Una tecnica Tempo colorazione differenziale Accoppiato con Full bilaterale Gill Denervation per studiare Ionocytes in Pesci

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare la proliferazione di citi brachiali nelle branchie dei pesci rossi, privi di innervazione estrinseca. Ciò si ottiene mettendo prima il pesce in un bagno di colorante specifico per i mitocondri per colorare i mitocondri preesistenti, i ricchi citi brachiali. Il secondo passo consiste nell'eseguire la denervazione bilaterale completa delle branchie.

Successivamente, i pesci vengono soppressi. Le branchie vengono raccolte. I citi An sono marcati utilizzando un anticorpo contro il sodio potassio ai TPA.

Quindi il passaggio finale consiste nell'visualizzare e contare i citi preesistenti e quelli appena differenziati. In definitiva, questa volta viene utilizzata la tecnica di colorazione differenziale con denervazione bilaterale della gilda per mostrare la proliferazione e la distribuzione dei citi branchiali nei pesci rossi senza alcun input nervoso dal sistema nervoso centrale. Quindi il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per comprendere l'assorbimento dinamico degli ioni ed esaminare la ridistribuzione dei citi negli epiteli gastrointestinali dei pesci.

Innanzitutto, preparare una soluzione madre rossa millimolare mitrale dissolvendo 50 microgrammi in 94 microlitri di dimetilsolfossido e proteggere dalla luce. Quindi, prepara da tre a sei scatole scure con un volume massimo di 600 millilitri. Riempi ogni scatola con 400 millilitri di acqua del sistema e posiziona una pietra porosa in ciascuna per fornire una fonte di ossigeno.

Metti i pesci rossi del peso di 30-40 grammi nelle scatole. Dopo 30 minuti, aggiungere la soluzione Mitre tracker per ottenere una concentrazione completa di 0,1 colorante micromolare e 0,01% di DMSO. Bagnare il pesce per quattro ore.

Dopo quattro ore, apri il flusso d'acqua verso le scatole e lascia che il colorante fuoriesca. Se si tratta di animali di controllo, recuperare il pesce per tre-cinque giorni, quindi procedere all'immunoistochimica, altrimenti procedere alla procedura di denervazione bilaterale completa. Per prima cosa, anestetizzare il pesce mettendolo in un bagno d'acqua aerato con benzocaina.

Una volta cessata la respirazione, posizionare il pesce su un tavolo operatorio e inserire un tubo nella cavità buccale Per irrigare le branchie con una soluzione anestetica aerata, posizionare il pesce in modo che la testa sia leggermente inclinata verso il basso per consentire un migliore accesso all'area dietro il quarto arco branchiale. Sollevare delicatamente l'opercolom con una pinza dritta a modello standard, e quindi posizionare i divaricatori tissutali tra l'opercolo e l'interno della testa. Aprire con cautela i divaricatori tissutali per tenere l'opercoloma lontano dalla testa e mantenere le branchie esposte.

Appoggiare le maniglie del divaricatore accanto alla testa per consentire l'accesso a tutti e quattro gli archi branchiali. Controlla che la soluzione anestetica irriga le branchie e posiziona una pinza curva o diritta tra il quarto arco branchiale e la parte posteriore della testa. Apri delicatamente la pinza per creare tensione nel legamento.

Attaccando il quarto arco branchiale alla testa con un paio di pinze numero cinque. Crea un'apertura di due o tre millimetri perforando l'epitelio, collegando l'estremità dorsale degli archi branchiali alla cavità auricolare. Fai attenzione a non andare troppo in profondità perché c'è il rischio di danneggiare un vaso sanguigno importante.

Quindi, tieni un piccolo batuffolo di cotone con una pinza numero cinque e usalo per espandere con cura l'incisione per esporre il nono e il decimo nervo. Libera i nervi da qualsiasi tessuto connettivo usando la pinza numero cinque. Ancora una volta, facendo attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni.

Una volta che i nervi sono stati esposti e identificati, usa le forbici a molla curve per tagliare con cura i nervi tenendo l'incisione. Aprire con la pinza diritta di forma standard. Dopo aver reciso i nervi, ritrarre delicatamente la pinza curva e rimuovere il tessuto.

Non sono necessarie suture divaricatrici perché l'incisione dovrebbe chiudersi da sola entro 24-48 ore. Dopo aver ripetuto la procedura sull'altro lato della testa, passare dall'irrigazione delle branchie dall'anestetico all'acqua fresca aerata e lasciare che il pesce si riprenda dall'anestesia. Una volta ripresi i movimenti auricolari, spostare i pesci in vasche sperimentali per recuperarli per almeno 24 ore.

