Name: Th17 Infiammazione Modello di orofaringea candidosi in topi immunodeficienti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Scopri un modello di infiammazione orofaringea mediata da cellule Th17 in topi immunodeficienti con Candida albicans. Questo metodo permette di studiare l'immunopatologia T-cellulare e le potenziali terapie immunologiche orali.

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Ringraziamo la dottoressa Helene Bernstein per averci fornito l'accesso al suo citometro a flusso. Ringraziamo anche la struttura di citometria a flusso CFAR per i servizi di citometria a flusso. Questo progetto è stato in parte supportato dai finanziamenti CTSC per l'utilizzo del core e dalla sovvenzione STERIS corporation/University Hospitals-Division of Infectious diseases a PP.

NOTA: Gli esperimenti con i topi sono stati eseguiti in conformità al comitato benessere degli animali istituzionale (IACUC) le linee guida. 1. Ricostituzione della Rag-1 - / - I topi con cellule I n Vitro Colta Th17 (Tre giorni prima di infezione) <ol><li> Per stabilire le cellule Th17, cultura CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25- cellule T naive (3 x 104) in U-bottom 96 pozzetti da soli, o co-coltura con 3 x 104 CD4 + CD25 + Foxp3 + Tregs in presenza di solubile α-CD3 (1 mg / ml), α-CD28 (2 mg / ml) anticorpi e cellule presentanti l&#39;antigene, in condizioni Th17 (polarizzati utilizzando IL-6 (25 ng / ml), β TGF- (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 mg / ml) e α -IL-4 (2 mg / ml)) per tre o quattro giorni. NOTA: le cellule T reg ingenuo e sono stati ordinati con la fluorescenza delle cellule attivate (FACS) unad procedure di isolamento delle cellule magnetiche e coltivate come descritto in precedenza 19-22. </li><li> Il giorno 4, dopo risospendere le cellule Th17 con la pipetta, raccogliendoli da culture, e li centrifugare in condizioni sterili. <ol><li> Prendete una piccola aliquota di queste cellule per esaminare la loro vitalità e per fenotipizzazione. Li Risospendere in 500 ml di RPMI media, aggiungere ioduro di propidio (200 ng / ml) e valutare immediatamente la loro redditività mediante citometria a flusso. Eseguire fenotipizzazione mediante citometria di flusso valutazione della produzione di IL-17A dopo restimolazione (vedere paragrafo 6.3). </li></ol></li><li> Centrifugare e lavare la parte più consistente delle cellule in PBS sterile a 480 xg per 6 minuti a 4 ° C in tutte le fasi se non diversamente specificato. </li><li> Utilizzare queste cellule per il trasferimento adottivo in 6-8 settimane di età CD45.2 Rag1 - / - topi immunodeficienti. <ol><li> Risospendere le cellule a densità cellulare 1 x 10 7 cellule / ml usando freddo sterile PBS. </li><li> Iniettare 100 ml di cellule di intrapiniezione eritoneal, con 25 aghi G su 1 ml siringhe tubercolina, tale che un mouse riceve 1 x 10 6 cellule. Alcuni topi riceveranno cellule Th17 o PBS solo, e altri topi riceveranno cellule Th17 che erano co-coltura con cellule Treg. NOTA: Eseguire tutte le operazioni in modo asettico. </li></ol></li></ol> 2. Crescere C. albicans per infezione (un giorno prima infezione) <ol><li> Prima di inoculazione, disperdere cinque colonie della CAF2-1 C. albicans ceppo di laboratorio in 100 ml di sospensione sterile PBS, e aggiungere la sospensione al brodo sterile. </li><li> Seminare 5 colonie di C. albicans in 50 ml della base di azoto di lievito (YNB senza amminoacidi) / Peptone / Destrosio brodo e incubare in un incubatore shaker a 30 ° C per 15-18 ore a 130 rpm. </li><li> Monitorare il brodo per nuvolosità, dato che è un&#39;indicazione per la crescita del fungo. </li></ol> 3. CandidaRaccolta e procedura di conteggio (Nel giorno di