Name: Determinazione Membrane Protein Topologia Usando fluorescenza Protease Protection (FPP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Scopri come determinare la topologia delle proteine di membrana nelle cellule viventi utilizzando la protezione da proteasi fluorescente con chimere GFP. Questo metodo permette di analizzare l'orientamento proteico in modo affidabile.

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Desideriamo ringraziare la Calcium Imaging Core Facility di CMS per il loro aiuto e la loro guida nell'acquisizione e nell'analisi delle immagini. Questo studio è stato supportato dal National Institutes of Health (NIH) degli Stati Uniti HL102208 a N.A.B. Questo approccio è stato originariamente sperimentato da Holger Lorenz e Jennifer Lippincott-Schwartz al NIH.

1. Generazione e convalida delle Chimere proteina fluorescente <ol><li> Append proteina fluorescente verde (GFP) alla ammino o carbossile termini della proteina di interesse utilizzando strategie di DNA ricombinante standard di 13. NOTA: Anche se abbiamo utilizzato ampiamente GFP, altre varianti come la proteina ciano fluorescente (PCP), proteina fluorescente gialla (YFP), DsRed e mCherry possono essere impiegati. Miglioramenti in fluoroforo pieghevole efficienza, luminosità e fotostabilità vengono costantemente effettuati, e gli investigatori devono avvalersi dei costrutti di ultima generazione. <ol><li> Confermare sequenza di DNA corretta e assicurarsi che la frazione GFP è in cornice con la proteina di interesse. Eseguire sequenziamento utilizzando strategie di DNA ricombinante normali 21. NOTA: Molte istituzioni hanno servizi DNA di base, che il ricercatore è incoraggiato a contattarci per ulteriori informazioni. </li><li> Per proteine ​​di membrana passaggio singole o doppie, generareentrambe le versioni terminali ammino- e carbossilici delle proteine ​​di fusione 19. </li><li> Per le proteine ​​di multi-spanning inserire GFP all&#39;interno di cicli extramembrane putativi, così come il termini. Prestare particolare attenzione quando si generano chimere transmembrana con la proteina di fusione fluorescenti attaccato al capolinea amino della proteina bersaglio come sequenze di segnali sono spesso spaccati dalla proteolisi una volta che la proteina è passato attraverso il translocon ER. </li><li> Nel caso di sequenze di segnali esistenti, inserire la proteina di fusione fluorescenti distale al sito di scissione in modo da generare una proteina matura contenente una proteina fluorescente tag intatto ammino-terminale. Impiegare strategie DNA ricombinante standard per la generazione di chimere 21. </li></ol></li><li> Determinare la presenza del segnale fluorescente sufficienti opportunamente localizzata nella linea cellulare di interesse. <ol><li> Osservare le cellule sotto epifluorescenza utilizzando la fluorescenza intrinseca di GFP sotto ademangiato condizioni di filtro impostato. Per set di filtri GFP che comprendono 510-560 nm, confermano che i filtri corretti sono utilizzati per il fluoroforo impiegato. NOTA: Un segnale sufficiente si ottiene quando la valutazione ad occhio fornisce un segnale abbastanza forte che la struttura cellulare all&#39;interno della quale risiede il segnale viene facilmente risolto sopra sfondo. Inoltre il pattern di colorazione della proteina-GFP deve essere coerente con quello dei marcatori per la organello appropriata, e preferibilmente identica a quella della proteina nativa non etichettato. </li></ol></li><li> Determinare se un approccio stabile o transiente trasfezione sarà utilizzato basa la proteina in corso di valutazione. NOTA: trasfettanti stabili generalmente offrono bassi livelli di espressione rispetto ai sistemi transitori. Sebbene espressione transiente produce espressione elevato livello di proteine ​​e aumento dell&#39;intensità di segnale (~ 5-24 ore dopo la trasfezione seconda proteina), può anche portare ad artefatti iperespressione come proteine ​​aggregation o la saturazione di proteine ​​di targeting