Un chip microfluidico per ICPMS introduzione del campione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare e analizzare quantitativamente la composizione elementare di micro goccioline monodisperse contenenti singole cellule o soluzioni acquose mediante I-C-P-M-S. Ciò si ottiene fabbricando prima un chip microfluidico utilizzando lo stampaggio di repliche con PDMS. Il secondo passo consiste nel collegare le pompe a siringa al chip microfluidico.

Le pompe forniranno il campione acquoso e la fase di trasporto altamente volatile e ammissibile o organica PFH. Quando la pompa a siringa è accesa, il chip microfluidico genera goccioline monodisperse della soluzione acquosa del campione o di una sospensione cellulare per flusso, concentrandosi con PFH ed espellendo queste goccioline con PFH aggiuntivo dal chip come getto di liquido. Il passaggio finale consiste nell'inserire il chip in un gruppo di trasporto costituito da un riscaldatore a cartuccia che fa evaporare le goccioline e da una membrana de salvator che rimuove i solventi prima della ionizzazione e del rilevamento del contenuto di goccioline da parte di un I-C-P-M-S.

Infine, i segnali registrati e una misura di calibrazione con una soluzione standard vengono utilizzati per determinare la composizione elementare della soluzione campione o delle celle nella sospensione. I principali vantaggi della nostra tecnica microfluidica rispetto ai metodi esistenti sono la dimensione regolabile delle gocce, il basso consumo di campione e il basso rischio di intasamenti quando si lavora con sospensioni cellulari o soluzioni saline concentrate. Inoltre, il chip microfluidico monouso a basso costo evita i tempi di pulizia ed elimina la contaminazione incrociata.

A dimostrare la procedura saranno tutti vin sc, un dottorando del Laboratorio del Professor GTAs e Pascal Fabrica, un dottorando del mio laboratorio. Per iniziare il processo di MICROFABBRICAZIONE, misurare 40 grammi di PDMS e quattro grammi di agente indurente PDMS in un grande piatto di plastica. Mescolare entrambe le parti in modo uniforme con una spatola e posizionare il piatto all'interno di un essiccante sottovuoto per 20-30 minuti per degassare tutte le bolle dal composto.

Durante il degasaggio. Posiziona uno stampo di colata sopra un wafer di silicio microstrutturato e usa la struttura guida attorno al disegno per farlo scattare in posizione su un wafer di silicio piatto. Posiziona liberamente un altro stampo da colata sopra.

Versare circa tre o quattro grammi della miscela Degas PDMS su entrambi gli stampi di colata. Trasferire entrambi i wafer di silicio su una piastra calda. Polimerizzare il PDMS a 150 gradi Celsius per sei minuti, quindi raffreddare.

Il PDMS solidificato si struttura sul banco a temperatura ambiente con una spatola metallica. Separare con cura i blocchi PDMS solidi dagli stampi. Protegge le superfici di incollaggio di entrambi i blocchi dalla contaminazione da particelle e impronte digitali.

Applicando uno strato di scotch trasparente, i pezzi PDMS possono ora essere maneggiati e tagliati a misura con le forbici. Dopo il taglio, rimuovere il nastro dal blocco PDMS microstrutturato e utilizzare un perforatore per biopsia per creare le porte di ingresso microfluidiche. Questo completa il processo di fabbricazione per la metà microstrutturata del dispositivo, che è ora pronto per essere incollato e assemblato con la sua controparte piatta.

Per preparare i servizi per l'incollaggio da PDMS a PDMS, iniziare con lo spin coating di uno strato di agente indurente PDMS su un wafer di silicio bianco a 6.000 giri/min per 30 secondi mentre l'agente indurente è ancora bagnato, portare l'interfaccia di incollaggio del blocco PDMS microstrutturato a contatto con il wafer e applicare delicatamente una pressione sulla parte superiore del PDMS per formare una tenuta senza cuciture senza bolle. In un passaggio separato, rimuovere il nastro protettivo dalla controparte piatta. Quindi separare lentamente il PDMS microstrutturato dal wafer di silicio.

Allineare con cura i due pezzi PDMS e mettere in contatto le due interfacce di collegamento. Spremere delicatamente i due blocchi per rimuovere eventuali bolle interfacciali e polimerizzare il chip PDMS assemblato per 24 ore A temperatura ambiente utilizzando un taglierino e un dispositivo di allineamento, praticare un taglio lungo la linea dell'indicatore ortogonale all'ugello di uscita. Ispezionare il chip al microscopio per individuare eventuali difetti di rifilatura e contaminazione da particelle adiacenti all'ugello di uscita esposto.

Dopo aver valutato la qualità della fabbricazione, le superfici interne del microcanale PDMS sono pronte per essere siloizzate. In una cappa chimica, collegare un'estremità di una bottiglia di lupo a una fonte di azoto secco e collegare l'altra estremità della bottiglia agli ingressi del chip PDMS. Utilizzando più tubi collegati a un collettore centrale, pipettare 50 microlitri di linea nel flacone di lupo e sigillare il coperchio superiore.

Accendere il flusso di trasporto dell'azoto e lavare i microcanali con una soluzione salina contenente vapore per 20 minuti a una velocità di flusso di circa un millilitro al secondo. Infine, scollegare i tubi di ingresso dalla bottiglia del lupo. I chip PDMS rivestiti sono pronti per esperimenti di spettrometria di massa per misure di spettrometria di massa a cella singola.