infezione) <ol><li> Raccogliere 10 ml di brodo di Candida in provette da 15 ml. Per volumi maggiori, raccogliere Candida in 50 ml provette. </li><li> Centrifugare le blastospores a 1900 xg per 5 minuti a temperatura ambiente in tutte le fasi, se non diversamente specificato. Agglomerare le blastospores mediante centrifugazione, seguita dalla rimozione del supernatante. </li><li> Se vi è più di un tubo, in comune i blastospores Candida da più tubi, aggiungendo PBS sterile al pellet e risospendere in 10 ml di PBS per il conteggio. </li><li> Prendere 20 ml di blastospores in provette da 1,5 ml microcentrifuga, aggiungere 20 ml di paraformaldeide 2X e incubare a temperatura ambiente per 15-20 minuti. Contare le blastospores fissi utilizzando il emocitometro sotto il microscopio. NOTA: Paraformaldeide è cancerogeno. Aprire la soluzione diluita solo nella cappa. </li><li> Nel frattempo, ripetere lavare i blastospores almeno due volte, per centrifugazione them in PBS, e pellet le blastospores. Tenere il pellet in 15 ml provette a RT, nella cappa ABSL1, pronto per l&#39;infezione. </li><li> Lascia un po &#39;sterile PBS a temperatura ambiente per risospendere le blastospores di infezione. </li><li> Dopo conteggio, aggiungere PBS sterile al pellet Blastospora per regolare il numero di cellule di lievito Blastospora a 2 x10 8 del lievito cellule / ml. Questa è la sospensione Blastospora che verrà utilizzato per infettare i topi. NOTA: Eseguire tutte le operazioni in modo asettico. </li></ol> 4. Topi Infezione (3-5 giorni dopo il trasferimento Cell) NOTA: La procedura di infezione di base viene eseguita come descritto in precedenza 19,23-25. <ol><li> Pesare il Rag-1 - / - topi che hanno ricevuto PBS o le cellule tre giorni prima. </li><li> Calcolare la dose di agenti anestetici che utilizzano il loro peso corporeo. Anestetizzare topi somministrando ketamina / xilazina miscela (16,1 mg / ml e 1,6 mg / ml), con 25 aghi G su 1 ml siringhe tubercolina, da intriniezione aperitoneal. <ol><li> Somministrare 50 ml per 10 g di peso corporeo. (Cioè, 0,8 mg di ketamina e 0,08 mg di xilazina / 10 g di peso corporeo o 80 mg di ketamina e 8 mg di xilazina per kg di peso corporeo, rispettivamente). Osservare per la risposta pizzico punta ogni 15 minuti dopo l&#39;anestesia. NOTA: Questo dosaggio indurrà 60-90 min di anestesia, che è sufficiente per la procedura di infezione. </li><li> Applicare il lubrificante pomata oftalmica negli occhi dei topi per evitare le cornee si secchi. Come il lubrificante occhio potrebbe seccarsi, ripetere la lubrificazione oftalmica ogni 45 min. </li></ol></li><li> Iniettare 1 ml di soluzione fisiologica (NaCl 0,9%) per via sottocutanea sul dorso adiacente alla zampa anteriore, per aiutare reidratazione dei topi durante l&#39;anestesia. </li><li> Ottenere un nuovo, gabbia pulita. Seguire la procedura di infezione un mouse alla volta, posizionando ciascun topo nella nuova gabbia volta infettati. Eseguire il / infezione farsa PBS prima, e poi passare alle gro infezione da Candidaups. </li><li> Prendete il mouse anestetizzato e aprire la bocca per rivelare la base della lingua. <ol><li> Inserire una sfera di diametro 3 millimetri di cotone saturato con 50 ml di PBS o Blastospora sospensione, sublinguale nella cavità orale per 90 min. Capovolgere il mouse ogni 15 minuti parte anteriore e posteriore per evitare congestione polmonare, assicurando che i batuffoli di cotone non si muovono. </li></ol></li><li> Impostare un timer per ogni topo per garantire 90 min di Sham o Candida inoculazione nella cavità orale. </li><li> Tenerli in una gabbia sotto la lampada di calore (4 metri di distanza), e ogni mouse su cuscinetti di gel di calore. </li><li> Assicurarsi che la lingua è