Name: Isolamento di primarie cellule del colon tumorali umane dai tessuti chirurgici e Coltura direttamente su più elastica e flessibile substrati per trazione citometria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Impara a isolare cellule primarie da tessuti chirurgici di colon umano e coltivarle su substrati elastici per citometria di trazione. Questo metodo permette di analizzare le forze contrattili cellulari e la meccanica del tumore.

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Questo progetto è stato finanziato dalla National Science Foundation ECCS grant 10-02165 e dall'Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. è stato finanziato presso l'UIUC dal NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer 'Midwest Cancer Training Center' Grant R25 CA154015A. L'immnunostaining e l'imaging al microscopio confocale sono stati eseguiti presso l'Istituto di Biologia Genomica (IGB), UIUC. M.Y.A. riconosce le discussioni con B. J. Williams dell'UIUC riguardo agli esperimenti di isolamento. M.Y.A. ringrazia C. Nemeh e Abdul Bhuiya dell'UIUC per l'assistenza nella preparazione degli schemi e degli elenchi dei materiali.

Il protocollo descritto di seguito segue le linee guida del UIUC comitato etico della ricerca umana. 1. Raccolta e digestione di Campione di tessuto chirurgico <ol><li> Raccogliere il campione di tessuto tumorale dopo la resezione del colon (Figura 1A e 1B). Raccogliere il tessuto da un sito sano adiacente pure. </li><li> Trasferire immediatamente il tessuto ad un flaconcino da 15 ml contenente 12 ml di soluzione HBSS. Conservare il flaconcino sul ghiaccio all&#39;interno di una scatola di schiuma isolante. </li><li> Trasportare la fiala contenente il tessuto di una cappa coltura di tessuti per l&#39;ulteriore elaborazione in 45 min. Conservare il flaconcino su un blocco di ghiaccio all&#39;interno della cappa. </li><li> Versare il tessuto fornito in un 6 pozzetti contenenti 6-7 ml di soluzione HBSS con una pipetta. Nota: quantità di tessuto per pozzetto non è critico in questa fase di risciacquo. </li><li> Mantenere la piastra 6 bene su un blocco di ghiaccio. Lavare il tessuto in soluzione HBSS due volte. </li><li> Tagliare il tessuto in modo pulito in sezioni separate con SIC sterilisor. Tessuto Mince in sezioni più piccole non superiore a 1-2 mm 3 dimensioni, con una lama di bisturi sterile. </li><li> Pesare una etichetta 0,1% tripsina flacone (contenente 1 ml di 0,1% soluzione di tripsina) prima di trasferire il tessuto. Trasferire ~ 20 mg di tessuto in ciascuna delle fiale tripsina 0,1% con una pipetta. </li><li> Cercare di ridurre al minimo il trasferimento di HBSS nel flaconcino tripsina per evitare ulteriore diluizione della tripsina. </li><li> Pesare le fiale tripsina dopo il trasferimento dei tessuti; documentare la differenza come la massa di tessuto. </li><li> Versare ~ 20 mg di tessuto e 1 ml di tripsina in ciascun pozzetto di una piastra ben 24. </li><li> Mettere la piastra ben 24 su shaker in frigorifero a 4 ° C per 16-20 ore. Durante questo periodo di attesa o in un momento precedente, preparare i substrati gel di poliacrilamide e funzionalizzare con proteine ​​ECM come descritto nel paragrafo 3. </li></ol> 2. enzimatica dissociazione di Campione di tessuto in sospensione singola cella e coltura isolati Celle ECM funzionalizzato elastico Substrates e piatti polistirolo rigido <ol><li> Dopo 16-20 ore di incubazione in tripsina ben a 4 ° C su agitatore, trasferire il