Name: Tensione e Calcio mappatura ottica a doppio canale di Colta HL-1 atriale miociti monostrato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Impara la mappatura ottica a doppio canale di tensione e calcio in monostrati di miociti atriali HL-1. Questo metodo consente la visualizzazione simultanea dei segnali elettrici e del calcio per studiare l'elettrofisiologia cardiaca.

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Vorremmo ringraziare il Dott Claycomb per la fornitura di cellule HL-1 e protocollo dettagliato di manutenzione. Vorremmo anche ringraziare la signora Elena Carrillo e il Dr. Seth Robia per la loro assistenza con la generazione di film cellulare e Mr. Pete Caron per la sua assistenza con fare alcuni accessori per il nostro sistema duale mappatura ottica del canale. Questo lavoro è stato sostenuto da American Heart Association (10GRNT3770030 &amp; 12GRNT12050478 a XA), National Institutes of Health (HL113640 a XA), e Loyola University Development Fund Research (a XA).

1. Soluzione Preparazione <ol><li> Soluzione noradrenalina (NP) <ol><li> Sciogliere 40 mg di NP in 25 ml di 30 mM acido ascorbico (0,1475 g di acido ascorbico in 25 ml di Milli-Q (MQ) acqua depurata. Evitare l&#39;esposizione alla luce diretta durante la preparazione della soluzione perché noradrenalina (NP) è sensibile alla luce. </li><li> Filtrare la soluzione NP con un filtro a siringa da 0,22 micron. Aliquota della soluzione in 1 ml microtubi sterile e conservare a -20 ° C. Una volta congelato, NP è stabile per un mese. </li></ol></li><li> Integrata Lavare e Final Claycomb supporti <ol><li> Iniziare con 43,5 ml di Claycomb medio e integrare con 5 ml di siero bovino fetale (FBS), 0,5 ml di penicillina / streptomicina, 0,5 ml di NP e 1: 100 diluito L-Glutammina fare 50 ml di mezzo finale Claycomb integrato. Evitare l&#39;esposizione alla luce diretta durante la preparazione della soluzione perché Claycomb mezzo è sensibile alla luce. </li><li> Preparare il supporto Lavare Claycomb utilizzando la stessa ricetta del supsere realizzata Claycomb media tranne aggiungere 5% FBS e omettere la NP e componenti L-glutammina. NOTA: I media finale e Wash Claycomb integrati sono buoni per due settimane se conservato a 4 ° C senza l&#39;esposizione alla luce diretta. </li></ol></li><li> Soia soluzione inibitorio tripsina <ol><li> Sciogliere 25 mg di inibitore della tripsina di soia in 100 ml di tampone fosfato salino Ca-free e Mg-libera di Dulbecco (PBS). </li><li> Filtrare la soluzione con un filtro a siringa da 0,22 micron. NOTA: La soluzione sterilizzata è stabile per un mese se conservato a 4 ° C. </li></ol></li><li> Gelatina / fibronectina soluzione di rivestimento piatto <ol><li> Sciogliere 0.1 g di gelatina in 500 ml di acqua per fare MQ 0,02% di gelatina. </li><li> Autoclave, quindi diluire 1 ml di fibronectina in 199 ml di 0,02% gelatina e mescolare delicatamente. </li><li> Aliquota 6 ml di soluzione di gelatina in tubi separati e conservare a -20 ° C. </li></ol></li><li> Soluzione Salt Hanks &#39; <ol><li> Utilizzando scalporepiastra, sciogliere i seguenti sali in acqua MQ (mmol / L), NaCl (136,9), KCl (5,366), KH 2 PO 4 (0,4409), NaH 2 PO 4 (0.4000), MgSO 4 (0,8142), D-Glc (5,051), NaHCO 3 (4.162), HEPES (5,042), CaCl 2 (1.261). </li></ol></li><li> Soluzione di calcio di colorante sensibile (Rhod2) <ol><li> Diluire 1 mg di polvere secca Rhod2 in 400 ml di 20% Pluronic F-127 in DMSO per fare un Rhod2 colorante soluzione madre e conservare a -20 ° C. </li><li> Diluire questa soluzione 1: 1000 con la soluzione Salt Hanks &#39;per ottenere una soluzione di lavoro finale prima di iniziare l&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Soluzione Tensione dye sensibili (Rh237) <ol><li> Diluire 5 mg di Rh237 con 2 ml di DMSO per rendere soluzione stock e conservare a -20 ° C. Diluire soluzione madre 1: 1000 con la soluzione Salt Hanks &#39;per fare una soluzione di lavoro finale prima di iniziare l&#39;esperimento. </li></ol></li></ol> &amp; #160; NOTA: 1-4 soluzioni sono basate sul HL-1 protocollo coltura cellulare Claycomb con lievi modifiche. 