Name: Contrast Imaging in embrioni di topo Utilizzo ad alta frequenza Ultrasound (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Scopri l'imaging ecografico ad alto contrasto in embrioni di topo per studiare la vascolarizzazione embrionale. Questo metodo consente di misurare parametri di perfusione e valutare il legame di microbolle target in vivo.

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Questo lavoro è stato supportato dal Terry Fox Program del National Cancer Institute of Canada.

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F.S. Foster riconosce il suo ruolo di consulente per VisualSonics Inc.

Mezzi di contrasto ecografici sono state iniettate in fase tardo-embrioni di topo di gestazione e le immagini di contrasto non lineari sono stati acquisiti per misurare parametri di perfusione e mirato microbolle vincolanti. Immagini di successo di microbolle all&#39;interno di vasi embrionali era dipendente da una serie di fattori, il primo embrione di essere redditività. Tutte le attrezzature ed apparecchi sono stati preparati in anticipo in modo da minimizzare il tempo necessario per l&#39;isolamento di embrioni dall...

Mdc ecografia fa uso di mezzi di contrasto microbolle di visualizzare e caratterizzare l&#39;ambiente vascolare. Questi agenti consentono la valutazione non invasiva del microcircolo, vascolarizzazione e la funzione cardiovascolare. Inoltre, la modifica della superficie bolla può provocare microbolle mirate legame biomarker endoteliali, come dimostrato in applicazioni preclinici di angiogenesi, aterosclerosi e infiammazione 1,2 rendendo molecolare ecografico di eventi vascolari possibili. Ultrasuoni può quindi essere utilizzato per identificare gli ambienti complessi e diversi che influenzano gli stati vascolari sani e malati 3-5. Nel numero ultimi anni, l&#39;interesse per l&#39;utilità dell&#39;imaging microbolle ha esteso il modello di topo embrione versatile. Come un modello di sviluppo dei mammiferi, l&#39;introduzione di microbolle nel sistema vascolare embrionale migliora fisiologicostudio del sistema circolatorio in via di sviluppo (ad esempio, il flusso di sangue, la gittata cardiaca) e in caso di transgenici e mirati modelli mutanti murini di malattie cardiache 6,7, può produrre intuizioni come i fattori genetici alterare la funzione cardiovascolare. In realtà, 2D quantitativa e qualitativa di analisi vascolare cerebrale embrionale sono già stati raggiunti 8. Inoltre, l&#39;embrione del mouse presenta come un ottimo modello per esaminare il legame di microbolle mirati ai marcatori vascolari in vivo. Bartelle et al. 9, per esempio, hanno introdotto microbolle avidina in embrione ventricoli cardiaci per valutare bersaglio &#39;vincolante Biotag-Bira embrioni transgenici ed esaminare l&#39;anatomia vascolare. La generazione di modelli eterozigoti e omozigoti mouse può essere utilizzato anche come un surrogato per studi su modelli tumore volti a definire la natura quantitativa degli ultrasuoni molecolare - un punto di riferimento importante nel tradurre questa tecnica per la clinica. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Le microbolle sono più frequentemente introdotta per la circolazione embrionale tramite iniezioni intra-cardiaca in singoli embrioni esposti attraverso una laparotomia 8-10. In iniezioni utero, tuttavia, affrontare una serie di sfide. Questi includono una guida di iniezione, la necessità di contrastare il movimento nella madre ed embrione esteriorizzato, manutenzione della viabilità emodinamica nella madre ed embrioni esteriorizzato, affrontando gli effetti a lungo termine di anestesia e complicazioni dovute al sanguinamento 11. Pertanto, l&#39;obiettivo della ricerca è stato quello di sviluppare una tecnica per l&#39;iniezione di microbolle in isolato di vita in fase avanzata di embrioni 12. Questa opzione offre maggiore libertà in termini di controllo dell&#39;iniezione e posizionamento, riproducibilità del piano di imaging senza ostacoli, e analisi di immagine semplificata e quantificazione. Nel presente studio, si delineano una nuova procedura per l&#39;iniezione di microbolle in vita embrioni murini for fini di studio del comportamento cinetico microbolle e di studiare legame marcatori di superficie endoteliali endogeni microbolle mirati. Contrasto non lineare specifica ecografia viene utilizzato per misurare una serie di parametri di perfusione di base tra cui la valorizzazione di picco (PE), lavare-in rate e il tempo di picco (TTP) in isolati embrioni E17.5. Abbiamo inoltre dimostrato la validità del modello dell&#39;embrione per valutare la natura quantitativa degli ultrasuoni molecolare in una perdita endoglin embrionale di modello di topo transgenico funzione, dove endoglin è un obiettivo clinicamente rilevante a causa della sua elevata espressione in cellule endoteliali vascolari in siti di angiogenesi attiva 13 . L&#39;adesione di endoglin mirati (MB E), topo IgG 2 di controllo (MB C) e non mirati (MB U) microbolle viene valutato in endoglin eterozigoti (Eng +/-) e endoglin omozigote (Ita + / +) esprimendo embrioni. Analisi della bindi miratang rivela che gli ultrasuoni molecolare è in grado di distinguere tra genotipi endoglina e relativa densità dei recettori per i livelli quantificabili ultrasuoni molecolare.