tessuto da 4 ° C tripsina a 4 ° C completa flacone mezzi di crescita (contenente 2-3 ml di terreni di crescita completo) usando una pipetta. Garantire minimo trasferimento di tripsina in terreni di crescita. Nota: Complete formulazione mezzi di crescita è la seguente: RPMI 1640 medium di base integrato con siero di cavallo ad una concentrazione finale del 10% e la penicillina-streptomicina al 1% di soluzione totale. </li><li> Posizionare il tessuto contenente mezzi provetta in un bagno di acqua calda a 37 ° C per 12-15 min. </li><li> Trasferire il tessuto di una fiala da 15 ml contenente soluzione HBSS con una pipetta, agitare delicatamente. </li><li> Ripetere 2.3. </li><li> Rimuovere il tessuto dalla soluzione HBSS e trasferimento al 0,1% soluzione di collagenasi (in HBSS) flaconcino contenente 1 ml di soluzione. Incubare per 45 minuti a 37 ° C e 5% CO 2 ambiente in una coltura cellulare incubatore umidificato. Durante il periodo di attesa, growt caldoh media in un flaconcino da 15 ml a 37 ° C a bagnomaria. </li><li> Estrarre tutti i frammenti di tessuto in pipetta minimizzazione collagenasi riporto. Espellere solo i frammenti di tessuto in flaconi di coltura pre-riscaldato. </li><li> Mettere un filtro ben inserto 40 micron in ciascun pozzetto di una piastra ben 6. Inumidire il filtro con 1 ml di coltura cellulare multimediale. </li><li> Tessuto triturare in media con una pipetta di vetro da 10 ml più volte fino a quando il tessuto è completamente dissociato. </li><li> Mantenere la punta della pipetta il più vicino possibile alla base della fiala. </li><li> Depositare la soluzione sul filtro per rimuovere i detriti e parti indissociate. </li><li> Centrifugare filtrato sospensione cellulare in mezzi a 150 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante dopo e risospendere pellet cellulare con 2 ml di terreni di coltura fresco. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro (se richiesto). Seed isolato cellule primarie di matrice extracellulare (ECM) gel funzionalizzati e piatti di polistirene al concentrazione desiderata.</li></ol> 3. Preparazione e funzionalizzazione di diversi Rigidità Poliacrilammide (PA) Gel e polistirolo substrati Nota: Per la dimostrazione visiva del punto 3, gli spettatori / lettori sono riferite ad una recente ufficiale di esperimenti visualizzati (JoVE) articolo 17. <ol><li> L&#39;adozione di protocolli pubblicati 18, 19, attivano 12 millimetri 2 copertura di vetro scivola chimicamente per garantire vincolante dell&#39;idrogel covalente. <ol><li> In primo luogo, la copertura di vetro scivola trattare con 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) per 7 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere la ATS completamente con acqua deionizzata risciacquo e trattare copertura scivola con lo 0,5% glutaraldeide (diluito in PBS dal 70% soluzione glutaraldeide magazzino) soluzione per 30 minuti. </li></ol></li><li> Ottenere 2 soluzioni gel kPa miscelando 5% w / v di acrilammide e 0,05% N, soluzione N &#39;-methylenebisacrylamide (bis) in soluzione salina 10 mM HEPES-buffered 20. Utilizzare 8% w / v di acrilamide e 0,13% N, soluzione N &#39;-methylenebisacrylamide (bis) in 10 mM HEPES soluzione salina tamponata per 10 kPa gel 20. <ol><li> In entrambi i casi, usare 1: 200 persolfato di ammonio (10% w / v) e 1: 2.000 N, N, N &#39;, N&#39; -tetramethylethylenediamine (TEMED) come iniziatore e catalizzatore per il processo di polimerizzazione, rispettivamente. </li><li> Inoltre, aggiungere 