2. Passaging e Coltura HL-1 atriale miociti su vetrini NOTA: Le cellule HL-1 possono essere ottenuti dal Dr. Claycomb (Louisiana State University). <ol><li> Grow HL-1 le cellule in fiasche T25 e mangimi con 5 ml di integrazioni Claycomb media quotidiana. Passage le cellule T25 flaconi ogni cinque giorni secondo la HL-1 protocollo coltura cellulare Claycomb (descritto di seguito) 10. </li><li> Coprioggetto tondo Luogo (diametro 20 mm) in 12 pozzetti piastre di coltura 24 ore prima che le cellule del pallone T25 sono completamente confluenti e pronto per essere diversi passaggi, e quindi coprire i vetrini con gelatina / fibronectina notte a 37 ° C. </li><li> Il prossimo giorno, aspirare e scartare la gelatina / fibronectina dalle piastre di coltura e di sostituirlo con 1,5 ml di integrare media finale Claycomb in ogni pozzetto. </li><li> Cellule Spalato da una cultur T25e pallone dopo aver raggiunto piena confluenza al giorno 5. Aspirare il mezzo dal pallone T25 contenente la cultura confluenti e sciacquare la cultura brevemente con PBS a 37 ° C. </li><li> Aspirare PBS e aggiungere 3 ml di 0,05% tripsina / EDTA a 37 ° C pipettando la tripsina / EDTA sul fondo del pallone T25 per evitare il contatto diretto con le cellule. Incubare a 37 ° C per 1 min. </li><li> Rimuovere tripsina / EDTA tramite aspirazione e aggiungere un altro 1,3 ml di tripsina / EDTA per bombola T25. Incubare a temperatura ambiente per 1 min. Esaminare al microscopio e se le cellule sono ancora attaccate al pallone, toccare per rimuovere completamente le cellule rimanenti. </li><li> Aggiungere 1,3 ml di inibitore della tripsina di soia per le cellule e le cellule di trasferimento del pallone in un tubo da centrifuga da 15 ml. Lavare il pallone vuoto con 5 ml di Wash Claycomb media. Aggiungere il risciacquo delle cellule nella provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare a 500 g per 5 min. </li><li> Dopo centrifugazione, aspirare il surnatante e delicatamente risospendere il pellet cellularein 6 ml di mezzo integrato finale Claycomb. </li><li> Seme ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti con 0,5 ml di sospensione cellulare da passaging cellulare. Alimentare le cellule con fresca INTEGRAZIONI media finale Claycomb quotidiana. NOTA: Strettamente monitorare la crescita delle cellule, tipicamente i monostrati cellulari raggiungere stato confluenti il ​​giorno 4 e le attività spontanee rimangono visibili. Poi, il monostrato colta sarà pronto per la mappatura ottica giorno 4-5. </li></ol> 3. Caricamento di calcio e di tensione coloranti sensibili alle cellule <ol><li> Per gli studi di mappatura ottica, rimuovere delicatamente il vetrino dalla piastra di coltura cellulare 12-bene e risciacquare con la soluzione Salt Hanks &#39;. </li><li> Per colorare le cellule con Ca colorante sensibile Rhod2, incubare il monostrato di cellule sul vetrino con 3 ml della ossigenato (gorgogliare con 5% di CO 2/95% O 2 gas) soluzione Rhod2 lavorare a 37 ° C a bagnomaria per 30 min . </li><li> Per colorare le cellule con V m colorante sensibiliRh237, immergere il Rhod2 caricata monostrato cellulare in 3 ml di soluzione di lavoro Rh237 ossigenata a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua per altri 15 min. </li></ol> Mappatura 4. Dual Channel Optical <ol><li> Posizionare il monostrato cellulare, che è doppio macchiato con V m e coloranti Ca, in una camera di circolazione su un microscopio a fluorescenza invertito. Utilizzare un sistema di circolazione riscaldata per mantenere la temperatura della camera di cella a 35 ± 1 ° C. Controllare accuratamente la temperatura del perfusato regolando la velocità del flusso che circola attraverso la camera per evitare un gradiente di più di 0,3 ° C attraverso la camera. <ol><li> Prima di registrare V m / segnali Ca, lavare il monostrato cellulare con la soluzione Hanks fresco per circa 5 minuti per eliminare il colorante residuo dalle operazioni di colorazione precedenti. </li></ol></li><li> Pace monostrati cellulari sano utilizzando un elettrodo bipolare costituito da una pipetta di vetro riempita con una soluzione di Salt Hanks &#39;e silver fili avvolti intorno alla punta della pipetta come descritto in precedenza 12,17. </li><li> Pace monostrati di cellule sane in una durata del ciclo di 200-500 msec e polso larghezza di 2 ms, che prevedono una soglia di stimolazione a circa 1 mV. NOTA: per ogni lotto di monostrati coltivate, almeno due monostrati non trattati devono essere utilizzati per verificare la condizione del lotto cella. Monostrati di controllo sani dovrebbero essere in grado di essere catturato da una stimolazione elettrica a durata del ciclo di 200-500 msec. Se i monostrati di controllo non riescono a essere elettricamente ritmo, questo suggerisce che l&#39;intero lotto delle cellule non può essere adatto per esperimenti di mappatura ottica. </li><li> Per eccitare sia V m e Ca coloranti sensibili, utilizzare una sorgente di luce LED (520 nm) accoppiato con un filtro di eccitazione (510 nm / 40) e uno specchio dicroico (561 nm). <ol><li> Raccogliere i segnali fluorescenti emessi dalle cellule mediante un obiettivo 40X e split con uno specchio dicroico (594 nm) in un componente V m ed una componente Ca.Filtrare la luce emessa nel canale m V con un filtro passaggio lungo (700 nm) e la