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td colspan="4">Anticorpi (biotinilato, eBioscience) &#8212; La scelta dell'anticorpo dipende dall'esperimento</td></tr><tr><td><ul style="padding:0px; margine: 0px"><li>isotipo di ratto IgG2 controllo</li></ul></td><td>eBioscience</td><td>13-4321-85</td><td>Questa combinazione anticorpo/microbolla è spesso richiesta come controllo sperimentale&nbsp;</td></tr><tr><td><ul style="imbottitura:0px; margin:0px"><li>biotina anti-topo CD309</li></ul></td><td>eBioscience</td><td>13-5821-85</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo MJ 7/18 di ratto biotinilato contro l'endoglin di topo</td><td>Ibridoma</td><td></td> domestico <td>Gli anticorpi esterni possono anche essere appropriati: abbiamo utilizzato eBioscience (13-1051-85) in passato</td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr> distillata<td colspan="4">Embryo media</td></tr><tr><td><ul style="imbottitura:0px; margine:0px"><li>500 ml Dulbecco' s Aquila modificata' s Medio con glicemia alta</li></ul></td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td><ul style="padding:0px; margin:0px"><li>50 ml Siero fetale bovino</li></ul></td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>lotto # 7592456</td></tr><tr><td><ul style="imbottitura:0px; margin:0px"><li>Hepes</li></ul></td><td>Gibco</td><td>15630</td><td>5 ml, 1 M</td></tr><tr><td><ul style="imbottitura:0px; margine:0px"><li>Penicillina-Streptomicina</li></ul></td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 ml, 10.000 unità Pen., 10.000 &#956; g Etanolo da streptococco</td></tr><tr><td>, 70%</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>di ghiaccio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>76240</td><td>4%</td></tr> <tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato [1x]&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>1x, senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio</td></tr><tr><td>Topo incinta, CD-1</td><td>Charles River Laboratories Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (soluzione fisiologica) allo 0,9%</td><td>Hospira</td><td>0409-7984-11</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di contrasto ad ultrasuoni, MicroMarker pronto per il bersaglio e non mirato</td><td>; VisualSonics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel per ultrasuoni (Aquasonic 100, incolore)</td><td>CSP Medical</td><td>133-1009</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari (4) :&nbsp; 100&nbsp; x&nbsp; 20&nbsp; mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-22</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari (12) : 60&nbsp; x&nbsp; 15&nbsp; mm</td><td>Sigma</td><td>D8054</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Sorvall Legend RT centrifuga&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche, 50 ml BD Falcon</td><td>VWR</td><td>21008-938</td><td></td></tr><tr><td>Diluente</td>, <td>Beckman Coulter</td><td>Isoton II Diluente, 8448011</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione (Wagner)</td><td>Fine Science Tools</td><td>Wagner 14068-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinze (2), Dumont SS (0,10 x 0,06 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Pinze, scheggia</td><td>VWR</td><td>25601-134</td><td></td></tr><tr><td>Bicchiere in vetro, 2 L (Griffin Beaker)</td><td>VWR</td><td>89000-216</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro, 1 x 90&nbsp; mm GD-1 con filamento</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per aghi in vetro</td><td>Narishige</td><td>PN-30</td><td></td></tr><tr><td>Guanti</td><td>Ansell</td><td>4002</td><td></td></tr><tr><td>Sonda anatomica lorda</td><td>Fine Science Tools</td><td>10088-15</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>VWR</td><td>89090-994</td><td></td></tr><tr><td>Secchiello per il ghiaccio</td><td>Cole Parmer</td><td>RK 06274-01</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Piattaforma</td><td>VisualSonics Inc.</td>Sistema <td></td><td>di binari integrato</td></tr><tr><td>Sorgente luminosa, fibra ottica</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-562-36</td><td>Idealmente ha bracci regolabili</td></tr><tr><td>Luers (12), femmina spinata in polipropilene &frac14;-28 Filettatura UNF</td><td>Cole Parmer</td><td>45500-30</td><td></td></tr><tr><td>Sistema micro-ultrasuoni, ad alta frequenza</td><td>VisualSonics Inc.</td><td>Vevo2100</td><td></td></tr><tr><td>Aghi, calibro 21 (1")</td><td>VWR</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore granulometrico</td><td>Beckman Coulter</td><td>Multisizer 3 Coulter Counter</td><td></td></tr><tr><td>Cucchiaio perforato (Moria)</td><td>Fine Science Tools</td><td>MC 17 10373-17</td><td></td></tr><tr><td>Perni (6), nero anodizzato minuzia 0,15 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>Pipettatori [2-20 &#956; l, 20-200 &#956; l, 100-1.000 &#956; l]</td><td>Eppendorf</td><td>Research Plus 3120000038 regolabile; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 3120000054; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td>3120000062</tr><tr><td>Punte per pipettatore [2-200&nbsp; &#956; l, 50-1.000&nbsp; &#956; l]</td><td>Eppendorf</td><td>epT.I.P.S. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 22491334; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td>Forbici 022491351</tr><tr><td>Kit elastomero</td><td></td> siliconico Sylgard 184 Tubi Dow Corning<td></td><td></td></tr>, <tr><td></td> laboratorio Tygon 1/32" x 3/32"<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>63010-007</td><td></td></tr><tr><td>Stick applicatore in legno (tampone, testina di cotone)</td><td>VWR</td><td>CA89031-270</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio operatorio Ingrandimento 5-8X</td> Siringhe <td>Fisher Scientific</td><td>Steromaster</td><td></td></tr><tr><td>, 1 ml Siringhe Normject</td><td>Fisher</td><td>14-817-25</td><td></td></tr><tr><td>(10), 30 ml</td><td>VWR</td><td>CA64000-041</td><td></td></tr><tr><td>Pompa per infusione siringa</td><td>Bio-lince&nbsp;</td><td>Termometro NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>, -20-110&nbsp; &#176; C</td><td>VWR</td><td>89095-598</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>VWR</td><td>33501-418</td><td></td></tr><tr><td>Valvole, Eppendorf</td><td>VWR</td><td>20170-577</td><td></td></tr><tr><td>Rack per provette (3)</td><td>VWR</td><td>82024-462</td><td></td></tr><tr><td>Trasduttore a ultrasuoni, 20 MHz</td><td>VisualSonics Inc.</td><td>MS250</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-Tubingen, angolato verso l'alto</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr></tbody></table>