100 microlitri perline fluorescenti a 2 kPa soluzione di gel come marcatori fiduciari 21, 22. </li></ol></li><li> Depositare una goccia di 20 ml di pre-polimero soluzione di gel PA il 12 mm 2 attivato antiscivolo copertura in vetro. Posizionare un altro 12 millimetri 2 regolare polizza di copertura in vetro sulla goccia. Assicurarsi che il calo si diffonde tra i coprioggetto per capillarità. Capovolgere il panino per 2 gel kPa per garantire che la maggior parte delle perle provengono vicino alla superficie di coltura cellulare. </li><li> Curare il gel PA per 45 minuti a RT. </li><li> Staccare la polizza di copertura superiore utilizzando un unico rasoio bordo. Nota: Durante peeling, il distacco procede da un bordodel sandwich. Il gel rimane aderente al vetrino attivato. </li><li> Conservare i gel in soluzione PBS prima dell&#39;uso. </li><li> Funzionalizzare gel PA e vetro con le molecole ECM, fibronectina umana ad una concentrazione di 50 mg / ml metodi seguito pubblicati 23. <ol><li> In breve, incubare substrati con 2 ml puro idrato di idrazina O / N. </li><li> Rimuovere idrato di idrazina e lavare accuratamente i substrati con acqua deionizzata. </li><li> Lavare le substrati con 5% di acido acetico per 30 min. </li><li> Rimuovere acido acetico e lavare accuratamente i substrati con acqua deionizzata. </li><li> Mantenere i substrati immersi in acqua deionizzata per 30 min. </li><li> Incubare i substrati con fibronectina ossidato per 35 minuti ad una concentrazione di 50 ug / ml. </li><li> Sciacquare i substrati con PBS in agitatore a basso numero di giri per 10 minuti. </li><li> Incubare tutti i substrati a 37 ° C in 2-3 ml di coltura per 30 minuti prima della placcatura le cellule. Nota: le cellule piastra in un popolano scarsamented maniera (1.000-3.000 cellule / cm 2). Ogni bicchiere slittamento gel-rivestito deve essere contenuta in una capsula Petri da 35 mm. Consentono alle cellule di aderire completamente prima di qualsiasi microscopia (almeno O / N). </li></ol></li></ol> 4. trazione Forza microscopia e immunofluorescenza Microscopia saggi <ol><li> Trazione Force Microscopy Assay <ol><li> Tripsina-EDTA soluzione calda 0,25% / 10% SDS a 37 ° C a bagnomaria per 10 minuti prima di iniziare esperimenti di trazione. </li><li> Rimuovere un gel dalla incubatore coltura cellulare alla volta e immettere sul palco microscopio a fluorescenza invertito (32X di ingrandimento). </li><li> Trovare una singola cella nel campo visivo. Togliere il coperchio piastra di Petri. </li><li> Dai contrasto di fase immagine di cellule (ad esempio, figura 3). </li><li> Attivare la modalità di imaging per fluorescenza e selezionare filtro appropriato. Non spostare il tavolino del microscopio o del campione durante questo periodo. </li><li> Prendete l&#39;immagine della perline fluorescenti CILINDRATAcato da trazione cellulare (Figura 4C). </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione tripsina / SDS per capsula di Petri staccare la cella dal gel. Non spostare il tavolino del microscopio o del campione durante questo periodo. Inoltre, prendere un&#39;immagine di controllo della cella per assicurare la rimozione completa dal gel. </li><li> Prendere una immagine di riferimento (forza null) delle perline dopo che la cella è rimossa. </li><li> Ripetere i passaggi 4.1.2-4.1.8 per tutti gli altri gel. </li><li> Fare una serie di immagini utilizzando ImageJ dalle due immagini acquisite nella fase 4.1.6 e 4.1.8 per ciascun caso. Per