Contrast Imaging in embrioni di topo Utilizzo ad alta frequenza Ultrasound

L'obiettivo generale di questa procedura è iniettare microbolle in embrioni di topo viventi isolati, per l'immagine ecografica con mezzo di contrasto. Ciò si ottiene prelevando innanzitutto embrioni viventi di E 16,5 o E 17,5 da un topo gravido.

Dopo aver preparato le microbolle mirate, queste vengono iniettate nell'embrione vivente attraverso la rete vascolare placentaria. L'ultimo passaggio consiste nell'ottenere un'immagine delle microbolle mediante imaging ecografico. In definitiva, l'imaging ecografico con mezzo di contrasto potrebbe essere utilizzato per misurare i parametri di perfusione vascolare e valutare il legame delle microbolle mirate negli embrioni.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà nella manipolazione degli embrioni e nelle fasi di iniezione del protocollo, finché non avranno acquisito sufficiente pratica nell'applicare le pressioni corrette con l'ago e la pinzetta necessarie per un esperimento di successo. La dimostrazione della procedura sarà effettuata da Brian Nixon, uno studente in convenzione del nostro laboratorio. Per ricostituire le provette pronte per l'uso, iniziare diluendo 20 microgrammi della soluzione di anticorpo in un volume finale di un millilitro di soluzione salina. Mantenere le provette sul ghiaccio. Successivamente, riempire una siringa con un millilitro di soluzione salina.

Rimuovere tutte le bolle d'aria. Applicare un ago da 21 gauge ed iniettare lentamente la soluzione nel flaconcino delle microbolle. Ritirare lentamente lo stantuffo, rimuovendo un millilitro di aria, quindi estrarre l'ago.

Agitare delicatamente il flacone e lasciarlo in posa sul ghiaccio per cinque minuti. Trascorsi cinque minuti, riempire una nuova siringa con la diluizione dell'anticorpo e aggiungerla al flacone appropriato. Dopo l'agitazione, lasciare delicatamente la miscela ora di due millilitri.

Attendere 10 minuti sul ghiaccio. Per ricostituire le fiale non mirate, riempire una siringa con un millilitro di soluzione salina. Rimuovere tutte le bolle d'aria.

Applicare un ago da 21 gauge ed iniettare lentamente la soluzione in un nuovo flaconcino per microbolle. Estrarre lentamente lo stantuffo, rimuovendo un millilitro di aria, quindi rimuovere l'ago. Agitare delicatamente e lasciare in riposo per cinque minuti.

Dopo aver aggiunto un ulteriore millilitro di soluzione salina per portare il volume a due millilitri, agitare delicatamente e lasciare in posa per 10 minuti sul ghiaccio. Dopo aver agitato delicatamente il flaconcino desiderato di microbolle, utilizzare un ago da 21 gauge su una siringa da un millilitro per aspirare circa 50 microlitri della soluzione. Successivamente, iniettare le microbolle in un tubo da microcentrifuga vuoto da due millilitri.

Successivamente, pipettare un campione di 10 microlitri di soluzione madre di microbolle in 10 millilitri di diluente. Dopo un'accurata miscelazione, utilizzare il conteggio di Coulter per valutare la concentrazione e le distribuzioni dimensionali della popolazione di microbolle. Effettuare almeno tre misurazioni da 50 microlitri per ogni campione in vial.

Utilizzando un'apertura di 30 micrometri. Questo passaggio viene eseguito in parallelo con l'iniezione di microbolle negli embrioni. Mentre il chirurgo inietta negli embrioni, l'assistente prepara la successiva iniezione per garantire che il chirurgo non sia a conoscenza del tipo di bolla che viene iniettato.

Determinare il volume della soluzione madre di microbolle necessario per ottenere una concentrazione finale di 100 milioni di microbolle per millilitro in un volume di 400 microlitri. Aliquotare il corrispondente volume di soluzione fisiologica in un tubo microcentrifuga vuoto. Dopo aver agitato delicatamente il flacone di microbolle selezionato, utilizzare una siringa da un millilitro con ago da 21 gauge per aspirare un volume eccessivo della soluzione.

Quindi iniettare le microbolle in un tubo microcentrifuga vuoto. Successivamente, pipettare il volume necessario della soluzione madre di microbolle e aggiungerlo al quadruplo Ali di soluzione fisiologica. Mescolare delicatamente con la punta della pipetta.

Quindi utilizzare un ago da 21 gauge per aspirare la soluzione di microbolle diluita in una siringa pulita. Dopo aver rimosso l'ago, eliminare eventuali bolle d'aria dalla siringa e collegare l'esca e il tubo. Spingere lentamente la soluzione fino all'estremità del tubo, avendo cura di non generare bolle d'aria.

Infine, inserire la siringa in una pompa per infusione di siringhe impostata per somministrare le microbolle a un flusso di 20 microlitri al minuto. Per un volume totale di 20 microlitri, fissare un ago di vetro tirato all'estremità del tubo. Avvicinare la pompa alla fase di iniezione.