luce emessa nel canale Ca con un filtro passa banda (585/40 nm). </li><li> Raccogliere la luce fluorescente filtrata con due telecamere CCD (80 x 80 pixel, 1.000 fps; redshirt Imaging). </li><li> Per evitare dye photobleaching, effettuare registrazioni per meno di 2 secondi su ogni campo di vista di limitare il tempo di esposizione alla luce. Qui, l&#39;immagine tipicamente quattro aree diverse per ogni monostrato. </li></ol></li></ol> 5. Elaborazione dati di V mo Ca Recordings <ol><li> Per entrambi V m e segnali Ca (80 x 80 pixel), la media dei valori di intensità di venticinque (5 x 5) confinanti pixel in un valore di intensità in diversi momenti della registrazione per ridurre il rumore di fondo. NOTA: Dopo la media dei dati, ogni punto del tempo di registrazione di un potenziale d&#39;azione individuale o Ca transitoria produce una matrice di dati contenente 16 x 16 in media valori di intensità (mediacanali dati) con una risoluzione spaziale di 50 micron. </li><li> Definire tempo di attivazione (AT) di registrazione V m o segnali Ca. <ol><li> Per definire un tempo di attivazione (AT) di un potenziale d&#39;azione singola o Ca transitorio, determinare il tempo del 50% di ampiezza di picco V mo segnali Ca utilizzando un algoritmo basato su MATLAB misura come precedentemente descritto. 12 </li><li> Revisionare manualmente l&#39;ATS analizzato per eliminare eventuali errori che possono verificarsi durante l&#39;analisi del programma. </li><li> Conservare la definita AT matrice (16 x 16 in media i canali di dati) del potenziale d&#39;azione registrata e transitori di calcio, rispettivamente, nel software utilizzato. </li></ol></li><li> Calcola potenziale d&#39;azione o di calcio transitori velocità di conduzione (CV) vettori sulla matrice AT utilizzando il metodo di analisi campo vettoriale, come descritto in precedenza, con piccole modifiche 12,18. <ol><li> Calcolare il vettore CV di un canale dati relativi al suo circostante AT punti dati (5 ×; 5 vicina media canali dati) per simulare una superficie polinomiale liscia di tempi di attivazione (AT superficie) utilizzando un algoritmo di minimi quadrati all&#39;interno del programma MATLAB 12,18. </li><li> Calcolare la conduzione di vettore utilizzando le formule seguenti Formula 1: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52542/52542eq1.jpg" /> Formula 2: θ = arctan [(dy / dT) / (dx / dT)] NOTA: Ve è un vettore CV proiettata a xey assi; dx / dt è la proiezione del vettore CV in asse x; dy / dt è la proiezione del vettore CV in asse y. T è la superficie AT; x, y riferiscono alla 2-D coordinate; T x = ∂T / ∂x è la derivata parziale di T rispetto ax; T y = ∂T / ∂y è la derivata parziale di T rispetto a y; θ è la direzione finale di un vettore CV. </li><li> Gruppo tutti i vettori della matrice AT in 36 percorsi, ciascuno dei quali copre un settore di dieci gradi sulla bussola. &lt;/ Li&gt; <li> Selezionare il percorso che contiene la più grande popolazione dei vettori CV tra le 36 vie di conduzione. Calcolare il CV medio di questa via per rappresentare il CV del monostrato. </li></ol></li></ol> 6. Visualizzazione della propagazione delle onde anteriore <ol><li> Normalizzare l&#39;intensità di un potenziale d&#39;azione individuale o Ca transitoria a differenti tempi di registrazione relativi al suo valore di picco utilizzando il software MATLAB segnale. </li><li> Temporaneamente memorizzare i dati di intensità normalizzate di ogni punto di tempo registrato in una matrice di 16 x 16 intensità nel software MATLAB utilizzato. </li><li> Costruire una mappa di intensità codice colore dalla matrice intensità memorizzato di ogni punto di tempo di registrazione utilizzando la funzione surf.m. NOTA: Nella mappa intensità, rosso rappresenta elevata intensità del V mo segnali Ca, e blu riflette bassa intensità dei segnali di fluorescenza. </li><li> Creare un file .avi utilizzando la funzione avifile.m. </li><li> Salva tutto l&#39;imappe ntensity in diversi momenti della registrazione del potenziale d&#39;azione o Ca transitoria con la funzione addframe.m. NOTA: A questo punto, verranno generati due file avi separati di V m e Ca propagazione. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Questo articolo descrive gli aspetti chiave della mappatura ottica in una colta HL-1 atriale myocyte monostrato colorati con coloranti fluorescenti sensibili di calcio e di tensione. Esso comprende coltura un ottimo HL-1 monostrato cellulare, l&#39;installazione delle apparecchiature di mappatura, mappando un monostrato colta, e l&#39;analisi dei dati. Per mappare con successo cellule in coltura, la chiave è quello di preparare un monostrato cellulare uniformemente distribuito. Quando la sem...