generare la pila di immagini, utilizzare seguente sequenza di comandi in ImageJ dopo l&#39;apertura delle immagini: Immagine → Stack → Immagini per impilare. </li><li> Per ottenere il campo di spostamenti e la trazione, utilizzare i plugin ImageJ seguente metodi pubblicati 21, 22 Ottenere i codici e tutorial dettagliati per questi plugin utilizzando il seguente link:. <a href="https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins">https://sites.google.com/site/qingzongtseng/ima</a>gejplugins. <ol><li> Allineare le immagini in stack utilizzando il plugin &#39;template matching&#39;. L&#39;uso seguente sequenza di comandi in ImageJ dopo l&#39;apertura della serie di immagini generate al punto 4.1.10: Plugin → Modello di corrispondenza → Allinea Fette di Pila → OK. Salvare l&#39;serie di immagini di conseguenza. Usa questa nuova serie di immagini nei seguenti passi. </li><li> Ottenere il campo di spostamento con il PIV (particle image velocimetry) plug (Figura 4D). L&#39;uso seguente sequenza di comandi dopo l&#39;apertura della serie di immagini salvata in fase 4.1.11.1: Plugin → PIV → iterativo PIV (Basic) → OK → Accetta questo PIV e uscita → Ok. Salvare l&#39;uscita PIV nella stessa directory nella serie di immagini originale. Utilizzare questo come input nel passaggio successivo. </li><li> Infine utilizzare il FTTC (trasformata di Fourier trazione citometria) plugin per avere la mappa di trazione (figura 4E). L&#39;uso seguente sequenza di comandi: Plugin → FTTC → Insproprietà dei materiali ERT, vale a dire, il modulo di Young e il rapporto di Poisson di PA gel → OK → Selezionare il file di output PIV salvato nel passaggio 4.1.11.2 → OK. Salva FTTC risulta nella stessa directory nella serie di immagini e di uscita PIV. </li></ol></li></ol></li><li> Immunofluorescenza Microscopia Assays <ol><li> Prendere substrati da immunostained alla cappa laminare e rimuovere il mezzo di coltura. </li><li> Risciacquare i substrati con PBS e fissare le cellule con 4% paraformaldeide in PBS per 20 minuti a RT. </li><li> Lavare le substrati con PBS per 3 volte (5 min ogni volta). Di conseguenza, incubare i substrati con segnale 500 microlitri enhancer per 30 minuti e risciacquare con PBS. </li><li> Incubare le cellule con anticorpi anti-vinculin monoclonale ad una diluizione 1: 250 in PBS per 45 minuti a RT. Lavare le substrati con PBS per 3 volte (5 min ogni volta). </li><li> Incubare i campioni con anticorpo secondario Alexa Fluor IgG anti-topo 488 capra una diluizione 1: 200in PBS a temperatura ambiente per 30 min. Lavare le substrati con PBS per 3 volte (5 min ogni volta). </li><li> Per visualizzare la struttura F-actina, incubare le cellule con TRITC falloidina coniugati ad una concentrazione di 50 ug / ml per 45 minuti a RT. Lavare le substrati con PBS per 3 volte (5 min ogni volta). </li><li> Immagine i campioni utilizzando microscopio confocale a scansione laser (Figura 5A - 5D). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lo stress di trazione Cellular è recentemente emerso come un potenziale indicatore biofisico di stato metastatico 13. Tuttavia, i dati non trazione sperimentale con cellule del tumore primario esiste in letteratura fino ad oggi. Inoltre, la coltura direttamente isolate cellule del colon primario su gel differenti rigidità poliacrilammide non è ancora segnalato. Quindi, noi stabiliamo un ottimizzato colon primario condizioni di coltura cellulare su gel e polistirene (Figura 2). Incapsulamento ...