Utilizzare un cucchiaio forato per selezionare e rimuovere casualmente un embrione dalla capsula di Petri contenente il mezzo refrigerato. Posizionare l'embrione in una capsula per dissezione posta sul piano dell'ecografo sotto il microscopio stereoscopico. Successivamente, individuare il lato dell'embrione che appare meno vascolarizzato.

Questa è un'area a bassa vascolarizzazione, generalmente adiacente alla regione della testa. Successivamente, utilizzare pinzette fini per tagliare o strappare appena sufficiente del sacco vitellino e delle membrane amniotiche in modo da poter rimuovere l'embrione dall'interno, ma non oltre. Quindi, manovrare delicatamente il sacco intorno all'embrione.

Quindi posizionare l'embrione sul fianco con la placenta e i vasi ombelicali in posizione anteriore. Stabilizzare la piastra per dissezione utilizzando piccoli pezzi di plastilina e quattro puntine da insetto fissate al tuorlo e ai margini della placenta, evitando qualsiasi vaso principale, usando una siringa contenente liquido preriscaldato a 45 gradi Celsius.

Lavare l'embrione con PBS fino a quando non si vede il sangue che fluisce nell'embrione. L'arteria ombelicale viene identificata dal sangue rosso brillante pulsatile. La vena ombelicale e la rete vascolare associata hanno un sangue più scuro e in genere si sovrappongono a quelle dell'arteria ombelicale sul lato placentare.

A questo punto, posizionare la piastra in modo che l'iniezione possa essere eseguita comodamente. Una volta che l'embrione si è ripreso, coprirlo, ma non la placenta. Utilizzando gel ecografico preriscaldato, usare pinzette fini per rimuovere delicatamente eventuali bolle d'aria presenti intorno all'embrione e rabboccare la piastra con PBS preriscaldato durante tutta la procedura.

Controllare attentamente il livello di soluzione nelle siringhe di PBS e del gel e aggiungere siringhe di riserva al becher riscaldato secondo necessità. Successivamente, montare l'ago di vetro su una grande pallina di plastilina al bordo della piastra per dissezioni e immergere l'estremità dell'ago nel PBS. Scegliere una vena sulla superficie corionica del disco placentare il più lontano possibile dal ramo principale, entro limiti ragionevoli.

Quindi utilizzare le forbici per tagliare la punta dell'ago in modo da adattarla alla dimensione del vaso. Tagliare la punta con un leggero angolo. Utilizzare il bordo delle forbici a molla per rimuovere eventuali bordi irregolari del vetro.

Ora, utilizzando la pompa per siringa, iniettare lentamente la soluzione di microbolle a una velocità di 20 microlitri al minuto nell'ago di vetro finché tutta l'aria non sarà stata espulsa dalla punta dell'ago e le microbolle risulteranno visibilmente fluire liberamente nel PBS. Arrestare la pompa e reimpostarla per un volume di iniezione di 20 microlitri. Evitare che l'aria entri nell'ago di iniezione, per non iniettare aria nel sistema vascolare dell'embrione.

Inserire delicatamente la punta dell'ago di vetro nella vena selezionata della placenta e assicurarsi che sia immobile. Ruotare lontano la testa del microscopio stereoscopico e posizionare la sonda ecografica in modo che l'embrione si trovi equidistante tra i fuochi a sei e dieci millimetri. Successivamente, avviare l'acquisizione delle immagini e iniziare l'iniezione in bolo delle microbolle; dopo un minuto dall'avvenuta iniezione, avviare il cronometro per la fase di acquisizione dati.

Questa immagine ecografica in modo B mostra un embrione E 17,5 esposto immediatamente prima dell'iniezione di microbolle mirate. Questa immagine ecografica in contrasto non lineare mostra l'embrione prima dell'iniezione delle microbolle, quando sono visibili solo le interfacce fortemente riflettenti come l'osso, con segnale minimo proveniente dai tessuti molli. L'iniezione delle microbolle migliora il contrasto in tutto l'animale, inclusa la vena cava inferiore, il cuore e il cervello.

Un grafico dell'intensità delle microbolle in funzione del tempo all'interno di una singola regione di interesse nel cervello embrionale permette l'identificazione di diversi parametri di perfusione, inclusi il massimo di potenziamento o pendenza del wash-in e il tempo per raggiungere il picco o TTP. I rapporti medi di potenza del contrasto ottenuti con microbolle mirate all'endoglin erano significativamente più elevati rispetto a quelli registrati con microbolle non mirate utilizzate come controllo. Inoltre, si è riscontrato che il legame delle microbolle mirate all'endoglin era significativamente maggiore negli embrioni ogly più più rispetto agli embrioni ogly più meno.

Una volta acquisita padronanza, ogni embrione può essere iniettato e analizzato in 15 minuti, se la tecnica viene eseguita correttamente.