Un calcio unico (Ca) e la tensione (V m) doppia mappatura ottica del canale tecnica 1-5 sta emergendo come uno strumento efficace per registrare simultaneamente i segnali V m e Ca sia cuori intatti e monostrati di cellule in coltura. Questa tecnica permette di ottenere informazioni potenti sul rapporto tra transienti di calcio e potenziali di azione per meglio comprendere i meccanismi elettrofisiologici sottostanti di aritmie cardiache. Monostrati di cellule in coltura hanno dimostrato di essere un modello cellulare utile per studiare elettrofisiologia cardiaca e il meccanismo alla base di aritmie. 4,6-8 HL-1 le cellule sono una linea di cultura myocyte atriale ben caratterizzato. Cellule HL-1 mantengono anche un genotipo e fenotipo differenziato in modo univoco che include morfologica, elettrofisiologico, e le caratteristiche farmacologiche di miociti atriali adulti. Queste cellule esprimono geni e proteine ​​cardiache, tra cui important canali ionici cardiaci (ie, L- e canali del calcio di tipo T) 9 e isoforme maturi di proteine ​​contrattili sarcomeriche normalmente presenti nei miociti atriali adulti come gli altri e ci hanno già segnalato. 10-13 Inoltre, HL-1 le cellule possono essere colta per formare un 2-dimensionale (2-D) miociti monostrato. Così, i vantaggi dell&#39;utilizzo di colture monostrato HL-1 sono: 1) il costo relativamente più basso e più facile da mantenere una linea di cultura miociti di isolare e coltura miociti neonatali primarie; 2) un monostrato confluente di cellule riduce la complessità strutturale che derivano dalla struttura 3-D del cuore; 3) un monostrato di cellule in grado di eliminare l&#39;interferenza della fibrosi interstiziale che si verifica nel cuore intatta. Questo può essere utilizzato per analizzare specifiche funzioni elettrofisiologiche di un gruppo di miociti senza interferenze di fibroblasti e matrice interstiziale; 4) valutazione delle conseguenze funzionali di manipolazione farmacologica o genetica in culmonostrati cellulari turati possono essere efficacemente raggiunti. Pertanto, HL-1 le cellule sono diventate un modello cellulare ampiamente utilizzato per studiare diversi aspetti della fisiologia miociti e attività elettriche anormali stimolazione indotta. 13-16 Tuttavia, la gestione e la cura speciale è richiesto per la cultura monostrati di cellule sane che rispondono a esterni La stimolazione elettrica per gli studi di mappatura ottica. Inoltre, la doppia procedura di tintura colorazione fluorescente potrebbe facilmente danneggiare l&#39;integrità della coltura monostrati di cellule confluenti. Pertanto, l&#39;esecuzione di V m / CA a doppio canale di mappatura ottica in coltura HL-1 monolayers è stata una grande sfida. L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di fornire i passaggi chiave per l&#39;esecuzione con successo doppia mappatura ottica del canale in coltura HL-1 monostrati. Qui abbiamo fornito ampi dettagli su un protocollo ottimizzato per la preparazione monostrato HL-1 cellule, doppia mappatura ottica canale di un monostrato di cellule in coltura, e l&#39;elaborazione dei dati di mappatura.