Negli ultimi anni è diventato sempre più evidente che meccanico micro-ambiente, oltre a fattori bio-chimici, svolge un ruolo importante nella regolazione funzionalità cellulari. Le cellule possono rilevare e rispondere alla rigidità del substrato su cui sono rispettate (come in coltura 2D) o circondati da (come nella cultura 3D) 3-7. In questo modo, le cellule possono modulare la loro differenziazione 3, morfologia 4, migrazione / motilità 5, bio-fisiche 6, di crescita del 7, e altri processi. Le cellule tumorali rispondono anche alla rigidezza della matrice 2D e 3D con una coordinata, gerarchico combinazione meccano-chimica di recettori di adesione e proteine ​​di membrana trasduzione del segnale associate, l&#39;architettura del citoscheletro, e motori molecolari 1, 2. Ad esempio, le cellule epiteliali mammarie (MECs) formare normale parenchima acinose quando coltivate su substrati 150 Pa che è simile alla rigidezzadi tessuto mammario sano. È interessante notare che essi mostrano i tratti distintivi di un tumore in via di sviluppo, sia strutturali che di trascrizione, quando coltivate su supporti rigidi (&gt; 5.000 Pa) che imitano la rigidità di uno stroma tumorale 8. Inoltre, un altro esperimento dimostra che tumorigenesi seno è accompagnata da collagene reticolazione e ECM irrigidimento 9. Recenti esperimenti mostrano che di carcinoma del colon umano (HCT-8), le cellule mostrano metastasi come fenotipo (MLP) quando sono coltivate su substrati 2D che hanno rigidità fisiologicamente rilevanti (20-47 kPa), ma non molto rigida (3,6 GPa) substrati 10- 12 .Queste cellule prima forma gruppi di cellule tumorali-simili e poi dissociano l&#39;una dall&#39;altra, partendo dalla periferia. Dato che questo epiteliale a arrotondata morfologica (E transizione R) cambiamento si verifica, proliferano, ridurre cellula-cellula e cellula-ECM adesione, e diventare migratori. HCT-8 celle coltivate su substrati di polistirolo molto duri non presentano questetratti maligni. Così è stato ipotizzato che HCT-8 cellule diventano metastatiche a causa della loro esposizione ai appropriato microambiente. Vale la pena notare che questi esperimenti sono condotti con linee cellulari tumorali murine immortalizzate o derivati ​​pile, non con cellule primarie tumorali umane. Uno studio recente propone aumentata sforzo di trazione cellulare può essere utilizzato come potenziale firma biofisico per cellule metastatiche 13 studio .Il comporta la misurazione della forza di trazione per diverse linee cellulari tumorali umane su gel di poliacrilammide. Si è trovato che le cellule tumorali metastatiche possono esercitare significativamente maggiore sforzo di trazione rispetto alle cellule non-metastatiche in tutti i casi 13. Tuttavia, questi risultati contraddicono direttamente i risultati precedentemente pubblicate su murine derivate linee cellulari di cancro al seno 14. Inoltre, un recente studio mette in luce notevoli differenze tra le cellule umane immortalizzate e primarie nel loro rimodellamento pro citoscheletroprofiling TEIN e la sopravvivenza delle cellule proteina espressione 15. Quindi, è importante rivisitare molti dei saggi biofisici compreso trazione per cellule primarie tumorali umane. Questo affronterà la questione se le cellule primarie ricapitolano immortalato linee cellulari tumorali tendenza trazione. Il protocollo qui descritto è ottimizzato per l&#39;isolamento di cellule primarie umane colon (sani e cancerosi), e per loro coltura su substrati molli (idrogeli poliacrilammide) nonché su piastre di Petri. Il protocollo si basa sulla digestione e la conseguente dissociazione enzimatica di campione di tessuto chirurgico in sospensione singola cella 16. A nostra conoscenza, questa è la prima dimostrazione di coltura isolato tumore primitivo del colon e cellule normali direttamente su substrati idrogel morbide con microsfere fluorescenti incorporati per trazione citometria. Substrati gel trasparenti consentono anche immunocolorazione. Questo test ha rivelato differenze nell&#39;organizzazione F-actina eadesioni focali in cellule del colon umani primari come cambiamenti substrato rigidità. Questa piattaforma coltura cellulare apre la possibilità di esplorare le varie proprietà biofisiche di cellule umane primarie come la rigidità delle cellule e la trazione come parametri per pronostici cancro.