ritirata all&#39;interno e lontano dai denti, per evitare i denti lacerano lingua. </li><li> Alla fine di 90 min, rimuovere il batuffolo di cotone dalla bocca del mouse. Guarda per qualsiasi mouse che può recuperare da anestesia prima di 75 minuti. In tal caso, le anestetizzare nuovo con ketamina (40 mg / kg) soltanto. </li></ol> 5. Posta immissioe Monitoraggio (durante la 90 min Anesthesia) <ol><li> Usare tamponi di gel di calore durante la 90 min anestesia. <ol><li> Per mantenere la temperatura corporea e per prevenire il soffocamento, non permettere topi per recuperare il normale assestamento del mouse corn-cob. </li></ol></li><li> Dopo il recupero dall&#39;anestesia, amministrare un ulteriore 1 ml di sterile 0,9% NaCl per via sottocutanea in due posizioni sul retro. </li><li> Tieniti cinque PBS (sham) topo inoculato per gabbia. Solo 1-2 Casa topi infettati per gabbia. </li><li> Compilare la scheda di procedura con le iniziali ogni giorno dopo la procedura di annotare i cambiamenti nel peso corporeo, governare le abitudini e la salute generale. </li></ol> 6. Valutare l&#39;infiammazione 6.1) La perdita di peso <ol><li> Pesare i topi ogni giorno durante l&#39;infezione, a partire dal giorno precedente procedura di infezione. NOTA: in genere, i topi immunodeficienti iniettati con le cellule Th17 e senza regs T soccombono 20-30% Di perdita di peso a causa di maggiore onere fungina 19 e aggravata infiammazione. </li></ol> 6.2) Istologia punteggio della lingua <ol><li> Sacrifica i topi da CO 2 asfissia seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Aprire le ganasce e sezionare fuori la lingua con le forbici e pinze. Utilizzare pinze smussato per tenere la lingua, e utilizzando le forbici protendono verso il retro della bocca di incidere all&#39;estremità posteriore della lingua. </li><li> Per ematossilina immunocitochimica e eosina (H &amp; E) colorazione dei tessuti lingua, lavare i tessuti lingua con ghiaccio freddo PBS. Aggiungere 5 ml di formalina al 10% per 2-3 lingue e fissarli O / N in provette da 15 ml. <ol><li> Il giorno successivo, togliere formalina e immergere i tessuti in 5 ml di etanolo al 70% per evitare iper-fissazione. Send them out al servizio commerciale per continuare con paraffina, sezionamento e colorazione delle sezioni di paraffina. NOTA: istologia servizio commerciale viene utilizzato per eseguire questa procedura. </li&gt; </ol></li><li> Una volta che le diapositive sono tornati dal servizio istologia commerciale, di grado l&#39;infiammazione osservando le sezioni di tessuto al microscopio ottico. <ol><li> Punteggio da 0 a 5, con 0 essendo senza infiammazione, e 5 è l&#39;infiammazione più grave. Nota l&#39;infiammazione utilizzando Tabella 1. </li></ol></li></ol> 6.3) la produzione di citochine da parte delle cellule Th17 NOTA: L&#39;eccessiva produzione di TNF-α è una delle letture per eccessiva immunopatologia. Quando i topi sono adoptively trasferiti con cellule Th17 solo, provoca immunopatologia associato eccessiva produzione di TNF-α nelle cellule Th17. <ol><li> Raccogliere una sospensione singola cellula da milza, linfonodi cervicali, linfonodi ascellari, e la lingua, usando i metodi descritti in precedenza 19,26. </li><li> Restimolare le cellule con acetato di forbolo miristato (PMA) (50 ng / ml) e Ionomicina (500 ng / ml) per 4 ore con Brefeldina A (10 mg / ml) aggiunto nella last 2 hr. Lavare le cellule con PBS e fissare utilizzando un kit di fissaggio / permeabilizzazione commerciale secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Eseguire intra citochine cellulari colorazione utilizzando il fluorocromo coniugato anti-TNF-α, anti-IL-17A e anticorpi ROR-γt come descritto in precedenza 19. </li><li> Brevemente, risospendere le cellule nel buffer permeabilizzazione 1X con il cocktail anti-TNF-α, anti-IL-17A e anticorpi ROR-γt, ciascun anticorpo a 2 - 3 g / ml concentrazione finale. </li><li> Incubare le cellule per 1 ora a RT. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, lavare le cellule con tampone permeabilizzazione 1X. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 500 ml di PBS con 0.5% albumina sierica bovina per citometria a flusso. </li></ol>