<table><tbody><tr><td>Rhod2 polvere secca</td><td>AAT Bioquest</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>pluronico</td><td>AAT Bioquest</td><td>20050</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Rh237</td><td>Invitrogen</td><td>S-1109</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>HEPE</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr></tbody></table>

tensione e calcio mappatura ottica a doppio canale di colta hl-1 atriale miociti monostrato

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Mappatura ottico ha dimostrato di essere una tecnica utile per rilevare l&#39;attività elettrica cardiaca sia cuori intatta ex vivo e in monostrati miociti in coltura. Cellule HL-1 sono stati ampiamente utilizzati come un modello cellulare 2-dimensionale per studiare diversi aspetti della fisiologia cardiaca. Tuttavia, è stata una grande sfida per la mappa otticamente calcio (Ca) transienti e potenziali d&#39;azione contemporaneamente dallo stesso campo visivo in una colta HL-1 monostrato cellulare atriale. Questo perché è necessario trattamento e la cura speciale per preparare le cellule sane che possono essere catturati elettricamente e otticamente mappate. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo di lavoro ottimale per la doppia mappatura ottica del canale. In questo manoscritto, abbiamo descritto in dettaglio come eseguire l&#39;esperimento di mappatura ottica doppio canale. Questo protocollo è uno strumento utile per migliorare la comprensione del potenziale d&#39;azione propagazione e cinetica Ca in sviluppo aritmia.

Un confluenti monostrato colto presenta un ritmo intrinseco regolare come dimostrato in Movie 1. Abbiamo quindi effettuato V m / Ca doppia mappatura ottica del canale in una completamente confluenti HL-1 monostrato. Figura 1A mostra esempi di tracce di V m e segnali Ca da una registrazione singola battere. Mappe isocrone rappresentativi di propagazione uniforme V m e segnali Ca utilizzando il sistema duale mappatura ottica canale sono mostrate nelle <str...

Questo articolo descrive la tecnica utilizzata per eseguire la mappatura ottica a doppio canale in monostrati di cellule atriali HL-1 in coltura. Questo protocollo unico consente la visualizzazione simultanea dell'attività del calcio (Ca) e del voltaggio (Vm) nella stessa area per il rilevamento e l'analisi dettagliati delle proprietà elettrofisiologiche dei monostrati di coltura.

