Un chip microfluidico per ICPMS introduzione del campione

L'obiettivo generale di questa procedura è generare e analizzare quantitativamente la composizione elementare di microgocce monodisperse contenenti singole cellule o soluzioni acquose mediante I-C-P-M-S. Questo risultato si ottiene innanzitutto fabbricando un chip microfluidico utilizzando la stampatura per replica con PDMS. Il secondo passaggio consiste nel collegare delle pompe a siringa al chip microfluidico.

Le pompe forniranno il campione acquoso e la fase mobile altamente volatile e ammissibile o organica PFH. Quando la pompa a siringa viene accesa, il chip microfluidico genera goccioline monodisperse della soluzione campione acquosa o di una sospensione cellulare mediante focalizzazione del flusso con PFH, ed espelle tali goccioline con ulteriore PFH dal chip sotto forma di un getto liquido. L'ultimo passaggio consiste nell'inserire il chip in un'unità di trasporto composta da un riscaldatore a cartuccia che evapora le goccioline e da un disalvatore a membrana che rimuove i solventi prima dell'ionizzazione e della rilevazione del contenuto delle goccioline mediante I-C-P-M-S.

In definitiva, i segnali registrati e una misura di calibrazione con una soluzione standard vengono utilizzati per determinare la composizione elementare della soluzione campione o delle cellule in sospensione. I principali vantaggi della nostra tecnica microfluidica rispetto ai metodi esistenti sono la dimensione regolabile delle gocce, il basso consumo di campione e il ridotto rischio di occlusione quando si lavora con sospensioni cellulari o soluzioni saline concentrate. Inoltre, il chip microfluidico monouso a basso costo evita i tempi di pulizia ed elimina la contaminazione incrociata.

La procedura sarà dimostrata da all vin sc, studente di dottorato del Laboratorio del Professor GTA, e Pascal Fabrica, studente di dottorato del mio laboratorio. Per iniziare il processo di MICROFABBRICAZIONE, pesare 40 grammi di PDMS e 4 grammi di agente indurente per PDMS in un contenitore di plastica grande. Mescolare uniformemente le due componenti con una spatola e collocare il contenitore all'interno di un essiccatore sotto vuoto per 20-30 minuti per eliminare tutte le bolle dalla miscela.

Durante la degasificazione, posizionare un stampo di colata sopra una wafer di silicio microstrutturata e utilizzare la struttura guida intorno al disegno per incastrarlo al posto giusto su una wafer di silicio piatta. Posizionare un altro stampo di colata sopra liberamente.

Versare circa tre-quattro grammi della miscela di PDMS Degas su entrambi i modelli di stampo. Trasferire entrambi i wafer di silicio su una piastra riscaldante. Polimerizzare il PDMS a 150 gradi Celsius per sei minuti, quindi raffreddare.

Staccare le strutture di PDMS solidificate dal banco a temperatura ambiente utilizzando una spatola metallica. Separare con attenzione i blocchi di PDMS solidificati dagli stampi. Proteggere le superfici di legame di entrambi i blocchi dalla contaminazione da particelle e dalle impronte digitali.

Applicando uno strato di nastro adesivo trasparente, i pezzi di PDMS possono ora essere maneggiati e tagliati a misura con le forbici. Dopo il taglio, rimuovere il nastro dal blocco di PDMS microstrutturato e utilizzare un punch per biopsia per creare i fori di ingresso microfluidici. Questo completa il processo di fabbricazione della metà microstrutturata del dispositivo, che ora è pronto per essere saldato e assemblato con la sua controparte piana.

Per preparare le superfici per la legatura tra PDMS e PDMS, iniziare rivestendo mediante spin coating uno strato di agente indurente per PDMS su una wafer di silicio vuota a 6.000 giri al minuto per 30 secondi; mentre l'agente indurente è ancora umido, portare l'interfaccia di legatura del blocco di PDMS microstrutturato a contatto con la wafer ed esercitare delicatamente una pressione sulla parte superiore del PDMS per formare una sigillatura continua senza bolle. In un passaggio separato, rimuovere il nastro protettivo dalla controparte piana. Successivamente, separare lentamente il PDMS microstrutturato dalla wafer di silicio.

Allineare con attenzione le due parti in PDMS e portare le due superfici di legame a contatto. Premere delicatamente i due blocchi per rimuovere eventuali bolle interfaciali e lasciare polimerizzare il chip in PDMS assemblato per 24 ore a temperatura ambiente. Utilizzando un coltello da intaglio e un dispositivo di allineamento, effettuare un taglio lungo la linea indicatrice perpendicolare all'ugello di uscita. Ispezionare il chip al microscopio per verificare difetti di rifinitura e contaminazione da particelle adiacenti all'ugello di uscita esposto.

Dopo aver valutato la qualità della fabbricazione, le superfici interne del microcanale in PDMS sono pronte per essere silanizzate. In una cappa chimica, collegare un'estremità di un pallone Wolff a una sorgente di azoto secco e l'altra estremità del pallone agli ingressi del chip in PDMS. Utilizzando più tubi collegati a un collettore centrale, pipettare quindi 50 microlitri di silano nel pallone Wolff e sigillare il coperchio superiore.

Accendere il flusso del gas vettore di azoto e lavare i microcanali con un vapore salino per 20 minuti a una portata di circa un millilitro al secondo. Infine, scollegare i tubi di ingresso dalla bottiglia di Wolf. I chip in PDMS rivestiti sono pronti per esperimenti di spettrometria di massa per misurazioni di spettrometria di massa su singola cellula.