percorsi, portando a localizzazione subcellulare erronea. </li></ol> 2. Trasfezione delle cellule e colture cellulari NOTA: Una varietà di cellule sono suscettibili di analisi FPP, tra cui HEK293, HeLa, COS-7 e cellule CHO 14. La seguente descrizione è basata su esprimenti proteine ​​di membrana in cellule HEK293. <ol><li> Grow cellule umane embrionali renali (HEK293) come monostrati aderenti a 6 ml di Dulbecco modificato (DMEM), integrato con siero 5% fetale bovino (FBS), 1% piruvato di sodio, e 250 mg / ml di penicillina / streptomicina a 37 ° C con il 5% di CO 2. Eseguire il lavoro con le cellule in coltura tissutale cappa a flusso laminare. Grow cellule in mezzo di coltura fino ~ 80% confluenti in un pallone T-75. </li><li> Cellule trasfettare utilizzando qualsiasi alta efficienza standard metodo trasfezione bassa tossicità, compresi lipid-, tecnologie viral- o basati elettroporazione, per generare transient o espressione stabile. Tipicamente 2 mg di plasmide DNA per 1 x 10 6 cellule dà buona espressione proteica riproducibili. Mantenere cellule per 5-48 ore in appropriate terreni di coltura tissutale a 37 ° C in un CO 2 in grado di coltura tissutale incubatore. </li><li> Monitorare le cellule per l&#39;espressione della proteina GFP-fusion con epifluorescenza, utilizzando il segnale di fluorescenza intrinseca di GFP, utilizzando appositi set di filtri secondo il protocollo del produttore. Segnale di fluorescenza di solito raggiunge un massimo entro 24-72 ore dopo trasfezione. Utilizzare cellule quando il segnale di fluorescenza raggiunge un livello massimo. Monitorare i livelli di espressione della proteina mediante analisi immunoblot utilizzando anticorpi diretti contro la proteina o di interesse o porzione GFP. </li><li> Per le celle sperimentali piastra analisi su vetrini rivestiti. Visualizza sia sotto una configurazione live-cell o dopo la fissazione e montare su vetrini microscopia. Cellule piastra per raggiungere il 60% -80% di confluenza entro 24-48 ore. <ol><li> Coprioggetto Coat con la soluzione di poli-lisina (0,1 mg / ml), in modo che l&#39;intera superficie è coperta. Incubare per 30 minuti sotto una luce ultravioletta a temperatura ambiente, seguito da 60 minuti in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C. Rimuovere l&#39;eccesso poli-lisina e lavare i coprioggetti in PBS 3 volte. </li><li> In alternativa, piastra le cellule su una copertura in vetro a camera composta da piastre di coltura cellulare con un fondo di vetro ottico per consentire l&#39;imaging diretto con obiettivi ad immersione in olio. La configurazione effettiva microscopia dipende apparecchiature disponibili al ricercatore, ma dovrebbe essere in grado di soluzione cambia rapidi. A seconda della forma tipo di cellula e cellula, cellule dovrebbe essere circa 60-90% confluenti al momento del dosaggio FPP. </li></ol></li></ol> Setup 3. microscopia a fluorescenza <ol><li> Utilizzare una apertura numerica (NA) dell&#39;obiettivo alta ad immersione in olio per la raccolta del segnale massima e risoluzione spaziale, come ad esempio un 60X, 1,42 NA obiettivo ad immersione. Usa the dopo il laser per stimolare i fluorofori: gas Argon 488 nm (GFP e YFP) e 561 diodo (RFP, mCherry). </li><li> Determinare l&#39;esposizione, il guadagno e la cattura tasso ottimale di immagini per ogni costrutto. Regolare intensità del laser e tempo di esposizione per minimizzare photobleaching (vedi punto 7.1.2). </li><li> Per gli studi che utilizzano più fluorofori (ad esempio, un marker solubile per permeabilizzazione della membrana in concerto con un pennarello proteina di membrana), scegliere filtro appropriato imposta per ridurre al minimo segnale di cross-talk e massimizzare rapporti segnale-rumore. </li></ol> 4. Stabilire le condizioni ottimali per membrana plasmatica Permeabilization <ol><li> Rimuovere il terreno di coltura di cellule da cellule che esprimono solo proteine ​​fluorescenti solubili (es EGFP, DsRed). Lavare le cellule 3 volte (1 min ciascuno) in tampone KHM (110 mM