Name: Isotermico di amplificazione (lampada) Assays Loop-mediata per rilevamento delle specie-specifica Eimeria Che infettano Polli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Impara a diagnosticare le infezioni da Eimeria nei polli con l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP). Questo metodo rapido ed economico offre risultati visivi chiari in circa 45 minuti, migliorando la gestione sanitaria del pollame.

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Il lavoro svolto in questo studio è stato sostenuto in parte dal Royal Veterinary College attraverso il fondo per i progetti di ricerca studenteschi, nonché dal Consiglio di ricerca per le biotecnologie e le scienze biologiche e dal Dipartimento per lo sviluppo internazionale (numero di sovvenzione BB/H009337/2). A questo manoscritto è stato assegnato il PPB_00795 di riferimento dalla RVC.

1. Modello Preparazione NOTA: Ogni modello di DNA genomico sospettato di contenere DNA derivato da una delle sette specie Eimeria che infettano i polli può essere utilizzato come modello per base LAMP-Eimeria identificazione della specie. Campioni di tessuto intestinale per l&#39;analisi diagnostica di campo devono essere raccolti durante la routine di post-mortem come descritto qui. <ol><li> Scegliere la sezione (o sezioni) dell&#39;intestino da testare. Vedi Tabella 1 per una guida per la selezione dei siti di campionamento e le Eimeria più probabilità di essere presenti 18 e la Figura 1 per la gamma di distribuzione e localizzazione dei siti di campionamento specie-specifico. NOTA: Questo è di fondamentale importanza in quanto Eimeria sono notevolmente sito host specifico. Ogni specie che infetta i polli è definito dalla Regione intestinale che esso si rivolge 19. La decisione può essere influenzata da una precedente esperienza della fattoria, l&#39;interesse per uno o more specifici Eimeria o altri indicatori diagnostici 6. </li><li> Accise 5 cm o lunghezze della sezione intestinale (s) selezionati per testare Eimeria usando forbici sterili o un bisturi. Facoltativamente, conservare i campioni per analisi successive in un fissativo come ad esempio in RNAlater 18 o 95% di etanolo. NOTA: Se la memorizzazione in etanolo, il campione deve essere lavata accuratamente in acido tris-etilendiamminotetraacetico sterile (TE) tampone prima dell&#39;uso. </li><li> Tagliare il campione aperto longitudinalmente, rimuovere contenuti più intestinale (se presente) e raschiare le cellule dallo strato mucoso libero utilizzando il bordo di una sterile microscopio vetrino o una lama forbice etanolo / fiamma sterilizzato. Facoltativamente un campione riunito includere cellule da tutti e quattro i siti intestinali specie-specifici in un singolo tubo. </li><li> Mettete il materiale raschiato in una sterile da 1,5 ml con tappo a vite provetta contenente 100 microlitri di buffer TE sterile di cui 10% (w / v) Chelex 100 resina. </li><li> Agitare ogni campione vigorosamente per 1 min. Assicurarsi che il tappo a vite sia ben chiuso e poi incubare in un bagno di acqua bollente per 10 minuti. </li><li> Dopo ebollizione permettono ciascun campione raffreddare a temperatura ambiente per 1-2 min. </li><li> Centrifugare ogni campione utilizzando una microcentrifuga a velocità superiore (ad esempio, ~ 10.000 xg) per 1 min. </li><li> Raccogliere 2 ml di surnatante risultante di essere modello di ogni saggio LAMP da intraprendere. Facoltativamente, piscina più siti intestinale in un unico tubo di fornire un saggio multi-site. </li></ol> 2. Eimeria LAMP Primer Preparazione (Pre-test) <ol><li> Preparare Eimeria LAMP scorte di primer adeguati per 100 test: <ol><li> Ricostituire ogni liofilizzata Eimeria LAMP fondo con l&#39;aggiunta di acqua di grado molecolare