contrast imaging in embrioni di topo utilizzo ad alta frequenza ultrasound

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

L'imaging con mezzo di contrasto a ultrasuoni può trasmettere informazioni quantitative essenziali riguardanti la vascolarizzazione e la perfusione dei tessuti e, in applicazioni mirate, facilitare il rilevamento e la misurazione dei biomarcatori vascolari a livello molecolare. All'interno dell'embrione di topo, questa tecnica non invasiva può essere utilizzata per scoprire i meccanismi di base alla base dello sviluppo vascolare nel sistema circolatorio precoce del topo e nei modelli genetici delle malattie cardiovascolari. L'embrione di topo si presenta anche come un eccellente modello per studiare l'adesione di microbolle a bersagli angiogenici (incluso il recettore del fattore di crescita endoteliale vascolare 2 (VEGFR2) o αv β3) e per valutare la natura quantitativa dell'ecografia molecolare. Abbiamo quindi sviluppato un metodo per introdurre agenti di contrasto a ultrasuoni nel sistema vascolare di embrioni vivi e isolati. Ciò consente libertà in termini di controllo e posizionamento dell'iniezione, riproducibilità del piano di imaging senza ostruzioni e movimenti e analisi e quantificazione semplificate delle immagini. Gli embrioni murini in fase gestazionale avanzata (giorno embrionale (E)16.6 e E17.5) sono stati isolati dall'utero, delicatamente esteriorizzati dal sacco vitellino e sono stati iniettati agenti di contrasto a microbolle nelle vene accessibili sulla superficie corionica del disco placentare. L'ecografia con contrasto non lineare è stata quindi impiegata per raccogliere una serie di parametri di perfusione di base (aumento del picco, tasso di wash-in e tempo per il picco) e quantificare il legame mirato delle microbolle in un modello murino di endoglina. Mostriamo il successo della circolazione delle microbolle all'interno degli embrioni viventi e l'utilità di questo approccio nella caratterizzazione della vascolarizzazione embrionale e del comportamento delle microbolle.