potassio acetato, 3 mM MgCl 2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Effettuare esperimenti con cellule e tutti i reagenti a temperatura ambiente. </li><li> Luogo cellule on coprioggetto (vedi punto 2.4) in tampone KHM su un palco microscopio a fluorescenza e raccolgono la prima immagine, che rappresenta il controllo &#39;non-permeabilizzate&#39; stage. </li><li> Per permeabilize selettivamente la membrana plasmatica, aggiungere digitonina (30 mM) in tampone KHM alle cellule. Profumato cellule con tampone (buffer + digitonina) ad una velocità di 5 ml / min per 10-60 sec. </li><li> Determinare la concentrazione ottimale digitonina aumentando gradualmente la concentrazione di digitonina. La concentrazione digitonina ottimale si ottiene quando vi è perdita completa del segnale di fluorescenza da EGFP solubile entro 10-60 secondi di applicazione digitonina. Per molte cellule applicazione di 10-50 mM digitonina è sufficiente permeabilize membrana cellulare. <ol><li> Per tutte le applicazioni utilizzano la concentrazione più bassa possibile di digitonina. Raccogliere le immagini dopo digitonina permeabilizzazione per permeabilizzate segnale di fondo. </li></ol></li><li> Verificare che la chimera GFP-proteina di interesse è membranategrated confermando ritenzione cellulare del segnale di fluorescenza seguente permeabilizzazione digitonina della membrana plasmatica 16. <ol><li> Esprimere una proteina fluorescente organello specifico 23. Proteine ​​mitocondriali funzionano bene in questo senso 16, ad esempio, pDsRed2-Mito vettoriale. Determinare le condizioni ottimali di espressione come descritto al punto 2.1. </li><li> Verificare che la concentrazione digitonina è appropriato per il tipo cellulare impiegato assicurando che la morfologia di organelli intracellulari rimane costante nel prolungato (fino a 60 min) esposizione a digitonina. NOTA: utilizzare protocolli standard di immunofluorescenza con anticorpi contro vari compartimenti cellulari, come lisosomi (es LAMPADA1), Golgi (ad esempio, TGN38), reticolo endoplasmatico (ad esempio, calnexina), endosomi (ad esempio, Rab5), mitocondri (ad esempio, citocromo c). Se organelli intracellulari modifiche morfologia / integrità drammaticamente over 60 min, è probabile che la concentrazione digitonina era troppo alta, e richiede una riduzione della concentrazione digitonina e / o tempo di esposizione. NOTA: Digitonin è tossico per inalazione e contatto con la pelle. Indossare appropriati dispositivi di protezione individuale (DPI). </li></ol></li></ol> 5. Protease Trattamento di proteine ​​fluorescenti <ol><li> Lavare le cellule in tampone KHM e quindi aggiungere proteasi (proteasi K; 50 mg / ml in tampone KHM) direttamente sulle celle. Profumato cellule ad una velocità di flusso di 5 ml / min usando un sistema di perfusione a gravità alimentata alla vasca continuamente la preparazione. <ol><li> Soluzioni negozio in 50 ml siringhe e tubi di polietilene collegati serbatoi indipendenti ad un collettore con una singola presa al bagno (portata 5 ml / min). Posizionare una pipetta di aspirazione per mantenere una (0,5 ml) Volume vasca costante e conseguire scambio soluzione commutare manualmente i serbatoi di perfusione. </li></ol></li><li> Raccogliere immagini per determinare se il fluorSegnale escent persiste o si degrada. Una perdita di&gt; 90% dell&#39;intensità del segnale iniziale tramite 30-60 sec è coerente con la degradazione proteolitica della chimera GFP-proteina (vedi Risultati rappresentativi). </li><li> Se nessuna degradazione del segnale si osserva con proteinasi K, quando si prevede tale perdita, sostituire la soluzione di proteinasi K con tripsina (4-8 mM) in tampone KHM. Se necessario, utilizzare una miscela di proteinasi K e tripsina. Non vi è alcuna necessità di spegnere l&#39;attività della proteasi. </li></ol> 6. Approccio per plasma proteine ​​di membrana con domini esterni Alternative <ol><li> Per proteine ​​di membrana plasmatica, eseguire il test per le proteine ​​fluorescenti