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<li>Quintin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+NK+cells+against+Candida+albicans+infection+in+immunocompetent+or+immunocompromised+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice.</a> Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).</li>
<li>Ramirez-Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+and+cancer%3A+Can+this+yeast+induce+cancer+development+or+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+In+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression.</a> Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo modello è basato su indurre orale C. infezione albicans dipendente infiammazione Th17. A causa della mancanza di T reg, l&#39;infiammazione delle cellule Th17 indotta è sfrenato e porta a immunopatologia mal risolto. In vitro derivato cellule CD4 naive polarizzate come le cellule Th17 sono stati utilizzati per il trasferimento adottivo. 40 - 50% della coltura CD4 + cellule mostrano rilevabile espressione di IL-17A intorno al giorno 3 (cellule Th17), e quindi sono stati utiliz...

Le infezioni orali e l'infiammazione sono state correlate al cancro e alle malattie cardiovascolari e hanno un impatto drammatico sulla salute umana generale2,3. Le infezioni opportunistiche e l'infiammazione causate da C. albicans sono associate a immunodeficienze primarie (PID)4,5, disturbi infiammatori come la parodontite 6,7, la sindrome di Sjogren e la malattia delle ghiandole salivari8,9, nonché il carcinoma orale a cellule squamose 10-12. C. albicans è un fungo commensale dimorfico che colonizza la bocca del 60% degli esseri umani sani in modo asintomatico, ma è il patogeno fungino più comune che causa infezioni quando la difesa dell'ospite è indebolita13-15. Provoca infezioni e infiammazioni ricorrenti e croniche nei pazienti con AIDS e PID, e anche in altri individui immunocompromessi. Come commensale, il suo carico di colonizzazione è associato al cambiamento nella diversità del microbioma orale complessivo16. Come agente patogeno provoca diverse forme di candidosi orofaringea come la pseudomembranosa acuta, l'atrofica acuta, l'atrofica cronica, l'ipertrofica/iperplastica cronica e la cheilite angolare. 
La protezione contro C. albicans è determinata non solo dalla resistenza immunitaria dell'ospite, ma anche dalla capacità di controllare in modo appropriato l'immunopatologia indotta dalla Candida. Sebbene i commensali come C. albicans contribuiscano alla modulazione e all'esacerbazione di altre condizioni infiammatorie orali, i meccanismi attraverso i quali si verifica la disbiosi durante le infezioni opportunistiche non sono chiari. Oltre al ruolo noto delle cellule Th17 adattative nella risposta alla memoria a C. albicans17, il loro ruolo nell'inizio e nella perpetuazione della patologia infiammatoria durante le infezioni croniche rimane poco chiaro. Inoltre, le malattie infiammatorie orali come la sindrome di Sjogren e la parodontite sono associate alla patologia mediata da Th17. È interessante notare che queste malattie sono anche fortemente associate a frequenti OPC. Tuttavia, le interazioni tra le cellule Th17, l'immunopatologia orale dell'OPC e altre malattie infiammatorie orali non sono studiate. 