Per prima cosa, diluire il campione iniziale con un tampone appropriato in modo che la concentrazione cellulare effettiva sia inferiore a 10 milioni di cellule per millilitro. In preparazione alla spettrometria di massa, iniziare collegando i tubicini alle siringhe del campione. Caricare due siringhe da cinque millilitri con il PFH e caricare il campione iniziale in una siringa separata da un millilitro. Rimuovere tutte le bolle d'aria intrappolate all'interno delle siringhe e dei tubicini e montare le due siringhe su una pompa per siringhe.

Assicurarsi che il tubo di trasporto sia correttamente allineato e che tutti i tubi per il gas siano collegati. Successivamente, collegare i tubi della siringa alle porte di ingresso del chip in PDMS e attivare la pompa per siringa per tre a cinque minuti. Durante questo processo di stabilizzazione del flusso, rimuovere con un fazzoletto di carta il liquido in eccesso presente alla porta di uscita.

Se il fluido in uscita dal chip non forma un getto dritto, dopo cinque minuti provare a rimuovere con un fazzoletto pulito eventuali ostruzioni all'uscita del chip. Se l'operazione non ha successo, scartare il chip esistente e sostituire il collegamento con un chip nuovo.

Rimuovere il tappo dall'adattatore dello spruzzatore ciclonico e inserire con attenzione il chip in PDMS con flusso stabilizzato nell'adattatore. Modificare la portata in base alle impostazioni raccomandate e ristabilizzare il flusso per due-cinque minuti. Allo stesso tempo, regolare le portate di tutti i gas fino a raggiungere l'intensità massima del segnale dell'analita di interesse.

Inoltre, regolare la potenza del plasma e la tensione della lente di focalizzazione dello spettrometro di massa per migliorare ulteriormente l'intensità del segnale durante l'ottimizzazione del segnale. Impostare lo spettrometro di massa su un tempo di permanenza di 10 millisecondi e iniziare l'acquisizione dei dati. Dopo le misurazioni, trasferire i dati grezzi a un programma di analisi dati.

In una tipica procedura di analisi dati, tutte le misurazioni vengono innanzitutto suddivise in classi di dati, ognuna delle quali rappresenta il numero di conteggi per 10 millisecondi di tempo di permanenza; successivamente viene generato un istogramma per tutte le classi e questo viene adattato con una funzione di distribuzione gaussiana. La media e la dispersione degli adattamenti individuali rappresentano rispettivamente l'intensità media del segnale e la deviazione standard per un determinato rapporto massa/carica. Per iniziare il processo di calibrazione, misurare innanzitutto una soluzione standard alla stessa portata del campione.

Utilizzando il chip in PDMS per la generazione di goccioline, preparare due siringhe da cinque millilitri per il PFH e una siringa da un millilitro per la soluzione standard. Successivamente, utilizzando una piastra di Petri come portacampioni per microscopio, posizionare il chip in PDMS nella piastra di Petri e mettere a fuoco il chip con ingrandimento basso, seguendo i passaggi del protocollo precedente. Stabilizzare la generazione di goccioline all'interno del microcanale in PDMS per tre-cinque minuti utilizzando una telecamera ad alta velocità.

Iniziare a registrare le immagini della goccia acquosa sul chip al giunzione secondaria per ottenere il diametro medio della goccia a partire dalle registrazioni. Utilizzare un software di analisi delle immagini dotato di un'apposita suite per la morfologia delle gocce, l'ottometria e la simmetria del velo. Assumendo che ciascuna goccia possa essere modellata come un oggetto sferico, il volume medio della goccia può essere stimato utilizzando il diametro medio ottenuto dal software.

Successivamente, dividere la concentrazione nota dell'analita nel campione per il volume medio della goccia per ottenere la massa di analita contenuta in una singola goccia. Quindi convertire la massa risultante nel numero di atomi. Infine, calcolare l'efficienza complessiva di rilevamento dividendo il numero di ioni misurati per goccia per il risultato precedente.

Ora questa efficienza di rilevamento può essere utilizzata come grandezza di calibrazione per determinare il numero di atomi in un campione sconosciuto. Utilizzando un generatore di goccioline microfluidico, singole cellule possono essere incapsulate all'interno di goccioline acquose monodisperse con un diametro medio inferiore a 50 micron, e analizzate mediante I-C-P-M-S. L'involucro organico di PFH che circonda la gocciolina acquosa può essere facilmente rimosso prima che il campione raggiunga il rivelatore I-C-P-M-S.

Nella misurazione delle soluzioni, l'elevata monodisperità delle goccioline può essere osservata come basse varianze tra gruppi di segnali provenienti da conteggi di singole goccioline doppie o triple entro un determinato tempo di permanenza. Dopo un'adeguata calibrazione, è possibile determinare il contenuto di ferro di un insieme di singoli globuli rossi bovini, ciascuno sospeso in goccioline singole. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare e utilizzare queste chip microfluidiche per l'analisi elementare quantitativa di volumi di campione molto piccoli o di singole particelle e cellule.

La fabbricazione di questi chip richiede meno di 15 minuti di tempo effettivo per chip, se eseguita correttamente. Inoltre, la facilità di modifica dei chip permette l'integrazione di ulteriori moduli microfluidici per un pretrattamento avanzato del campione e l'introduzione simultanea di campioni e standard, migliorando l'efficienza e la capacità di elaborazione dei campioni.