esterni chimere prima di digitonina permeabilizzazione. Lavare le cellule su vetrini in tampone KHM (5 ml / min x 3 min), e prendere una immagine per il trattamento pre-proteasi e quantificare segnale di fluorescenza pre-proteasi come al punto 7. </li><li> Esporre le cellule di proteasi (proteinasi K; 50 mg / ml o tripsina 4-8 mm in tampone KHM) in tha assenza di digitonina mediante perfusione le cellule con KHM supporto contenente proteasi (portata 5 ml / min). Raccogliere immagini della proteina fluorescente, per determinare quanto velocemente il segnale scompare e per quanto tempo il segnale persiste. </li><li> Prima permeabilizzazione digitonina, spegnere tutte le attività della proteasi, lavando le cellule tre volte (1 min ciascuno) in mezzi di coltura cellulare contenente siero 10% (FBS). </li><li> Lavare le cellule mediante perfusione con tampone KHM (velocità di flusso di 5 ml / min) per 2 min. Acquisire un&#39;immagine pre-permeabilizzazione. Permeabilize la membrana cellulare, come descritto al punto 4. </li><li> Raccogliere le immagini seguenti proteasi Inoltre, come descritto al punto 5. </li></ol> Analisi 7. Immagine <ol><li> Utilizzare un microscopio invertito in grado di &quot;cellule vive&quot; di registrazione, in cui la perdita del segnale di fluorescenza può essere monitorato in tempo reale. Per il monitoraggio continuo, impiegare parametri identici (tempo di esposizione, il guadagno, intensità laser, ecc). <ol><li> Determinare experparametri imental osservando il segnale di fluorescenza dalla GFP-proteina di interesse in condizioni di controllo (ad esempio, KBH tampone da solo). Regolare le impostazioni di tempo guadagno, intensità di esposizione laser e sul microscopio computer guidato per garantire che non vi è alcuna perdita apprezzabile di intensità del segnale in un periodo di 10-20 minuti. NOTA: intensità del segnale non è un valore assoluto, ma si basa sul sistema microscopio e impostazioni disponibili per ciascun PI. Monitorare i cambiamenti di intensità di fluorescenza relativa. </li></ol></li><li> In alternativa, il trattamento di cellule a set punti temporali in digitonina seguito da proteasi, e fissare le cellule prima del montaggio su vetrini per l&#39;imaging. Determinare punti di tempo a seguito empiricamente procedure nei passaggi 4 e 5. Per l&#39;indagine iniziale, partono da 0, 30, 60, 120 e 300 sec dopo aggiunta di digitonina o proteasi. <ol><li> Fissare cellule (20 min a temperatura ambiente) con una quantità sufficiente di fissativo (3,7% paraformaldeide in PBS) per immergere completamente thcellule e. </li><li> Quench paraformaldeide residua sciacquando cellule con PBS contenente glicina 20 mm (3 x 5 min). </li><li> Mount coprioggetto rimuovendo il liquido in eccesso dal vetrino e invertendo il vetrino su un supporto di montaggio 50 microlitri su un microscopio Vetrini per l&#39;imaging. Lasciare i vetrini si asciughino durante la notte prima di imaging. </li></ol></li><li> Raccogliere immagini al microscopio a fluorescenza (sotto i filtri appropriati imposta compatibile con il fluoroforo utilizzato) utilizzando la funzione di cattura dell&#39;immagine video su un microscopio a fluorescenza computer controllato. </li><li> Quantificare intensità di segnale fluorescente in funzione della condizione di incubazione. Ottenere l&#39;intensità dei pixel media all&#39;interno di una regione di interesse (ROI) che racchiude una singola cella. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

L&#39;orientamento e la topologia corretta delle proteine ​​di membrana è essenziale per il loro corretto funzionamento. Nonostante l&#39;importanza di comprendere la topologia proteina di membrana, ci sono molte proteine ​​per i quali i dati sono del tutto carenti. FPP fornisce un modo semplice ed efficace per determinare topologia proteina di membrana, e uno che può essere eseguita dalla maggior parte dei laboratori. L&#39;approccio FPP offre vantaggi significativi rispetto ai metodi precedenti per la determinazione d...