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Worthington</td><td>LS003736</td><td></td></tr><tr><td>Collagenese</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>3- Aminopropiltrythoxysilane (ATS)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Poliscienze, Inc.</td><td>01201-5</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>N-metilenebisacrilammide (bis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tampone HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina umana</td><td>BD biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Idrazina idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18412</td><td>Acido</td></tr><tr><td>acetico</td> pericoloso <td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>RT15710</td><td></td></tr><tr><td>Potenziatore del segnale Tecnologie</td> di <td>vita</td><td>I36933</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti vinculina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V9131</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>TRITC falloidina coniugati&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>0.1 &micro; m perline fluorescenti Life</td><td>technologies</td><td>F8801</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA</td><td>Life technologies</td><td>25200-056<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>12 mm2 glass cover slips</td><td>Corning</td><td>2865-12</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di primarie cellule del colon tumorali umane dai tessuti chirurgici e coltura direttamente su più elastica e flessibile substrati per trazione citometria

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Le cellule tumorali rispondono alla matrice rigidità meccanica in modo complesso con un sistema coordinato, gerarchico meccano-chimico composto di recettori di adesione e proteine ​​di membrana trasduzione del segnale associati, l&#39;architettura del citoscheletro, e motori molecolari 1, 2. Mechanosensitivity delle cellule tumorali in vitro sono differenti indagato principalmente linee cellulari immortali o murine derivate cellule primarie, non con cellule primarie tumorali umane. Quindi, poco si sa circa la mechanosensitivity di pile tumorali di colon umano in vitro. Qui, un protocollo ottimizzato è sviluppato che descrive l&#39;isolamento di cellule del colon umane primarie da campioni di tessuti umani sani e tumorali chirurgici. Isolate cellule del colon sono poi successo coltivate su substrati funzionalizzati da una matrice extracellulare morbido (2 kPa rigidità) e rigida (10 kPa rigidità) idrogel di poliacrilamide e polistirolo rigido (~ 3.6 GPa rigidità) (fibronectinain questo caso). Microsfere fluorescenti sono incorporati in morbido gel vicino alla superficie di coltura cellulare, e il dosaggio di trazione viene eseguita per valutare le sollecitazioni contrattili cellulari che utilizzano il software gratuito di accesso aperto. Inoltre, immunofluorescenza su diversi substrati rigidezza fornisce informazioni utili sul morfologia cellulare primaria, organizzazione citoscheletro e vinculina contenente adesioni focali in funzione del substrato rigidità.

Il protocollo di cui sopra è impiegata con successo per i campioni di tessuto multipli (n = 12) provenienti da quattro diversi pazienti secondo le linee guida del comitato istituzionale di revisione. La figura 1A illustra un tumore del colon-retto rappresentante destra dopo l&#39;intervento chirurgico, da cui si ottengono le sezioni di tessuto per colture cellulari. Una tipica sezione di tessuto in soluzione HBSS dopo il trasferimento alla cappa laminare per l&#39;ulteriore elaborazione è mostrato in <s...

Viene descritto un protocollo per estrarre cellule umane primarie dal tumore chirurgico del colon e dai tessuti normali. Le cellule isolate vengono poi coltivate su substrati elastici morbidi (idrogel di poliacrilammide) funzionalizzati da una proteina della matrice extracellulare e incorporati con microsfere fluorescenti. La citometria di trazione viene eseguita per valutare le sollecitazioni contrattili cellulari.