L&#39;iniezione di mezzi di contrasto ad ultrasuoni nella ex utero embrioni di topo dipende l&#39;isolamento successo viventi, embrioni fase tardiva gestazionale dall&#39;utero e manutenzione della redditività nel corso dell&#39;iniezione e relativo ecografica. Una volta che l&#39;embrione è stato esteriorizzato e posizionato, come mostrato in Figura 1, è possibile accurata iniezione di mezzo di contrasto nel sistema vascolare embrionale. Una immagine ecografica B-mode tipiche di un embrione di...

Qui, vi presentiamo un protocollo per iniettare mezzi di contrasto ecografici microbolle in vita, isolata tardo-gestazione di embrioni murini stage. Questo metodo consente lo studio dei parametri di perfusione e di marcatori molecolari vascolari all&#39;interno dell&#39;embrione con mdc alta frequenza ecografica.

Contrast Imaging in embrioni di topo Utilizzo ad alta frequenza Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

L'obiettivo generale di questa procedura è iniettare microbolle in embrioni di topo viventi isolati, per l'immagine ecografica con mezzo di contrasto. Ciò si ottiene prelevando innanzitutto embrioni viventi di E 16,5 o E 17,5 da un topo gravido.Dopo aver preparato le microbolle mirate, queste vengono iniettate nell'embrione vivente attraverso la rete vascolare placentaria. L'ultimo passaggio consiste nell'ottenere un'immagine delle microbolle mediante imaging ecografico. In definitiva, l'imaging ecografico con mezzo di contrasto potrebbe essere utilizzato per misurare i parametri di perfusione vascolare e valutare il legame delle microbolle mirate negli embrioni.Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà nella manipolazione degli embrioni e nelle fasi di iniezione del protocollo, finché non avranno acquisito sufficiente pratica nell'applicare le pressioni corrette con l'ago e la pinzetta necessarie per un esperimento di successo. La dimostrazione della procedura sarà effettuata da Brian Nixon, uno studente in convenzione del nostro laboratorio. Per ricostituire le provette pronte per l'uso, iniziare diluendo 20 microgrammi della soluzione di anticorpo i

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Nella chirurgia in utero sopravvivenza in topi permette la manipolazione molecolare dell'espressione genica durante lo sviluppo. Qui si descrive l'utilizzo di alta frequenza ecografia per guidare l'iniezione di vettori retrovirali nel cervello di topo al giorno embrionale (E) 9.5.

Ultrasound-Guided Microiniezione nel proencefalo mouse In Utero A E9.5

Morte fetale e perinatale è una caratteristica comune quando si studiano le alterazioni genetiche che influenzano lo sviluppo cardiaco. Alta frequenza ecografia ha migliorato 2-D risoluzione e può fornire informazioni excellent precoce sviluppo cardiaco ed è un metodo ideale per rilevare l'impatto sulla struttura e funzione cardiaca prima della morte.

Murine ecocardiografia fetale

Questo video mostra una procedura per iniettare agenti di contrasto a microbolle in un embrione di topo isolato in fase di tarda gestazione. L'ecografia basata su un mezzo di contrasto a microbolle aiuta a visualizzare e caratterizzare l'ambiente vascolare dell'embrione.

Iniezione di microbolle in embrioni di topo isolati: una tecnica per fornire agenti di contrasto a microbolle nel sistema vascolare di embrioni murini viventi

In questo video, dimostriamo l'ecografia ad alta frequenza per visualizzare i siti di impianto degli embrioni in un modello murino in gravidanza. Questa tecnica di imaging rileva con successo la gravidanza vitale e caratterizza i siti di impianto dell'embrione durante la gravidanza murina precoce.

Caratterizzazione precoce della gravidanza basata sull'ecografia ad alta frequenza: una tecnica per studiare l'impianto dell'embrione e la progressione della gravidanza in un modello murino gravido

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Presentiamo un protocollo dettagliato per la coltura e l'imaging di embrioni di topo che consente l'imaging 3D + tempo delle cellule progenitrici cardiache. Questo video-toolkit affronta le competenze chiave necessarie per immagini live di successo altrimenti difficili da acquisire da pubblicazioni di solo testo.

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Contrast Imaging in embrioni di topo Utilizzo ad alta frequenza Ultrasound

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