Le membrane plasmatiche, nonché numerose membrane intracellulari, servono come barriere che separano due compartimenti acquosi. Nel caso della membrana plasmatica, la separazione è tra l&#39;esterno e l&#39;interno della cella; per organelli intracellulari che è tra il citoplasma e il lume organelli. Ad esempio, la membrana del reticolo endoplasmatico (ER) separa un ambiente ossidante all&#39;interno del lume del ER da un citosolico riducendo ambiente 1. Le proteine ​​di membrana sono sintetizzate sui ribosomi ER-associata, e raggiungere il loro topologia finale entro la membrana ER 2. L&#39;acquisizione di un adeguato orientamento membrane e topologia per le proteine ​​è fondamentale per la loro normale funzione. Topologia corretta permette pertinenti domini di proteine ​​di membrana per interagire con i partner di legame, permette critici modificazioni post-traduzionali a verificarsi, e nel caso delle proteine ​​di membrana di plasma, permette alla cellula di interagire con e rispondere to suo ambiente. Per apprezzare appieno la funzione di una proteina di membrana, è chiaramente indispensabile sapere come tale proteina è orientato rispetto alla membrana entro cui risiede, cioè la sua topologia membrana. Oltre alla acquisizione di conoscenze scientifiche di base, comprendere la topologia di una proteina di membrana e quali aspetti di una superficie proteine ​​sono esposte ad ambienti differenti ha segnato implicazioni cliniche poiché proteine ​​di membrana sono la maggioranza dei bersagli farmacologici 3. Fino a poco tempo, approcci per determinare la topologia di proteine ​​di membrana hanno richiesto un notevole investimento di tempo e di denaro o hanno richiesto reagenti che sono difficili da trovare. Sia approcci sperimentali e in silico sono stati impiegati per determinare la topologia di proteine ​​di membrana che risiedono all&#39;interno della membrana plasmatica. Dal momento che le prime previsioni di domini di membrana attraversa basati sulla idrofobicità valutato di indiviaminoacidi doppio 3, numerosi algoritmi predittivi sono ora disponibili su internet, e semplicemente richiedono la conoscenza della sequenza aminoacidica della proteina. Tuttavia, le ipotesi sono spesso al centro di tali programmi di modellazione, ipotesi che possono portare alle assegnazioni errate di topologia 4,5. Inoltre, mentre le previsioni basate su computer è possibile assegnare provvisoriamente le regioni che vanno a membrana, che non sempre determinano se la amino o carbossi-terminale di proteine ​​sono nel citoplasma, lume organelli o esterno cella. Anche con maggiore potenza di calcolo, e l&#39;uso di algoritmi di apprendimento macchina 6, tali dati è ancora un modello, e deve essere convalidato utilizzando i dati acquisiti sperimentalmente. Determinazione diretta sperimentale di topologia di membrana è stata effettuata utilizzando pannelli di anticorpi monoclonali con epitopi noti distribuite in tutta la proteina, in cui è stata effettuata la valutazione della loro immunoreattività prima e dopo permeabilizzazione cellulare. Questoapproccio richiede una serie di anticorpi, che non possono essere disponibili per la proteina di interesse. Una strategia alternativa è quella di progettare etichette epitopi quali myc o emoagglutinina (HA) in varie località in tutta la proteina, ancora una volta seguita da determinazione della immunoreattività prima e dopo permeabilizzazione della membrana. Oltre ai tag immunogenico, tag enzimatici (compresi fosfatasi alcalina, β-galattosidasi, o β-lattamasi) e modificazioni chimiche come la scansione cisteina sono stati tutti impiegati per determinare membrana proteica topologia 7,8. Un ulteriore metodo impiegato per la mappatura topologica delle proteine ​​di membrana plasmatica si basa su un approccio leggermente diverso per tag epitopi. In questo metodo la sequenza di tag è la sequenza di consenso glicosilazione N-linked NXS / T. Poiché glicosilazione avviene solo quando tale sequenza è presente nel lume della via biosintetica, la presenza del tag in un luminale controun compartimento citosolico è facile osservare come spostamento di massa su gel SDS-PAGE. Tale approccio è stato applicato al canale ionico multispanning CFTR 9. Mentre tutti questi approcci sono stati utilizzati, è chiaro che tutti richiedono notevoli investimenti nel campo della biologia molecolare per generare e la sequenza dei costrutti molteplici. Per determinare le informazioni topologiche riguardanti proteine ​​transmembrana situati all&#39;interno organelli intracellulari ha dimostrato di essere più impegnativo. L&#39;applicazione di tecnologie basate fluorescenza tuttavia, ha fatto la determinazione della topologia di membrana molto più semplice. La tecnica di bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) si basa sulla interazione tra due frammenti non fluorescenti di una proteina fluorescente, ripristinando le proprietà fluorescenti di quella proteina 10. Sebbene inizialmente descritto per determinare le interazioni proteina-proteina in vivo 10, questo approccio è anche stato utilizzatoper determinare membrana proteica topologia nelle cellule vegetali 11. Tuttavia questo approccio è anche tempo intenso in quanto richiede la generazione non solo di proteine ​​di fusione con la proteina di