Isolamento di primarie cellule del colon tumorali umane dai tessuti chirurgici e Coltura direttamente su più elastica e flessibile substrati per trazione citometria

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule primarie da tumore del colon umano chirurgico, così come da tessuto normale, e coltivarle direttamente su substrati con diversa elasticità per l'analisi. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo tessuto chirurgico da un tumore del colon umano e da una regione normale. Successivamente, la dissociazione enzimatica del tessuto tritato produce numerose cellule singole.L'ultimo passaggio consiste nel coltivare le cellule isolate su idrogeli di poliacrilammide morbidi incorporati con microsfere fluorescenti a scala nanometrica e su piastre di polistirene. Infine, viene eseguita la citometria della trazione per ottenere una mappa spaziale delle trazioni cellulari e viene effettuata la microscopia a immunofluorescenza per visualizzare l'organizzazione del citoscheletro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che cellule primarie umane isolate da tessuti chirurgici possono essere coltivate direttamente su substrati con diversa rigidità per saggi di citometria della trazione e di microscopia a immunofluorescenza.Questo metodo può aiutarci a rispondere alla domanda se la contrattilità delle cellule tumorali primarie possa essere utilizzata come possibile marcatore per la prognosi del cancro. Per iniziare, raccogliere il campione di tessuto tumorale come descritto nel protocollo testuale. Quindi versare il tessuto in una piastra a sei pozzetti contenente da sei a sette millilitri di soluzione salina equilibrata di Hank o HBSS utilizzando una pipetta.Mantenere la piastra a sei pozzetti su un blocco di ghiaccio e risciacquare il tessuto con soluzione HBSS due volte. Successivamente, tagliare il tessuto in sezioni separate in modo netto utilizzando forbici sterili. Tritare il tessuto in frammenti più piccoli, di dimensioni non superiori a uno-due millimetri cubi, usando una lama sterile di bisturi.Pesare una provetta etichettata contenente una soluzione di tripsina allo 0,1% prima del trasferimento del tessuto. Quindi trasferire circa 20 milligrammi di tessuto in ciascuna delle provette con tripsina mediante pipetta. Pesare nuovamente le provette dopo il trasferimento del tessuto e registrare la differenza come massa del tessuto.Ora versare circa 20 milligrammi di tessuto e un millilitro di tripsina in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Posizionare la piastra a 24 pozzetti su un agitatore a quattro gradi Celsius per 16-20 ore. Dopo 16-20 ore di incubazione nella tripsina, utilizzare una pipetta per trasferire il tessuto in due-tre millilitri di mezzo di crescita completo a quattro gradi Celsius.Posizionare la provetta in un bagno d'acqua calda a 37 gradi Celsius per 12-15 minuti. Successivamente, trasferire il tessuto in una provetta da 15 millilitri contenente soluzione HBSS. Utilizzando una pipetta, agitare delicatamente e ripetere questo passaggio una seconda volta.Quindi rimuovere il tessuto dalla soluzione di HBSS e trasferirlo in una provetta contenente un millilitro di soluzione di 0,1% di collaghenasi. Incubare per 45 minuti a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% in un incubatore per colture cellulari umidificato. Durante questo periodo, riscaldare il mezzo di crescita in provette da 15 millilitri a 37 gradi Celsius. Successivamente, aspirare tutti i frammenti di tessuto in una punta di pipetta, minimizzando la quantità di collaghenasi, ed espellere soltanto i frammenti di tessuto nel mezzo di coltura preriscaldato.Provette con mezzo. Quindi posizionare un filtro da 40 micron in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti e inumidire il filtro con un millilitro di mezzo di coltura cellulare.Ripetere il passaggio del tessuto nel mezzo con una pipetta di vetro da 10 millilitri più volte fino a quando il tessuto non è completamente dissociato. Mantenere la punta della pipetta il più vicino possibile alla base del vial. Quindi depositare la soluzione sul filtro per rimuovere detriti e parti non associate.Centrifugare la sospensione cellulare filtrata nel mezzo a 150 ×g per cinque minuti. A temperatura ambiente, rimuovere il soprannatante successivamente e risospendere il pellet cellulare con due millilitri di mezzo di coltura fresco. Seminare le cellule primarie isolate su gel funzionalizzati con matrice extracellulare o ECM e piatti in polistirene alla concentrazione desiderata.Per eseguire il saggio di microscopia della forza di trazione, riscaldare prima al bagno maria a 37 gradi Celsius per 10 minuti la soluzione di trips 0,25% in EDTA 10% SDS. Prima