, perfondere le celle con il buffer più la digit toin a una velocità di cinque millilitri al minuto per 10-60 secondi. La conferma che la membrana plasmatica è adeguatamente permeabile è facilmente ottenuta dall'espressione di una molecola solubile di GFP o RFP, che si diffonderà prontamente fuori dalla cellula seguendo la membrana. La permeazione conferma quindi che il chimero della proteina GFP di interesse è integrato nella membrana confermando la ritenzione cellulare del segnale fluorescente dopo il digon e la permeazione della membrana plasmatica.

Successivamente, esprimere una proteina fluorescente specifica dell'organo come una proteina mitocondriale come indicato nel protocollo di testo. Determinare le condizioni ottimali di espressione come prima. Confermare che lo scavo e la concentrazione siano appropriati per il tipo di cellula impiegato, assicurandosi che la morfologia dei canali degli organi intracellulari rimanga costante per un'esposizione prolungata.

Per scavare. Dopo aver lavato le cellule nel tampone KHUM, aggiungere la proteasi direttamente sulle cellule. Esaminare le cellule a una velocità di flusso di cinque millilitri al minuto, utilizzando un sistema di perfusione alimentato a gravità per bagnare continuamente la preparazione.

Quindi, determina se il segnale fluorescente persiste o si degrada. Raccogli le immagini al microscopio fluorescente con i set di filtri appropriati utilizzando la funzione di acquisizione delle immagini video su un microscopio fluorescente controllato da computer. Quantificare l'intensità del segnale fluorescente in funzione della condizione di incubazione.

Ottenere l'intensità media dei pixel all'interno di una regione di interesse che racchiude una singola cella. Una perdita superiore al 90% dell'intensità del segnale iniziale nell'arco di 30-60 secondi è coerente con la degradazione proteolitica della proteina GFP ky. La completa scomparsa del segnale fluorescente solubile dovrebbe verificarsi entro 10-60 secondi dall'applicazione della digit toin.

La conferma che la proteina di interesse è associata agli organelli intracellulari si ottiene notando la ritenzione del segnale fluorescente dopo il digon e la permeazione. La coda carbossilica della chinasi LTK two ancorata alla membrana è stata fusa con GFP ed ha espresso ltk transitoriamente fluorescente. Due segnali GFP sono stati persi rapidamente dopo l'aggiunta della proteinasi K, indicando la posizione del terminale carbossilico di ltk due è all'interno del citosol.

Cavi e GFP è una proteina di membrana plasmatica con una porzione GFP attaccata al dominio citosolico. Come per LTK due, il segnale proveniente da cavi e GFP è insensibile alle dita, ma sensibile alla successiva aggiunta di proteasi DS red mito codifica per la proteina fluorescente rossa fusa alla sequenza di targeting mitocondriale dalla citocromo C ossidasi dopo la permeazione del digon, così come l'aggiunta di proteinasi K.La fluorescenza associata al DS red mito rimane stabile. Ciò è coerente con il fatto che il Fluor 4 si trova nei mitocondri dove non è esposto al citosol.

Quando la porzione fluorescente attaccata a una proteina di membrana è rivolta verso l'esterno della cellula, come nella proteina prionica ancorata GPI attaccata alla proteina fluorescente gialla. Il trattamento con proteinasi dovrebbe estinguere rapidamente il segnale fluorescente senza la necessità preventiva di permeazione di dig imp come previsto. Dopo il trattamento con proteinasi, il segnale fluorescente extracellulare è scomparso rapidamente per le cellule che esprimono questo costrutto.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una o due ore se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una maggiore comprensione di come determinare la topologia della tua proteina di membrana di interesse.