interesse, ma anche una varietà di proteine ​​di fusione mirati al citosol o organelli lume, e richiede la cui conoscenza intracellulare membrane proteina di interesse risiede in . Un approccio alternativo alla semplice determinazione topologia proteina di membrana è stato descritto 12. Il saggio di fluorescenza proteasi protezione (FPP) richiede la generazione di una proteina di fusione tra GFP e il gene di interesse. L&#39;approccio è basato sulla relativa accessibilità di proteasi non specifici per la frazione GFP; a seconda che GFP è protetto dalla proteolisi risiedendo nel lume di organelli intracellulari o è esposto alla proteolisi essendo presenti nel citosol. Pertanto, se la frazione GFP sulla proteina di interesse affaccia citoplasma, sarà esposto aattività proteasica e il segnale di fluorescenza persi. Al contrario, se la frazione GFP sulla proteina di interesse affaccia un ambiente &#39;protetto&#39; dalla proteasi (come il lume Golgi) allora il segnale di fluorescenza persisterà. Per consentire proteasi di entrare nella cellula, ma non immettere compartimenti intracellulari membrana farmaco vincolante colesterolo digitonina viene utilizzato. Il colesterolo è sterolo dominante in vertebrati, ed è specificamente arricchito nella membrana plasmatica rispetto al compartimenti intracellulari. La tossina glicoside, digitonina, viene estratto dalla pianta Digitalis purpurea. Digitonin ha un&#39;affinità per colesterolo ricchi membrane, dove si porta a membrana selettiva permeabiliztion 14,16 (figura 1). Oltre a consentire l&#39;uscita dei piccoli componenti citosolici, permeabilizzazione digitonina permette anche l&#39;ingresso di molecole esogene quali proteinasi K o tripsina. Il protocollo FPP sfrutta il fact che la membrana plasmatica contiene fino al 80% del colesterolo cellulari 17, mentre altri organelli, come ER, Golgi, endosomi, i mitocondri, che hanno molto basso contenuto di colesterolo, rimangono intatti 14. L&#39;incorporazione selettiva di colesterolo nella membrana plasmatica è stata osservata in molte cellule eucariotiche, permettendo l&#39;uso di digitonina-dipendente permeabilizzazione della membrana plasmatica in tali diverse specie eucariotica come S. cerevisiae di umana 14,18. Il dosaggio FPP fornisce un mezzo semplice, rapido e abbastanza robusti di determinazione (a) se una proteina è legato alla membrana / o associati liberamente diffusibile nel citosol e (b) che dominio di una proteina di membrana affronta citosol o organelli lumen. Qualora una proteina di membrana avere più orientamenti, il segnale sorgerà dalla forma dominante e non verrà rilevato forme minori. Mentre ci può essere qualche preoccupazione che l&#39;aggiunta di una frazione GFP alla proteina di interesse può influire sulla sua funzione e/ O localizzazione subcellulare, questo è in realtà più teorica che reale. Infatti molti studi hanno chiaramente dimostrato che il tag GFP non altera le proprietà della proteina 19,20.

<table><tbody><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Cav1-GFP</td><td>Addgene</td><td>44433</td><td></td></tr><tr><td>pAcGFP-1 Golgi</td><td>Clontech</td><td>632464</td><td></td></tr><tr><td>Polilisina</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Mezzi di montaggio</td><td>Dako</td><td>cS704</td><td></td></tr></tbody></table>

determinazione membrane protein topologia usando fluorescenza protease protection (fpp)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

La corretta topologia e orientamento delle proteine integrali di membrana sono essenziali per il loro corretto funzionamento, ma tali informazioni non sono state stabilite per molte proteine di membrana. Viene presentata una semplice tecnica chiamata protezione della proteasi a fluorescenza (FPP), che consente di determinare la topologia delle proteine di membrana nelle cellule viventi. Questa tecnica presenta numerosi vantaggi rispetto ad altri metodi per determinare la topologia delle proteine, in quanto non richiede la disponibilità di più anticorpi contro vari domini della proteina di membrana, non richiede grandi quantità di proteine e può essere eseguita su cellule viventi. Il metodo FPP impiega le azioni spazialmente confinate delle proteasi sulla degradazione delle proteine di membrana marcate con proteina fluorescente verde (GFP) per determinarne la topologia e l'orientamento. Questo semplice approccio è applicabile a un'ampia varietà di tipi di cellule e può essere utilizzato per determinare l'orientamento delle proteine di membrana in vari organelli subcellulari come i mitocondri, il Golgi, il reticolo endoplasmatico e i componenti del sistema endosomiale/di riciclaggio. Le proteine di membrana, marcate sia sui terminali N che sui C-terminali con una fusione GFP, sono espresse in una cellula di interesse, che è soggetta a permeabilizzazione selettiva utilizzando la digitonina detergente. La digitonina ha la capacità di permeabilizzare la membrana plasmatica, lasciando intatti gli organelli intracellulari. Le frazioni GFP esposte al citosol possono essere degradate selettivamente attraverso l'applicazione di proteasi, mentre le frazioni GFP presenti nel lume degli organelli sono protette dalla proteasi e rimangono intatte. Il test FPP è semplice e i risultati possono essere ottenuti rapidamente.