Sebbene siano disponibili modelli murini di infezione primaria e secondaria da candidosi orale, non è disponibile un modello murino per studiare l'infiammazione Th17 associata all'infezione da Candida, specialmente nel contesto dell'immunodeficienza. Questo studio presenta un metodo per stabilire l'infiammazione orale Th17 associata all'infezione orale da Candida nei topi. L'infezione da Candida nei topi è caratterizzata da lesioni fungine, infiammazione della lingua, diminuzione dell'assunzione di cibo, perdita di peso e, infine, uno stato moribondo. La patologia orale assomiglia alle lesioni da infezione candidale cronica, così come alla displasia epiteliale nei modelli murini di cancro orale12,18.

<table><tbody><tr><td>CAF-2</td><td>Università di Pittsburgh (Sarah Gaffen)</td><td>-</td><td>Coltura Candida</td></tr><tr><td>U-fondo 96 piastre pozzetti&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>055588</td><td>Utilizzato per colture cellulari</td></tr><tr><td>a-CD3&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>Polarizzazione delle cellule alle condizioni Th17</td></tr><tr><td>a-CD28&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>Polarizzazione delle cellule alle condizioni Th17</td></tr><tr><td>m-IL-6</td><td>Bio Basic</td><td>RC232</td><td>Polarizzazione delle cellule alle condizioni Th17</td></tr><tr><td>h-TGF-b&nbsp;</td><td>R& D</td><td>240-B</td><td>Polarizzazione delle cellule alle condizioni Th17</td></tr><tr><td>a-IFN-g&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-7311-85</td><td>Polarizzazione delle cellule alle condizioni Th17</td></tr><tr><td>a-IL-4&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-7041-85</td><td>Polarizzazione delle cellule alle condizioni Th17</td></tr><tr><td>&alpha;-IL17A ef660</td><td>eBiosciences</td><td>50-7177-82</td><td>Utilizzato per la coltura cellulare - 1:50</td></tr><tr><td>&alpha;-TNFa-PE-Cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-7423-41</td><td>Utilizzato per la coltura cellulare - 1:100</td></tr><tr><td>&alpha;-RORgt PE&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>12-6981-82</td><td>Utilizzato per colture cellulari - 1:50</td></tr><tr><td>YNB senza aminoacidi)/Peptone/Destrosio brodo di terreno&nbsp;</td><td>Bio Base</td><td>S507. TAGLIA</td><td>Mediium per la crescita della candida</td></tr><tr><td>Incubatore Shaker&nbsp;</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4300</td><td>Crescita di incubazione per candida</td></tr><tr><td>Provette da 15 ml</td><td>Bio Basic</td><td>BT888-SY</td><td>Utilizzato per la coltura cellulare e la crescita della candida</td></tr><tr><td>Provette da 50 ml</td><td>Bio Basic</td><td>CT 788-YS</td><td>Utilizzato per la coltura cellulare e la crescita della candida</td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo</td><td>VWR International LLC</td><td>82017-654</td><td>Per la pellettatura della candida -900 g</td></tr><tr><td>Allegra Centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>392302</td><td>Colture cellulari - 480 g</td></tr><tr><td>1,5 ml di provette eppendorf</td><td>Bio Basic</td><td>BT620-NS</td><td>Preparazione della concentrazione finale di candida</td></tr><tr><td>2x paraformaldeide Microscopia</td><td>elettronica Scienze</td><td>15710</td><td>Fissaggio della candida per il conteggio</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>VWR International LLC</td><td>15170-172</td><td>Conteggio delle cellule</td></tr><tr><td>PBS - Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Bio Basic</td><td>PD8117</td><td>Preparazione di tamponi</td></tr><tr><td>Ketamina/xilazina&nbsp;</td><td>Case Western Reserve University - Animal Resource</td> <td>Center-Ottenuto</td> <td>dal protocollo approvato ARC per l'anestesia</td></tr><tr><td>Unguento lubrificante oftalmico&nbsp;</td><td>Unguento allergan-Eye</td><td></td> <td>per animali per prevenire la secchezza</td></tr><tr><td>Soluzione salina (0,9% NaCl)</td><td>G Biosciences</td><td>786-561</td><td>Somministrato agli animali per prevenire la disidratazione</td></tr><tr><td>batuffolo di cotone da 3 mm di diametro&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>BP7603</td><td>Sfere da 3 mm per l'infezione da candida</td></tr><tr><td>Cuscinetti in gel termico</td><td>Case Western Reserve University - Animal Resource</td> <td>Center-per</td> <td>il mantenimento della temperatura corporea e un rapido recupero</td></tr><tr><td>Colorazione con ematossilina ed eosina</td><td>Histoserv - MD-Istologia</td><td></td> <td>tissutale</td></tr><tr><td>10% formalina&nbsp;</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>JC1111 / MC</td><td>Istologia tissutale</td></tr><tr><td>70% etanolo&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>97064-490</td><td>Scopo di sterilizzazione</td></tr><tr><td>PMA - Forbolo 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>Restimolazione delle cellule</td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Life Technologies</td><td>124222 1mg</td><td>Restimolazione delle cellule</td></tr><tr><td>Kit di permeabilizzazione di fissazione</td><td>eBiosciences</td><td>E16913-106</td><td>Cellule di fissaggio per citometria a flusso</td></tr><tr><td>Siringhe per tubercolina</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td>Iniezione di topi</td></tr><tr><td>25 G x 3/8 aghi</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>Iniezione di topi</td></tr><tr><td>Rag1 -/- topi</td><td>Jackson laboratories</td><td>Codice prodotto: 002216</td><td>Topi riceventi</td></tr><tr><td>CD45.1 topi congenici</td><td>Jackson laboratories</td><td>Codice prodotto:002014&nbsp;</td><td>Cellule Th17 del donatore</td></tr><tr><td>CB17-SCID topi</td><td>Jackson laboratories</td><td>Codice prodotto: 001303</td><td>Topi riceventi Topi</td></tr><tr><td>Balb/c Jackson</td><td>laboratories</td><td>Codice prodotto: 000651</td><td>Cellule Th17 donatrici</td></tr></tbody></table>

th17 infiammazione modello di orofaringea candidosi in topi immunodeficienti

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

'La candidosi orofaringea (OPC) è causata non solo dalla mancanza di resistenza immunitaria dell'ospite, ma anche dall'assenza di un'appropriata regolazione dell'immunopatologia indotta dall'infezione. Sebbene le cellule Th17 siano implicate nella difesa antifungina, il loro ruolo nell'immunopatologia non è chiaro. Questo studio presenta un metodo per stabilire l'immunopatologia orale Th17 associata all'infezione orale da candida nei topi immunodeficienti. Il metodo si basa sulla ricostituzione di topi linfopenici con cellule Th17 coltivate in vitro, seguita da un'infezione orale con Candida albicans (C. albicans). I risultati mostrano che le cellule Th17 non trattenute provocano infiammazione e patologia ed è associata a diverse letture misurabili tra cui la perdita di peso, la produzione di citochine pro-infiammatorie, l'istopatologia della lingua e la mortalità, dimostrando che questo modello può essere prezioso nello studio dell'immunopatologia OPC. Il trasferimento adottivo di cellule regolatorie (Treg) controlla e riduce la risposta infiammatoria, dimostrando che questo modello può essere utilizzato per testare nuove strategie per contrastare l'infiammazione orale. Questo modello può essere applicabile anche nello studio dell'immunopatologia orale Th17 in generale nel contesto di altre malattie orali.

In questo modello, sia i topi -infected Candida e topi non infetti in Rag-1 - / - sfondo immunodeficienti sono state adoptively trasferiti con le cellule Th17 3-5 giorni prima l&#39;infezione. Un totale di 10-12 topi sono stati utilizzati per gli esperimenti, con 2 topi in ciascun sham infettati gruppi, e 4-5 in ciascuno dei gruppi infetti Candida. Cellule naive sono stati ottenuti da congenici Thy1.1 o CD45.1 topi, in modo che le cellule Th17 iniettate sono stati monitorati in vivo...