Innanzitutto, diluire il campione in ingresso con un tampone appropriato in modo tale che la concentrazione cellulare effettiva sia inferiore a 10 milioni di cellule per millilitro In preparazione alla spettrometria di massa, iniziare collegando i tubi alle siringhe del campione. Caricare due siringhe da cinque millilitri con il PFH e caricare il campione in ingresso in una siringa separata da un millilitro. Rimuovere tutte le bolle intrappolate all'interno delle siringhe e dei tubi e caricare le due siringhe su una pompa a siringa.

Assicurarsi che il tubo di trasporto sia allineato correttamente e che tutti i tubi del gas siano collegati. Quindi, collegare i tubi della siringa alle porte di ingresso del chip PDMS e attivare la pompa a siringa per tre-cinque minuti. Durante questo processo di stabilizzazione del flusso, rimuovere il liquido in eccesso dalla porta di uscita con un fazzoletto.

Se il fluido esce, il truciolo non forma un getto rettilineo. Dopo cinque minuti, prova a rimuovere eventuali ostruzioni all'uscita del chip con un fazzoletto pulito. In caso di esito negativo, eliminare il chip esistente e sostituire la connessione con un nuovo chip.

Rimuovere il tappo dall'adattatore dello spruzzatore ciclonico e inserire con cautela il chip PDMS stabilizzato al flusso nell'adattatore. Modificare la portata in base alle impostazioni consigliate e ristabilizzare il flusso da due a cinque minuti. Allo stesso tempo, regolare le portate per tutti i gas fino a raggiungere l'intensità massima del segnale dell'analita di interesse.

Inoltre, regolare la potenza del plasma e la tensione della lente di messa a fuoco sullo spettrometro di massa per migliorare ulteriormente l'intensità del segnale durante l'ottimizzazione del segnale. Impostare lo spettrometro di massa su un tempo di permanenza di 10 millisecondi e iniziare l'acquisizione dei dati. Dopo le misurazioni, trasferire i dati grezzi a un programma di analisi dei dati.

In una tipica routine di analisi dei dati, tutte le misurazioni vengono prima separate in contenitori di dati, con ogni contenitore che rappresenta il numero di conteggi per 10 millisecondi di tempo di permanenza, quindi viene generato un grafico a istogramma per tutti i contenitori e dotato della funzione di distribuzione gaussiana. La media e la diffusione dei singoli accoppiamenti rappresentano sia l'intensità media del segnale che la deviazione standard a un particolare rapporto massa/carica. Per iniziare il processo di calibrazione, misurare innanzitutto una soluzione standard alla stessa velocità di flusso del campione.

Utilizzando il chip PDMS per la generazione di goccioline, impostare due siringhe da cinque millilitri per PFH e una siringa da un millilitro per la soluzione standard. Quindi, utilizzando una piastra di Petri come supporto per campioni del microscopio, posizionare il chip PDMS nella piastra di Petri e mettere a fuoco il chip a basso ingrandimento rispecchiando le fasi del protocollo precedente. Stabilizza la generazione di goccioline all'interno del microcanale PDMS per tre-cinque minuti con una telecamera ad alta velocità.

Iniziare a registrare le immagini delle goccioline acquose sul chip alla giunzione secondaria per ottenere il diametro medio delle goccioline dalle registrazioni. Utilizza un software di analisi delle immagini con una suite dedicata di morphing delle goccioline, optometria e velo simmetria. Supponendo che ogni goccia possa essere modellata come un oggetto sferico, il volume medio delle goccioline può essere stimato utilizzando il diametro medio delle goccioline ottenuto dal software.

Quindi, dividere la concentrazione nota dell'analita del campione per il volume medio delle goccioline per ottenere la massa dell'analita contenuta in una gocciolina. Quindi converti la massa risultante nel numero di atomi. Infine, calcolare l'efficienza di rilevamento complessiva dividendo il numero di ioni misurati per gocciolina per il risultato precedente.

Questa efficienza di rilevamento può ora essere utilizzata come grandezza di calibrazione per accertare il numero di atomi in un campione sconosciuto. Utilizzando un generatore di goccioline microfluidiche, le singole cellule possono essere incapsulate all'interno di goccioline acquose monodisperse con un diametro medio inferiore a 50 micron e analizzate mediante I-C-P-M-S. La guaina organica di PFH che circonda la gocciolina acquosa può essere facilmente rimossa prima che il campione raggiunga il rivelatore I-C-P-M-S.

Quando si misurano le soluzioni, l'elevata monodispersione delle gocce può essere osservata come basse varianze tra gruppi di segnali provenienti da un singolo conteggio di gocce doppie o triple entro un dato tempo di permanenza. Dopo un'adeguata calibrazione, è possibile accertare il contenuto di ferro da un insieme di singoli globuli rossi bovini, ciascuno sospeso in singole goccioline. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare e utilizzare questi chip microfluidici per l'analisi elementare quantitativa di volumi di campioni molto piccoli o di singole particelle e cellule.

La fabbricazione di questi chip richiede meno di 15 minuti, un tempo di mani per chip se viene eseguita correttamente. Inoltre, i chip facili da modificare consentono l'integrazione di ulteriori moduli microfluidici per il pretrattamento avanzato dei campioni e l'introduzione simultanea di campioni e standard per migliorare l'efficienza e la produttività dei campioni.