Plasma permeabilizzazione della membrana Efficient permeabilizzazione della membrana plasmatica è determinato mediante l&#39;uso di proteine ​​fluorescenti solubili (ad esempio, GFP, DsRed) (Passaggio 4). Queste proteine, quando espresso in cellule, sono liberi di diffondere nel citosol, e vengono persi quando la membrana plasmatica è permeabilizzate con digitonina (Figura 2). Una completa scomparsa del segnale fluorescente dovrebbe avvenire entro 10-60 sec...

Qui, presentiamo un protocollo per determinare l'orientamento e la topologia delle proteine integrali di membrana nelle cellule viventi. Questo semplice protocollo si basa sulla sensibilità selettiva alla proteasi delle chimere tra la proteina di interesse e la GFP.

Determinazione Membrane Protein Topologia Usando fluorescenza Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la topologia delle proteine integrali di membrana. Questo viene ottenuto esprimendo una proteina di fusione tra la proteina fluorescente verde o GFP e le estremità ammino o carbossiliche della proteina di membrana. A scopo di controllo, nelle cellule possono essere espresse anche proteine fluorescenti solubili, come RFP.Successivamente, la membrana plasmatica è sottoposta a permeazione selettiva. Utilizzando il detergente dig, le proteine fluorescenti solubili usciranno dalla cellula, mentre le proteine fluorescenti legate alla membrana verranno trattenute all'interno della cellula. L'ultimo passaggio consiste nell'applicazione di una proteasi sulle cellule rese permeabili e nella determinazione del mantenimento o della perdita del segnale fluorescente.In definitiva, le variazioni nell'intensità di fluorescenza osservate mediante imaging al microscopio a fluorescenza vengono utilizzate per mostrare la topologia e l'orientamento delle proteine di membrana integrale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la mappatura degli epitopi, è che la procedura non richiede molto equipaggiamento specializzato né diversi reagenti che potrebbero essere difficili da reperire. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia delle proteine di membrana, ad esempio quali domini di una proteina di membrana integrale possano trovarsi nel citosol rispetto a quali domini possano essere localizzati all'interno del lume di organelli come il reticolo endoplasmatico o gli endosomi.Iniziare questa procedura con la generazione e la validazione della proteina fluorescente KY come descritto nel protocollo testuale. Successivamente, trasfettare la proteina fluorescente KY in cellule renali embrionali umane o cellule HEK 293 utilizzando un qualsiasi metodo di trasfezione standard ad alta efficienza e bassa tossicità, inclusi approcci basati su lipidi, virus o elettroporazione, al fine di ottenere un'espressione transitoria o stabile. Le cellule vengono quindi seminate su coprivetrini rivestiti con polilisina. Mantenere le cellule da cinque a 48 ore in un mezzo di coltura tissutale appropriato a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari dotato di anidride carbonica.Monitorare le cellule per l'espressione della proteina fusione GFP mediante microscopia a fluorescenza in epifluorescenza; il segnale fluorescente intrinseco di GFP raggiunge generalmente un massimo tra le 24 e le 72 ore dopo la trasfezione. Utilizzare le cellule quando il segnale fluorescente ha raggiunto il livello massimo. L'espressione proteica può inoltre essere monitorata mediante analisi immunoistochimica (immunoblot) usando anticorpi diretti contro la proteina di interesse o contro la porzione GFP.Per iniziare, configurare il sistema di perfusione a gravità per il trattamento delle cellule. Preparare siringhe da 50 millilitri per le soluzioni, dotate di tubi in polietilene collegati a serbatoi indipendenti e a un collettore con un'unica uscita nel bagno. Posizionare una pipetta da aspirazione per mantenere costante il volume del bagno e ottenere lo scambio della soluzione passando manualmente tra i serbatoi di perfusione per la permeazione della membrana plasmatica.Prima di tutto, rimuovere il mezzo di coltura cellulare dalle cellule. Lavare le cellule tre volte per un minuto ciascuna. In tampone KHM, posizionare i coverslip sul palchetto di un microscopio a