Sebbene siano disponibili modelli di infezione da Candida per studiare la resistenza immunitaria dell'ospite, è assente un modello per studiare l'immunopatologia mediata dalle cellule T nel contesto dell'infezione da Candida. Qui descriviamo un metodo per stabilire l'immunopatologia Th17 associata all'infezione orale da Candida nei topi immunodeficienti.

Th17 Infiammazione Modello di orofaringea candidosi in topi immunodeficienti

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare un modello di infiammazione orale dipendente da infezione mediata da cellule TH17 patologiche. Questo viene ottenuto innanzitutto iniettando cellule TH17 in topi immunodeficienti. Il passaggio successivo consiste nel coltivare il fungo Candida albicans, raccogliere le blastospore e prepararle in soluzione salina tampone al fosfato (PBS).L'ultimo passaggio consiste nell'iniettare oralmente nei topi le spore di blasto per indurre la proliferazione delle cellule TH17 iniettate e provocare un'infiammazione orale. I risultati mostrano che i topi iniettati con TH17 sviluppano perdita di peso e infiammazione della lingua, come evidenziato dall'analisi mediante citometria a flusso e immunohistochemia del tessuto linguale. Le implicazioni di questa tecnica si estendono pertanto alla immunoterapia orale, grazie a questo modello murino.Il modello di infiammazione TH17 può essere utilizzato anche per studiare l'infiammazione TH17 nel contesto di altre malattie orali, dimostrando che la procedura sarà me e vascolare azotato, e un ricercatore post-dottorato nel mio laboratorio. Questa procedura richiede cellule T naive precedentemente selezionate mediante FACS e, opzionalmente, cellule Treg per stabilire una coltura di cellule TH17 CD4 positivo, CD44 basso, CD62L alto, CD25 negativo in piastre UBO da 96 pozzetti a 30.000 cellule per pozzetto in condizioni TH17 per tre o quattro giorni; come controllo, le cellule T naive possono essere coltivate insieme a 30.000 cellule Treg CD4 positivo, CD25 positivo, FOX P3 positivo nelle stesse condizioni di coltura per generare cellule TH17. Dopo quattro giorni di coltura, raccogliere le cellule TH17 utilizzando una pipetta.Mettere da parte un'aliquote piccola per esaminarne la vitalità. Sospendere queste cellule in mezzo millilitro di RPMI e aggiungere 100 nanogrammi di ioduro di propidio. Per l'analisi tramite fax, la maggior parte delle cellule viene raccolta e preparata per l'iniezione cellulare.La maggior parte delle cellule deve essere lavata in PBS e centrifugata, quindi preparata per l'iniezione nei topi. Alla concentrazione di 10 milioni di cellule per millilitro in PBS freddo, iniettare nei topi 100 microlitri della sospensione cellulare per via intraperitoneale utilizzando un ago da 25 gauge. Altri topi devono essere iniettati con PBS o con cellule di controllo TH17/Treg co-colture. Programmare l'infezione dei topi con C. albicans tra tre e cinque giorni, il giorno precedente.Infettare i topi con C albicans, disperdendo cinque colonie del ceppo di laboratorio CAF due trattino uno in 100 microlitri di PBS sterile e aggiungere la sospensione a 20 millilitri di brodo sterile. Lasciare crescere il terreno inoculato tutta la notte a 30 gradi Celsius con un'agitazione di 130 giri al minuto. Il giorno successivo, raccogliere 10 millilitri della coltura in un tubo da 15 millilitri, quindi centrifugare l'Eloqua a 1900 G per cinque minuti.A temperatura ambiente, il pellet contiene le spore di blasto e il sedimento deve essere scartato. Riunire tutte le spore di blasto raccolte in 10 millilitri di PBS sterile e trasferire un'aliquota di 20 microlitri in un tubo da microcentrifuga. Aggiungere 20 microlitri di due XPFA all'aliquota e, dopo 15-20 minuti di fissazione, contare le spore di blasto utilizzando un emocitometro durante il periodo di fissazione.Lavare la maggior parte