degli esperimenti di trazione, prelevare un gel alla volta dall'incubatore per colture cellulari e posizionarlo sul palchetto del microscopio. Dopo aver individuato una singola cellula nel campo visivo, rimuovere il coperchio della piastra di Petri ed acquisire un'immagine in contrasto di fase della cellula.Successivamente, passare alla modalità di imaging a fluorescenza e selezionare il filtro appropriato. Non muovere la piastra del microscopio o il campione durante questo periodo. Quindi acquisire un'immagine delle perle fluorescenti spostate dalla trazione cellulare.Ora aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina-SDS nella piastra di Petri per staccare la cellula dal gel. Acquisire un'immagine di riferimento delle microsfere. Dopo la rimozione della cellula, trasferire i substrati da immunomarcare nell'incubatore a flusso laminare e rimuovere il mezzo di coltura. Quindi risciacquare i substrati con soluzione salina tamponata al fosfato o PBS e fissare le cellule con paraformaldeide al 4% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare i substrati con PBS per cinque minuti, per un totale di tre volte.Quindi incubare i substrati con 500 microlitri di potenziatore del segnale per 30 minuti prima di risciacquare con PBS. Successivamente, incubare le cellule con anticorpo monoclonale anti vanolin in una diluizione di uno a 250 in PBS per 45 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare i substrati con PBS per cinque minuti, per un totale di tre volte.Incubare i campioni con un anticorpo secondario LOR 4 88, anticorpo caprino anti-topo IgG, in una diluizione di uno a 200 in PBS a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, lavare nuovamente i substrati con PBS per cinque minuti, per un totale di tre volte. Per visualizzare la struttura dell'actina F, incubare le cellule con coniugati tetraetilrodamina-faloidina a una concentrazione di 50 microlitri per millilitro per 45 minuti a temperatura ambiente.Quindi lavare nuovamente i substrati come in precedenza. Infine, procedere all'acquisizione delle immagini dei campioni utilizzando un microscopio confocale a scansione laser. Le microfotografie in contrasto di fase illustrano la morfologia rappresentativa delle cellule primarie di cancro del colon umano e delle cellule normali. In funzione della rigidità del substrato, è evidente che le cellule primarie del colon si espandono maggiormente su piastre di polistirene rispetto ai gel di poliacrilamide.Gli saggi di trazione vengono eseguiti su gel morbidi rivestiti con matrice extracellulare di due chilopascal dopo aver confermato l'adenocarcinoma invasivo mediante colorazione istopatologica con ematossilina ed eosina. Qui viene mostrata un'istantanea delle microsfere fluorescenti a scala nanometrica incorporate all'interno del gel, ottenuta confrontando le immagini delle microsfere spostate con quelle di riferimento. I campi di spostamento sono ottenuti utilizzando il plugin di ImageJ per la velocimetria tramite immagini di particelle.Un campo rappresentativo di spostamento delle perline generato da cellule tumorali invasive del colon su un gel di due chilo pascal è mostrato insieme allo sforzo di trazione ottenuto. Utilizzando il plugin di ImageJ per la citoemetria di trazione mediante trasformata di Fourier corrispondente al campo di spostamento. Qui sono mostrati l'actina F e le adesioni focali contenenti cullina di cellule primarie umane del colon su gel morbidi da due chilopascal e su substrati rigidi di polistirene.Nessuna fibra di actina era presente nelle cellule meno espanse sui gel morbidi. Inoltre, sono presenti adesioni focali contenenti cullina di tipo puntiforme sui gel morbidi. Al contrario, le cellule primarie mostrano una morfologia ben espansa, fibre di actina e di stress ben definite e adesioni focali discrete ed allungate su substrati rigidi di polistirene.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la misurazione della rigidità cellulare mediante microscopia a forza atomica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare cellule del colon da tessuto chirurgico tramite dissociazione geomatica e coltivarle successivamente direttamente su idrogeli di poli acrilammide per valutare la contrattilità cellulare.

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Isolamento di primarie cellule del colon tumorali umane dai tessuti chirurgici e Coltura direttamente su più elastica e flessibile substrati per trazione citometria (Video) | JoVE Journal

Isolamento di primarie cellule del colon tumorali umane dai tessuti chirurgici e Coltura direttamente su più elastica e flessibile substrati per trazione citometria

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