RNA isolamento da cellulari sottopopolazioni specifiche utilizzando laser-capture Microdissection combinazione con Rapid immunomarcatura

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come eseguire un'etichettatura immuno rapida di una popolazione di cellule cerebrali di topo isolate mediante microdissezione laser o LCM, mantenendo l'integrità dell'RNA dei campioni. Questo viene ottenuto congelando innanzitutto rapidamente il tessuto cerebrale dissezionato. Successivamente, il cervello viene tagliato in sezioni sottili su vetrini microscopici privi di RNA e trattato con una rapida colorazione immuno.

Infine, la popolazione cellulare di interesse viene isolata mediante microdissezione con laser (LCM). In definitiva, la rapida colorazione seguita dalla microdissezione con laser consente l'identificazione di variazioni nell'espressione del gene di interesse nel campione cellulare sperimentale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il sorting cellulare attivato da fluorescenza, è che con il nostro approccio viene mantenuta la risoluzione spaziale, permettendo l'isolamento della cellula specifica di ES dal tessuto circostante.

Generalmente, le persone alle prime armi con questa tecnica della cellula di Smith eseguono un percorso circolare poiché questa procedura comprende diversi passaggi critici che richiedono un'azione rapida per mantenere l'integrità dell'RNA nei campioni. Per preparare i campioni per la sezionatura, dissezionare i cervelli di topi postnatali del primo giorno in mezzo L 15 freddo su ghiaccio entro due minuti dalla soppressione. Successivamente, posizionare i cervelli in stampi per inclusione nell'orientamento appropriato per la sezionatura e riempire gli stampi con mezzo di inclusione per tessuti congelati.

Poi congelare immediatamente i campioni in azoto liquido e conservarli a meno 80 gradi Celsius entro 30 secondi dal congelamento rapido. Trattare ora le lamelle di vetro rivestite con una decontaminazione superficiale dell'RNA per rimuovere eventuali tracce di RNA. Risciacquarle in acqua DEPC e lasciarle asciugare all'aria quando le lamelle sono asciutte.

Impostare la temperatura della camera del criostato a meno 20 gradi Celsius e trasferire il campione congelato nel criostato. Per ogni campione, montare il blocco congelato sulla pinza del campione e tagliare i campioni con uno spessore di 10 micron, raccogliendo le sezioni su vetrini rivestiti con membrana. Dopo aver lasciato asciugare le sezioni per almeno 10 minuti, utilizzare una penna per barriera idrofoba per delimitare il contorno dei tessuti.

Dopo circa 10 secondi, posizionare i vetrini in una soluzione fissante fredda appena preparata per non più di cinque minuti a meno 20 gradi Celsius. Trasferire ora i vetrini in un contenitore pulito pretrattato con soluzione decontaminante per l'RNA superficiale. Prima, agitare i vetrini una volta per rimuovere l'eccesso di fissante e lavarli con sei o otto immersioni rapide in D-E-P-C-P-B-S, scuotendo i vetrini.

Per rimuovere il D-E-P-C-P-B-S in eccesso, aggiungere 200 microlitri della soluzione dell'anticorpo primario a ciascuna sezione. Dopo 10 minuti a temperatura ambiente, lavare i vetrini con tre immersioni rapide in D-E-P-C-P-B-S e scuoterli una volta per rimuovere il liquido di lavaggio in eccesso. Successivamente, incubare i campioni in 200 microlitri della soluzione dell'anticorpo secondario a temperatura ambiente dopo sei minuti.

Lavare i vetrini in D-E-P-C-P-B-S come appena dimostrato e incubarli in una soluzione BC appena preparata per quattro minuti; dopo un altro rapido lavaggio con D-E-P-C-P-B-S, mescolare 196 microlitri di DAB appena preparato con quattro microlitri di inibitore dell'RNA. Poco prima di aggiungere la soluzione al campione, lasciare sviluppare il DAB per uno o due minuti, seguito da un lavaggio con A-D-E-P-C-P-B-S. Quindi disidratare i campioni con un'incubazione di pochi secondi in etanolo assoluto e asciugare i vetrini scuotendoli leggermente per procedere alla LCM.

Successivamente, aggiungere 50 microlitri di tampone di lisi da un kit di estrazione dell'RNA nel tappo del tubo di raccolta. Quindi posizionare un vetrino sotto il microscopio con il lato del campione rivolto verso il tappo. Scegliere l'ingrandimento più adatto per il campione e regolare la messa a fuoco per visualizzare le cellule di interesse.

Quindi definire l'area di taglio e iniziare a tagliare con il laser. Raccogliere il materiale dissezionato nel tappo del tubo di raccolta e lasciare riposare le cellule raccolte per 30 minuti a 42 gradi Celsius. Durante questo periodo, precondizionare una colonna di purificazione dell'RNA dal kit di estrazione dell'RNA con 250 microlitri di buffer di precondizionamento.

Quindi aggiungere 50 microlitri di etanolo alle cellule lisate sulla colonna e centrifugare la colonna per due minuti a 16.000 G e temperatura ambiente, seguito da due lavaggi con tampone di lavaggio. Infine, eluire l'RNA nel volume minimo raccomandato di 11 microlitri di acqua priva di RNA, mettendone da parte due microlitri per verificare la qualità dell'RNA. Questa rapida procedura di marcatura immunoconsente la visualizzazione delle cellule di interesse mantenendo l'integrità dell'RNA sperimentale.

A seconda dell'esperimento, la LCM può essere utilizzata come appena dimostrato per isolare singole cellule o regioni di interesse più ampie. L'RNA degradato ha un impatto considerevole sulla qualità dell'analisi successiva. Ogni campione viene quindi ulteriormente processato su una piattaforma bioanalizzatore basata su microfluidica X per consentire la quantificazione e la verifica dell'integrità dell'RNA isolato, come appena dimostrato.

Ad esempio, qui vengono mostrati risultati tipici del bioanalizzatore relativi a campioni di RNA degradati e di buona qualità. I gel digitali e gli elettroferogrammi dimostrano l'importanza di utilizzare un inibitore della RNasi in ogni soluzione per proteggere l'RNA; seguendo questa procedura, l'RNA di alta qualità può essere ulteriormente processato per applicazioni successive, tra cui il sequenziamento dell'RNA, MICROARRAY o Q-R-T-P-C-R. Ad esempio, in questi grafici, l'arricchimento medio per l'espressione genica di TH e A A DC nel campione microdissezionato, rispetto alle sezioni del mesencefalo, è risultato superiore a 170 volte.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di lavorare molto rapidamente e con materiali liberi da RNAsi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare una popolazione specifica di cellule da qualsiasi tessuto.