ad una concentrazione di 100 micron (come specificato dal costruttore). Se non è specificato, calcolare il volume di grado molecolare acqua necessaria using i pesi molecolari e fisici di ciascun primer. </li><li> Dispensare 60 ml di acqua grado molecolare in una provetta da 0,5 ml flip-top separato per ciascuna specie Eimeria da dosare. </li><li> Aggiungere primer FIP, BIP, F3, B3, LF e LB specifico per il bersaglio Eimeria specie a dell&#39;acqua usando i volumi indicati nella Tabella 2, creando una serie di sette specie-specifiche miscele di primer. </li><li> Brevemente vortice mescolare la soluzione di primer, poi impulso microcentrifuga e congelare fino al momento. </li></ol></li><li> Preparare una Mastermix reazione LAMP per ogni specie Eimeria per essere analizzati. Moltiplicare i volumi indicati nella Tabella 3 per il numero di campioni e aggiungere tre per un controllo positivo, controllo negativo e pipettaggio ricambio. Pipettare in un 0,5 o 1,5 ml flip-top provetta. </li></ol> 3. Eimeria LAMP Assay <ol><li> DNA polimerasi Bst / LAMP Pipettare 23 ml Eimeria specifiche delle specie Mastermix in 0.5 ml provetta. </li><li> Aggiungere template DNA 2 microlitri (preparata al punto 1), per un volume finale di reazione di 25 microlitri. </li><li> Aggiungere 2 ml Eimeria specie-specifiche DNA genomico ad una reazione (controllo positivo). Aggiungere acqua grado molecolare 2 microlitri di reazione (controllo negativo). NOTA: Se specie-specifico DNA genomico non è disponibile una precedente LAMP positivo o prodotto PCR standard possono essere utilizzati al posto. </li><li> Incubare a bagnomaria o un blocco di calore a 62 ° C per 30 min. Facoltativamente, de-attivare la DNA polimerasi Bst mediante riscaldamento a 80 ° C per 10 min se la reazione non sta per essere letto immediatamente. </li></ol> 4. LAMP Assay Read-out <ol><li> Al termine dell&#39;incubazione valutare il colore di ogni reazione occhio sotto luce interna. I risultati negativi sembrano rosa al viola di colore, risultati positivi appaiono cielo blu 20. </li><li> Facoltativamente, confermare il risultato del test LAMP in un laboratory mescolando 5 ml prodotto di reazione LAMP con 1 ml tampone di gel DNA carico per elettroforesi su gel di agarosio utilizzando un gel di agarosio 2% in 1 x Tris / borato / EDTA (TBE) buffer pre-macchiati con una macchia di acido nucleico (5 ml per 50 ml di agarosio). Aggiungere 5 ml di una scala 1Kb dimensione DNA molecolare alla corsia 1 del gel per consentire il calcolo dimensione del frammento. </li></ol>

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<li>Raj, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR-based+quantification+of+Eimeria+genomes%3A+a+method+to+outweigh+underestimation+of+genome+numbers+due+to+PCR+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Pathol%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR-based quantification of Eimeria genomes: a method to outweigh underestimation of genome numbers due to PCR inhibition.</a> Avian Pathol. 42 (4), 304-308 (2013).</li>
<li>Blake, D. P., Hesketh, P., Archer, A., Shirley, M. W., Smith, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eimeria+maxima%3A+the+influence+of+host+genotype+on+parasite+reproduction+as+revealed+by+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Eimeria maxima: the influence of host genotype on parasite reproduction as revealed by quantitative real-time PCR.</a> Int J Parasitol. 36 (1), 97-105 (2006).</li>
<li>Beck, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+approaches+to+diversity+of+populations+of+apicomplexan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Molecular approaches to diversity of populations of apicomplexan parasites.</a> Int J Parasitol. 39 (2), 175-189 (2009).</li>
