RNA isolamento da cellulari sottopopolazioni specifiche utilizzando laser-capture Microdissection combinazione con Rapid immunomarcatura

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come eseguire una rapida marcatura immunologica di una popolazione di cellule cerebrali di topo isolata mediante micro dissezione a cattura laser o LCM, mantenendo l'integrità dell'RNA dei campioni. Ciò si ottiene congelando rapidamente il tessuto cerebrale sezionato. Il cervello viene quindi tagliato in sezioni sottili su vetrini da microscopio privi di RNA e trattato con una rapida colorazione immunologica.

Infine, la popolazione cellulare di interesse viene isolata utilizzando LCM. In definitiva, la colorazione rapida seguita dalla microdissezione a cattura laser consente l'identificazione di cambiamenti nell'espressione del gene di interesse nel campione di cellule sperimentali. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la selezione cellulare attivata fluorescente, è che con la nostra tecnica, la risoluzione spaziale viene mantenuta consentendo la soluzione della cellula specifica di ES dal tessuto circostante.

In genere, le persone che non conoscono questa cellula di Smith faranno il cerchio perché questa procedura include diversi passaggi critici che richiedono di lavorare rapidamente per mantenere l'integrità dell'RNA nei campioni. Per preparare i campioni per il sezionamento, sezionare il cervello dei topi postnatali del primo giorno in un terreno L 15 ghiacciato entro due minuti dal sacrificio. Quindi posizionare i cervelli negli stampi di inclusione nell'orientamento appropriato per il sezionamento e riempire gli stampi con tessuto congelato, terreni di inclusione.

Quindi congelare immediatamente i campioni in azoto liquido e conservarli a meno 80 gradi Celsius entro 30 secondi dal congelamento rapido. Ora, trattare i vetrini rivestiti con membrana con la decontaminazione dell'RNA superficiale per rimuovere eventuali tracce di RNA. Sciacquateli in acqua DEPC e lasciateli asciugare all'aria quando le diapositive sono asciutte.

Impostare la temperatura della camera del criostato a meno 20 gradi Celsius e trasferire il campione congelato al criostato. Per ogni campione, montare il blocco congelato sul morsetto del campione e affettare i campioni a uno spessore di 10 micron, raccogliendo le sezioni sui vetrini rivestiti di membrana. Dopo aver lasciato asciugare le sezioni per almeno 10 minuti, utilizzare una penna barriera idrofobica per circondare i tessuti.

Dopo circa 10 secondi, immergere i vetrini in una soluzione fissativa fredda appena preparata per non più di cinque minuti a meno 20 gradi Celsius. Trasferire ora i vetrini in un vassoio pulito pretrattato con una soluzione di decontaminazione a base di RNA superficiale. Per prima cosa, agitare i vetrini una volta per rimuovere il fissativo in eccesso e lavarli con sei-otto tuffi rapidi In D-E-P-C-P-B-S scorrere i vetrini.

Per rimuovere l'eccesso di D-E-P-C-P-B-S, aggiungere 200 microlitri della soluzione di anticorpi primari in ciascuna sezione. Dopo 10 minuti a temperatura ambiente, lavare i vetrini con tre tuffi veloci in D-E-P-C-P-B-S e passarli una volta per rimuovere la soluzione di lavaggio in eccesso. Quindi incubare i campioni in 200 microlitri della soluzione di anticorpi secondari a temperatura ambiente dopo sei minuti.

Lavare i vetrini in D-E-P-C-P-B-S come appena dimostrato e incubarli in una soluzione di BC appena preparata per quattro minuti dopo un'altra rapida miscela di lavaggio D-E-P-C-P-B-S 196 microlitri di DAB appena preparato con quattro microlitri di inibitore dell'RNA. Poco prima di aggiungere la soluzione alla sezione, lasciare sviluppare il DAB per uno o due minuti, seguito dal lavaggio A-D-E-P-C-P-B-S. Quindi disidratare le sezioni con alcuni secondi di incubazione in etanolo assoluto e asciugare i vetrini per procedere alla LCM.

Successivamente, 50 microlitri di tampone di lisi da un kit di estrazione dell'RNA nel tappo del tubo di raccolta. Quindi posizionare un vetrino sotto il microscopio con il lato del campione rivolto verso il cappuccio. Scegli l'ingrandimento migliore per il campione e regola la messa a fuoco per vedere le celle di interesse.

Quindi definisci l'area di taglio e inizia a tagliare con il laser. Raccolta del materiale sezionato nella provetta di raccolta per 30 minuti a 42 gradi Celsius. Durante questo periodo, precondizionare una colonna di purificazione dell'RNA dal kit di estrazione dell'RNA con 250 microlitri di tampone di condizionamento.

Quindi caricare 50 microlitri di etanolo nelle celle lisate sulla colonna e centrifugare la colonna per due minuti a 16.000 Gs e temperatura ambiente seguiti da due risciacqui con tampone di lavaggio. Infine, eluire l'RNA nel volume minimo raccomandato di 11 microlitri di acqua priva di RNA tenendone da parte due microlitri per testare la qualità dell'RNA. Questa rapida procedura di marcatura immunologica consente la visualizzazione delle cellule di interesse mantenendo l'integrità dell'RNA sperimentale.

A seconda dell'esperimento, LCM può essere utilizzato, come appena dimostrato, per isolare singole cellule o regioni di interesse più grandi. L'RNA degradato ha un impatto considerevole sulla qualità dell'analisi a valle. Ogni campione viene quindi ulteriormente elaborato su un bioanalizzatore a piattaforma microfluid basato su X per consentire la quantificazione e la verifica dell'integrità dell'RNA isolato come appena dimostrato.

Ad esempio, qui, i risultati tipici di un bioanalizzatore sono sia degradati che di buona qualità. Vengono mostrati campioni di RNA. Infatti, il gel digitale e gli elettroferogrammi dimostrano l'importanza di utilizzare un inibitore della rase in ogni soluzione per proteggere l'RNA seguendo questa procedura, l'RNA di alta qualità può essere ulteriormente elaborato per applicazioni a valle, tra cui il sequenziamento dell'RNA MICROARRAY o Q-R-D-P-C-R, ad esempio, in questi grafici, l'arricchimento medio per l'espressione genica TH e A DC nel campione micro sezionato rispetto alle sezioni del cervello medio è stato determinato essere superiore a 170 volte.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che lavora molto rapidamente e con materiale privo di RNA. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare una specifica popolazione di cellule da qualsiasi tessuto.