Infine, eseguire una procedura fittizia su un gruppo separato di pesci perforando l'epitelio dietro il quarto arco branchiale senza recidere i nervi prima di sopprimere il pesce. Mettere da tre a quattro millilitri di PFA al 4% in una fiala a scintillazione. Utilizzare una fiala per arco branchiale.

Inoltre, prendi una piccola barchetta di siero di latte e riempila con un XPBS. Questo verrà utilizzato per lavare il fazzoletto dopo che è stato asportato. Mantieni tutte le soluzioni in ghiaccio.

Dopo aver soppresso il pesce con un'overdose di benzocaina, usa una pinza smussata per sollevare la permanente su un lato della testa e delle forbici curve per recidere ciascuna estremità del cestello branchiale brachiale. Quindi, usa una pinza smussata per raccogliere con cura la branchia dai Rackers e sollevarla dalla cavità auricolare. Lavare immediatamente la branchia in un XPBS ghiacciato per rimuovere il benzene e il sangue in eccesso e posizionare la branchia asportata in una fiala riempita con il 4% di PFA per fissare tutte le branchie asportate durante la notte a quattro gradi Celsius dopo la fissazione.

Risciacquare X-S-P-F-A in un XPBS e posizionare il fazzoletto in un tubo di proiettile da due millilitri riempito con 1,5 millilitri di Tritton x all'1%. Posizionare i tubi di proiettile su uno shaker per sei ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Per permeare il tessuto, preparare una diluizione da uno a 250 di ciascun anticorpo primario aggiungendo quattro microlitri di entrambi gli anticorpi primari NKA e ZN 12 in 992 microlitri di un XPBS.

Assicurarsi che entrambi gli anticorpi primari siano stati sollevati nello stesso ospite. Aspirare la soluzione di Triton X e senza lavare prima il fazzoletto e la soluzione di anticorpi primari e incubare su uno shaker per sei ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di anticorpi primari e lavare l'anticorpo primario tre volte per tre minuti ciascuna.

Utilizzando un XPBS. Preparare l'anticorpo secondario a una diluizione da uno a 200 mescolando cinque microlitri di anticorpo secondario stock in 995 microlitri di un XPBS. Dopo aver aspirato il PBS dall'ultimo lavaggio, applicare l'anticorpo secondario e incubare per sei ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius su uno shaker.

Infine, rimuovere l'eccesso di anticorpi secondari lavando il tessuto tre volte per cinque minuti ciascuna come prima, dopo i lavaggi montare il tessuto posizionando prima una branchia in una goccia da 200 microlitri di un XPBS su un vetrino da microscopio piatto. Per garantire che il tessuto non si secchi. Separare le branchie hemi Brinks con micro forbici curve.

Quindi posizionare una goccia di un XPBS e una goccia di supporto di montaggio nella depressione di una slitta concava. Posizionare gli hemi brank separati nel vetrino concavo con il bordo anteriore del filamento rivolto verso l'alto e coprire con un vetrino coprioggetti tamponare i bordi del vetrino coprioggetti con smalto per unghie. Per evitare che il vetrino coprioggetto si muova e sposti il tessuto, lasciare che il tessuto si depositi sul fondo del vetrino concavo per 10-15 minuti prima dell'imaging.

Per ogni arco branchiale, selezionare sei filamenti branchiali a caso per l'imaging producendo sei immagini per arco branchiale. Utilizzare la microscopia confocale convenzionale per visualizzare il tessuto prelevando fette ottiche da uno a tre micrometri. Nelle immagini seguenti, i citi indicati dalle punte delle frecce sono stati colorati con l'anticorpo alfa cinque e i nervi indicati dalle frecce sono stati colorati con l'anticorpo ZN 12. Questa immagine confocale di un filamento branchiale di un pesce di controllo mostra un'innervazione estrinseca con un'estesa ramificazione lamellare di un fascio nervoso centrale, presumibilmente originata dal nono e dal decimo nervo, come si vede nell'immagine nel riquadro.

Alcuni dei citi indicati sono anche innervati. Questa immagine mostra un filamento branchiale due giorni dopo la completa denervazione bilaterale. C'è stata una riduzione del fascio nervoso centrale mentre l'innervazione laminare appariva in gran parte intatta.

Qui, un filamento branchiale mostrato cinque giorni dopo la completa denervazione bilaterale dimostra che l'innervazione estrinseca è ora in gran parte assente. L'analisi qualitativa suggerisce che la denervazione bilaterale completa provoca la degradazione dell'innervazione branchiale estrinseca, mantenendo i nervi con i corpi cellulari all'interno del filamento branchiale, creando una rete di nervi attraverso il filamento e nella zoppia. Questa procedura può essere abbinata ad altri metodi, come la misurazione dei flussi ionici, utilizzando ioni radioattivi come il sodio 22 per rispondere a ulteriori domande di ricerca.