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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

I saggi LAMP specie-specifici di Eimeria descritti in questo articolo offrono un nuovo kit di strumenti diagnostici a supporto di un controllo efficace dei coccidi e della malattia coccidiosi. Gli esiti dell'infezione da eimerian possono includere gravi perdite economiche, nonché una grave compromissione del benessere degli uccelli e una maggiore suscettibilità alla colonizzazione da parte di patogeni zoonotici21. Le opportunità di monitorare gli allevamenti per la presenza di alcune o tutte le specie di Eimeria possono fornire un allarme precoce di un guasto nell'efficacia del controllo anticoccidiale. I principali vantaggi di LAMP includono una robusta specificità del bersaglio, derivante dalla necessità di sei diversi bersagli di sequenza di DNA, nonché un'elevata sensibilità, potenziata dall'inclusione di primer ad ansa13, sebbene la natura qualitativa, non quantitativa, di LAMP possa essere considerata una limitazione. Attualmente non è possibile discriminare la fuga di parassiti a basso livello dalla chemioprofilassi di routine o la replicazione del vaccino vivo dalla replicazione eimeriana incontrollata. Ciononostante, la facilità tecnica del protocollo e della lettura definitiva offre un notevole miglioramento rispetto agli approcci specialistici esistenti e spesso soggettivi guidati dalla patologia e dalla morfologia6,7. Ogni test può essere completato al costo di ~£ 0,75 per campione, indipendentemente dalle spese di manodopera e installazione dell'attrezzatura. Pertanto, i saggi LAMP sono anche più convenienti rispetto ad altri diagnostici molecolari come la PCR, poiché richiedono un'incubazione isotermica senza bisogno di attrezzature specialistiche. 
Per molti anni l'accesso al DNA genomico di Eimeria come modello ha limitato lo sviluppo e l'applicazione della diagnostica molecolare sul campo. L'oocisti è la fase più facilmente accessibile del ciclo di vita eimeriano, ma l'estrazione di routine del DNA richiede strutture di laboratorio22. Altre fasi del ciclo di vita intestinale più labili richiedono la purificazione prima della preparazione del DNA per prevenire l'inibizione della PCR e la conseguente perdita di sensibilità23,24. La capacità di estrarre DNA eimeriano di qualità adatta per la LAMP utilizzando apparecchiature non più specializzate di una microcentrifuga e di un bagno d'acqua, integrate dall'adsorbimento di inibitori con resina chelex, promuove ora un uso più ampio della biologia molecolare nella diagnostica eimeriana. Curiosamente, il rilevamento di DNA di Eimeria misurabile con PCR quantitativa nel tessuto intestinale 20 giorni dopo l'inizio dell'infezione parassitaria, 11 giorni dopo l'ultima uscita di oocisti rilevabile, solleva l'ipotesi che la LAMP possa essere utilizzata per rilevare l'esposizione risolta al parassita e l'infezione in corso, anche dopo che eventuali lesioni visibili potrebbero essere state risolte25. 
Il costo relativamente basso e i bassi requisiti tecnici della diagnostica LAMP Eimeria possono promuovere la loro applicazione nei paesi in via di sviluppo, dove altri approcci più consolidati potrebbero non essere disponibili o appropriati. Affinché ciò sia applicabile, ogni test deve essere in grado di rilevare tutti i ceppi che possono circolare all'interno di ciascuna regione. Sebbene la comprensione della diversità genetica prevalente tra le specie di Eimeria sia limitata26, l'uso di sequenze target precedentemente convalidate per l'uso nella PCR quantitativa con ceppi provenienti da Africa, Asia, Europa e Sud America fornisce alcune prove di conservazione, a sostegno dell'utilità di questi saggi LAMP in tutto il mondo10.