fluorescenza e acquisire la prima immagine, che rappresenta l'immagine di controllo non permeabile per permeabilizzare selettivamente la membrana plasmatica.Aggiungere digitonina nel buffer KHM alle cellule, perfondere le cellule con buffer contenente digitonina a un flusso di cinque millilitri al minuto per 10-60 secondi. La conferma che la membrana plasmatica è adeguatamente permeabilizzata può essere facilmente eseguita mediante l'espressione di una molecola GFP o RFP solubile, che diffonderà rapidamente all'esterno della cellula dopo la permeabilizzazione della membrana. Successivamente, confermare che la proteina chimerica di interesse è integrata nella membrana verificando il mantenimento del segnale fluorescente all'interno della cellula dopo la digitonina e la permeabilizzazione della membrana plasmatica.Successivamente, esprimere una proteina fluorescente specifica per un organulo, come ad esempio una proteina mitocondriale, come indicato nel protocollo testuale. Determinare le condizioni ottimali di espressione come in precedenza. Verificare che la digestione e la concentrazione siano appropriate per il tipo cellulare utilizzato assicurandosi che la morfologia dei canali intracellulari degli organuli rimanga costante durante esposizioni prolungate.Per scavare fino al toin. Dopo aver lavato le cellule nel buffer KHM, aggiungere la proteasi direttamente sulle cellule. Perfundere le cellule a una portata di cinque millilitri al minuto, utilizzando un sistema di perfusione a gravità per bagnare continuamente il preparato.Successivamente, determinare se il segnale fluorescente persiste o degrada. Acquisire immagini di microscopia fluorescente mediante l'apposita funzione di cattura video su microscopio fluorescente controllato dal computer, utilizzando i set di filtri appropriati. Quantificare le intensità del segnale fluorescente in funzione delle condizioni di incubazione.Ottenere l'intensità media dei pixel all'interno di un'area di interesse che racchiude una singola cellula. Una riduzione superiore al 90% dell'intensità del segnale iniziale nel giro di 30-60 secondi è indicativa di degradazione proteolitica della proteina GFP ky. La scomparsa completa del segnale fluorescente solubile dovrebbe verificarsi entro 10-60 secondi dall'applicazione di digitonina.La conferma che la proteina di interesse sia associata a organelli intracellulari si ottiene osservando il mantenimento del segnale fluorescente dopo digestione e permeabilizzazione. La coda carbossi-terminale della chinasi ancorata alla membrana LTK due è stata fusa a GFP ed espressa transitoriamente in fluorescente ltk. Il segnale GFP è stato perso rapidamente dopo l'aggiunta di proteinasi K, indicando che la localizzazione del carbossi-terminale di ltk due è all'interno del citosol.Cavi e GFP è una proteina della membrana plasmatica con una porzione GFP legata al dominio citosolico. Come per LTK due, il segnale proveniente da cavi e GFP è insensibile alla digitonina, ma sensibile all'aggiunta successiva della proteasi DS red mito, che codifica una proteina fluorescente rossa fused alla sequenza di indirizzamento mitocondriale della citocromo C ossidasi dopo la permeabilizzazione con digitonina, nonché all'aggiunta di proteinasi K. La fluorescenza associata a DS red mito rimane stabile. Questo è coerente con il fluoroforo quattro localizzato nei mitocondri, dove non è esposto al citosol.Quando la porzione fluorescente legata a una proteina di membrana è rivolta all'esterno della cellula, come nel caso della proteina prionica ancorata tramite GPI e legata alla proteina fluorescente gialla, il trattamento con proteinasi dovrebbe attenuare rapidamente il segnale fluorescente senza la necessità preliminare di permeabilizzare le membrane, come previsto. Dopo il trattamento con proteinasi, il segnale fluorescente extracellulare è scomparso rapidamente nelle cellule che esprimevano questa costruzione.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in uno o due ore se effettuata correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una comprensione più approfondita su come determinare la topologia della proteina di membrana di tuo interesse.

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