delle spore blastoconidiche con PBS almeno altre due volte. Conservare i pellet di spore blastoconidiche in un capo a flusso laminare AB SL a temperatura ambiente fino a quando non si conosce il numero. Quindi risospendere le spore blastoconidiche in PBS a temperatura ambiente a 200 milioni di cellule per millilitro.Mantenere le cellule pronte per infettare i topi. Questo metodo è stato esaminato in precedenza, ma verrà brevemente ripreso in questa sezione. Innanzitutto, anestetizzare i topi, confermare il loro stato di anestesia e applicare un unguento oftalmico.L'applicazione deve essere ripetuta dopo 45 minuti. Successivamente per via sottocutanea. Iniettare un millilitro di soluzione salina per l'idratazione, lavorando un topo alla volta.Prima infettare il gruppo sham e poi il gruppo candida. Preparare una pallina di cotone di tre millimetri di diametro saturandola con 50 microlitri di PBS o di sospensione di blasto spore. Quindi accedere alla base della lingua e posizionare la pallina di cotone in quella sede.Assicurarsi che la lingua sia ritirata all'interno e lontana dai denti per evitare lacerazioni. Successivamente, trasferire il topo nella propria gabbia di recupero su un tappetino riscaldato. Non utilizzare trucioli di mais come lettiera nella gabbia, altrimenti il tappetino riscaldato non trasferirà calore sufficiente; posizionare una lampada riscaldante a quattro piedi sopra la posizione della gabbia di recupero.La pallina di cotone deve rimanere al suo posto per 90 minuti. Ogni topo deve avere un timer individuale di conteggio alla rovescia di 90 minuti. Durante questo periodo, ogni topo deve essere girato da un lato all'altro ogni 15 minuti per prevenire la congestione polmonare.Pertanto, il passaggio singolarmente più critico dell'intero procedimento è assicurarsi che la pallina di cotone rimanga al suo posto per tutto il tempo di inoculazione. Se un topo inizia a riprendersi dall'anestesia in modo prematuro, riindurlo utilizzando soltanto ketamina. Dopo 90 minuti, rimuovere la pallina e osservare il recupero dell'animale.Dopo il recupero, somministrare un ulteriore millilitro di soluzione salina in due punti della schiena per una maggiore idratazione. Dopo la procedura, fino a cinque topi inoculati con soluzione placebo possono condividere una gabbia utilizzando linfociti T naïve derivati da topi thigh 1.1 o CD 45.1. È stata seguita la procedura descritta e i linfociti T iniettati sono stati tracciati mediante i rispettivi marcatori.I Treg trasferiti per co-trasferimento sono stati ottenuti da topi CD45.2 e sono stati tracciati anche solo mediante questo marcatore. Nei topi infettati da Candida si è osservato il reclutamento e l'espansione delle cellule TH17 iniettate. Dopo l'infezione, è stata monitorata la perdita di peso.I topi inoculati soltanto con cellule TH17 hanno perso peso in modo progressivo e alcuni sono dovuti essere sottoposti a eutanasia. Al contrario, la perdita di peso negli altri gruppi alla fine si è arrestata. I topi inoculati con la coltura coadiuvata da Treg hanno mostrato un numero molto inferiore di cellule produttrici di TNF alfa quattro giorni dopo l'infezione.La presenza prolungata di cellule produttrici di TNF Alfa indica che i topi inoculati solo con TH 17 avevano infezioni e infiammazioni non risolte. Le lingue dei topi inoculati con tregs mostravano inoltre infiltrati infiammatori molto meno numerosi e una minore crescita fungina. Nello stesso punto temporale, la presenza prolungata di infiltrati infiammatori dimostra che i topi inoculati solo con TH 17 presentavano infezioni e infiammazioni non risolte. Una volta acquisita padronanza della tecnica, questa procedura di infezione può essere eseguita in tre ore per quattro topi, con ulteriori 15 minuti aggiuntivi per ogni topo da infettare.

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