La produzione globale di pollo è aumentato di dieci volte nel corso degli ultimi 50 anni con il mondo in via di sviluppo che ospita quasi quattro volte l&#39;espansione testimoniata nel mondo sviluppato <a href="http://www.faostat.org">(www.faostat.org)</a> . Come la rilevanza della produzione di pollo per la sicurezza alimentare mondiale è cresciuta così ha anche il profilo di agenti patogeni che possono causare malattie gravi nei polli. Un primo esempio sono le Eimeria, protozoi parassiti onnipresenti che possono causare la malattia enterica coccidiosi 1. Ovunque i polli sono allevati uno o più Eimeria è probabilmente comune 2-4. Nel mondo sviluppato Eimeria sono controllate principalmente da chemioprofilassi, utilizzando programmi di trasporto o di rotazione per ridurre al minimo l&#39;impatto della resistenza 5. I vaccini vivi sono utilizzati anche in sistemi in cui il valore Bird è sufficiente a giustificare il costo (ad esempio, riproduttori, strati e alcuni polli da carne 5). Come Result di queste misure coccidiosi clinica è spesso ben controllato, anche se l&#39;infezione subclinica è comune 5. Nel vaccinazione mondo in via di sviluppo è rara e l&#39;applicazione di droga spesso meno bene informato. Di conseguenza coccidiosis sub-clinica e clinica è più comune ed esercita un impatto economico significativo 3. La diagnosi di infezione eimerian ha sempre utilizzato lesione segnando post mortem, anche se il sistema di punteggio più usato anche gli autori hanno commentato che per alcune specie &quot;sembra dubbio che tale procedura dovrebbe essere tentata in qualsiasi ma moderatamente gravi infezioni&quot; 6. Prove supplementari possono essere raccolte attraverso il rilevamento microscopico dello stadio di oocisti lifecycle resistente ambientale in campioni di feci o del disordine, anche se la sovrapposizione morfologia può confondere tutti, ma l&#39;esperto 6,7. Alternative molecolari con reazione a catena della polimerasi (PCR), amplificatio casualen di PCR DNA polimorfico (RAPD-PCR) e tecnologie di PCR quantitativa sono stati disponibili per un massimo di 20 anni 8-10, ma fino ad oggi non sono riusciti a diventare popolare. Spesa relativa e la necessità di apparecchiature di laboratorio specializzato o di trasformazione hanno limitato la loro adozione, nonostante la natura spesso soggettiva e tecnicamente impegnativo del pathology- vecchio e basato microscopia avvicina 10,11. Tali limiti possono essere esagerati in molte delle regioni più povere del mondo, come il Sud-est asiatico, dove l&#39;impatto della coccidiosi sulla povertà può essere proporzionalmente maggiore 12. In risposta vi è una chiara domanda di nuove semplice e sensibile, ma redditizio, Eimeria specie-specifici saggi diagnostici. Loop-mediata amplificazione isotermica (LAMP) è un facile da preparare DNA polimerasi tecnica-driven che è in grado di amplificare grandi quantità di DNA. Ancora più importante, LAMP utilizza un polymera DNA Bstse invece della DNA polimerasi Taq comunemente usato in PCR, che facilita l&#39;amplificazione del DNA in una singola temperatura costante, senza la necessità di cicli termici 13,14. LAMP può essere suscettibile di applicazione anche in laboratorio più rudimentale o nel campo. Caratterizzato da resistenza rispetto a molti inibitori della PCR, elevata sensibilità e specificità, saggi LAMP sono stati sviluppati per una vasta gamma di agenti patogeni, tra cui virus della malattia infettiva della borsa, Clostridium perfringens e Cryptosporidium 15-17. In risposta alla domanda di nuovi strumenti diagnostici di costo-efficacia Eimeria specie specifiche di un gruppo di saggi LAMP specifiche per ciascuno dei sette Eimeria che infettano i polli è stato sviluppato 18. Le domande per i nuovi test comprendono il monitoraggio dei parassiti occorrenza, di particolare valore dato l&#39;associazione di specie come Eimeria maxima o Eimeria necatrix con scarsa pe economicarformance 3,4. Altre applicazioni includono valutare l&#39;efficacia della strategia anticoccidial di una fattoria, diagnosi di infezione subclinica o malattia clinica e valutazione del rischio rappresentato da Eimeria ad una fattoria.