Tensione e Calcio mappatura ottica a doppio canale di Colta HL-1 atriale miociti monostrato

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

L'obiettivo generale di questa procedura è mappare simultaneamente i potenziali transmembrana e i transitori di calcio in monocapati atriali HL uno carichi di coloranti per il calcio e per il voltaggio. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando le cellule HL uno su un cover slip fino a raggiungere una densità confluenza adeguata. Il secondo passaggio consiste nel caricare nei cellule i coloranti sensibili al calcio e al voltaggio.Successivamente, il monolayer di HL viene stimolato con un elettrodo bipolare. L'ultimo passaggio consiste nel registrare i potenziali d'azione e i segnali transitori del calcio mediante microscopia a fluorescenza. Infine, i tracciati del potenziale d'azione e del transitorio del calcio possono essere compilati per mostrare la propagazione dei segnali attraverso il monolayer confluenziale nel tempo.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'elettrofisiologia cardiaca, ad esempio in che modo calcio, transitori e potenziali d'azione siano correlati. Nelle proprietà elettrofisiologiche di cellule HL-1 in coltura sottoposte a diversi trattamenti farmacologici, sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui modelli di propagazione del potenziale d'azione e del transitorio calcico a livello microscopico, può essere applicato anche a sistemi biologici come cuori umani rimodellati patologicamente e modelli animali aritmogeni.Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontrano difficoltà perché le cellule HL-1, che mantengono fenotipi cardiaci murini, sono difficili da coltivare e richiedono un'ottimizzazione accurata. È necessario seguire il protocollo, la coltura del passaggio e il monolayer. Per iniziare, preparare tutte le soluzioni stock per l'esperimento come indicato nel protocollo testuale, coltivare le cellule HL-1 in fiaschi T25 e sostituire il mezzo con cinque millilitri di mezzo Claycomb integrato fresco ogni giorno.Le cellule dovrebbero essere pronte per il passaggio al giorno 5, 24 ore prima che le cellule HL raggiungano la confluenza. Posizionare coprivetrini rotondi da 20 millimetri nelle pozzette di una piastra da coltura a 12 pozzette. Aggiungere un millilitro di soluzione di gelatina-fibronectina in ogni pozzetta per ricoprire i coprivetrini, quindi incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi Celsius.Il giorno successivo, aspirare la soluzione di gelatina e fibronectina dalle pozzette della piastra per colture e quindi aggiungere 1,5 millilitri di mezzo finale arricchito di clay home in ogni pozzetta. Successivamente, aspirare il mezzo dal flask T25 contenente le cellule HL-1 e risciacquare brevemente la coltura con PBS a 37 gradi Celsius. Aspirare il PBS dal flask e aggiungere tre millilitri di soluzione di tripsina-EDTA nella parte inferiore del flask T25, facendo attenzione a non disturbare le cellule; abbassare delicatamente il flask e ruotarlo per ricoprire le cellule con la soluzione, quindi inserire il flask nell'incubatrice per un minuto a 37 gradi Celsius.Successivamente, aspirare con attenzione la soluzione tripsina-EDTA dalla coltura per non disturbare le cellule. Quindi aggiungere ulteriori 1,3 millilitri di soluzione tripsina-EDTA al flacone. Incubare il flacone a temperatura ambiente per un minuto aggiuntivo.Osservare le cellule al microscopio per determinare se si sono staccate dalla superficie della provetta. Toccare delicatamente la provetta per staccare eventuali cellule ancora aderenti. Una volta che tutte le cellule si sono staccate, aggiungere 1,3 millilitri della soluzione di inibitore della tripsina di soia alle cellule, quindi trasferire le cellule in un tubo da centrifuga da 15 millilitri.Risciacquare il matraccio vuoto con cinque millilitri del mezzo di lavaggio e aggiungere il risciacquo alle cellule nel tubo. Centrifugare il tubo a 500 ×g per cinque minuti, quindi aspirare il supernatante S senza disturbare il pellet cellulare. Risospendere delicatamente il pellet cellulare in sei millilitri di mezzo integrato.Aggiungere 0,5 millilitri della sospensione cellulare in ogni pozzetto della piastra per colture. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius, sostituendo il mezzo ogni giorno fino a quando le colture non diventano confluenti. Per preparare le soluzioni di colorante operative, diluire i due stock di RH 2 37 di uno a 1000 nella soluzione salina di Hank.Osservare le piastre di coltura a 12 pozzetti al microscopio per determinare se le cellule HL-60 sono confluenti. Di solito quattro giorni dopo la semina, quando le cellule sono confluenti, rimuovere delicatamente il coverslip dal pozzetto e risciacquarlo con soluzione salina di Hank. Posizionare il coverslip in una piastra di Petri da 35 millimetri contenente tre millilitri di soluzione working di road two.Posizionare la piastra di Petri in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius ed effettuare la bollitura con un flusso continuo di gas nella soluzione per l'ossigenazione. Incubare per 30 minuti per colorare le cellule con il colorante sensibile al calcio. Successivamente, trasferire il cover slip in tre millilitri di soluzione RH 2 37 ossigenata e incubare per 15 minuti.Lo strato cellulare monocellulare deve ora essere colorato con coloranti sensibili al calcio e al voltaggio. Per preparare le cellule all'acquisizione delle immagini, posizionare il vetrino con lo strato cellulare doppio colorato in una camera di circolazione su un microscopio a fluorescenza invertito. Regolare la velocità di flusso attraverso la camera per mantenere la temperatura a 35 gradi Celsius con un gradiente non superiore a 0,3 gradi Celsius lungo tutta la camera.Far scorrere la soluzione salina di Flo Hank sul monostrato cellulare per cinque minuti per rimuovere qualsiasi eccedenza di colorante. Dopo aver lavato il monostrato, posizionare un elettrodo bipolare nella soluzione il più vicino possibile al monostrato senza toccare le cellule. Verificare lo stato di salute del monostrato seguendo il protocollo descritto nel testo.Per stimolare il monocstrato, programmare l'elettrodo per somministrare impulsi di due millisecondi di durata per un massimo di 500 millisecondi per ciclo. Durante la stimolazione del monocstrato, acquisire le immagini delle cellule con un obiettivo da 40x ed eccitare il calcio e la tensione sensibili agli occhi.Utilizzando una sorgente luminosa a LED abbinata a un filtro di eccitazione e a uno specchio dicromatico, far passare la fluorescenza emessa attraverso lo specchio dicromatico per separare i segnali sensibili al calcio e alla tensione e raccogliere i segnali fluorescenti separatamente con due telecamere CCD. Acquisire immagini di quattro aree diverse del monolayer per ottenere una copertura completa e prestare attenzione a registrare il segnale per meno di due secondi per ogni campo. Per evitare il fotoblesamento.Un monolayer confluenziale di HL-1 mostra un ritmo regolare di contrazione quando stimolato dall'elettrodo. I segnali di tensione e di calcio sono stati registrati per un singolo battito elettricamente stimolato del monolayer di HL-1 in un ciclo di 500 millisecondi; l'inizio del segnale di tensione si verifica poco prima del transitorio di calcio. Mentre il segnale di calcio persiste più a lungo rispetto al segnale di tensione sulla superficie.Le mappe di intensità sono state generate a partire dai segnali fluorescenti di voltaggio e calcio attraverso il monolayer di cellule HL. Durante un intervallo di tempo di 200 millisecondi, il blu indica un segnale basso mentre il rosso indica un segnale alto. Entrambi i segnali hanno inizio a sinistra del monolayer e si propagano attraverso il monolayer verso destra.Nel tempo, i potenziali d'azione si propagano e ritornano alla linea di base molto più rapidamente rispetto al segnale del calcio Una volta. Questa procedura di mappatura può essere eseguita in un'ora se viene effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare cellule con densità ottimale e di prestare attenzione durante il posizionamento degli elettrodi di stimolazione per evitare di danneggiare il monolayer.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare una mappa ottica, HO monolayer di cellule atriali, utilizzando sia coloranti sensibili al calcio che coloranti sensibili al voltaggio.

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Tensione e Calcio mappatura ottica a doppio canale di Colta HL-1 atriale miociti monostrato

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