<table><tbody><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td>AM7024</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.321</td><td>Attenzione, altamente infiammabile</td></tr><tr><td>100 x Tris-EDTA (TE) concentrato tampone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 resina</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1253</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado molecolare</td><td>Invitrogen</td><td>10977035</td><td></td></tr><tr><td>E. acervulina F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCTAACATTTCGCTTCACGGAC</td></tr><tr><td>E. acervulina B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*ATGAGCAAGTGGAACACCTTG</td></tr><tr><td>E. acervulina FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*AGAGCACAGTGGCAGTGC-AGCAGACAGCATGGCTTACCT</td></tr><tr><td>E. acervulina BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAAGACCCTCTGAAGAACGGA-CCTTCTCACCGCTTACCGG</td></tr><tr><td>E. acervulina LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TAAGGTTACACCCGTGGAGG</td></tr><tr><td>E. acervulina LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCCATGCACAAAGCGACTT</td></tr><tr><td>E. brunetti F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GGCCATCAAGTTCCATGAGC</td></tr><tr><td>E. brunetti B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TCAACCTCCTGAGTGTGGTT</td></tr><tr><td>E. brunetti FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>* GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGTACGGAGCGTCTT</td></tr><tr><td>E. brunetti BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TACTTCCTAGGATCCATCCTCGC-AGTTTCGCTGCCGCCTC</td></tr><tr><td>E. brunetti LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAAACGCTCGAACATGGC</td></tr><tr><td>E. brunetti LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CTTCTCCACAGACCCAGAGGT</td></tr><tr><td>E. maxima F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>* ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT</td></tr><tr><td>E. maxima B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCTTCCTCCCTTTTTTGAAAACTG</td></tr><tr><td>E. maxima FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAGTCACTGCTGATGTACCAAA AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG</td></tr><tr><td>E. maxima BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*AGAATGCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGTCCAAGGTGTGTGTA</td></tr><tr><td>E. maxima LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>* CAAGCCTACGCGGACATC</td></tr><tr><td>E. maxima LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TTATGCAGCTGGGTCAACG</td></tr><tr><td>E. mitis F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*ACGATAGCCAAGACACGTAAGG</td></tr><tr><td>E. mitis B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA</td></tr><tr><td>E. mitis FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT</td></tr><tr><td>E. mitis BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG</td></tr><tr><td>E. mitis LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TCCATGCATCCCCTTGTT</td></tr><tr><td>E. mitis LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGTGGGCACAGATTGATTC</td></tr><tr><td>E. necatrix F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TGGCTTTCCCGCGTACC</td></tr><tr><td>E. necatrix B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGGCCCAACACAAAGACTG</td></tr><tr><td>E. necatrix FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCA CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA</td></tr><tr><td>E. necatrix BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCCATGCCATTCAATGAACG-*GAGGCATACCGGCGTTGTC</td></tr><tr><td>E. necatrix LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTCTGTAACTTGGGACGTTGT</td></tr><tr><td>E. necatrix LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAACAGCCGGAGCCTCTC</td></tr><tr><td>E. praecox F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCCCTTGTATGTTGCTGTTTCT</td></tr><tr><td>E. praecox B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCGCACGAATCTGAATCACAC</td></tr><tr><td>E. praecox FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*ATCTCCTCAAAGACTTTCGCGT A-GCGCTTGGCTATATCCATAGG</td></tr><tr><td>E. praecox BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT</td></tr><tr><td>E. praecox LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAATAGCATTGCCAGGTGG</td></tr><tr><td>E. praecox LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTCCACTGTCATTAATATTGC TGC</td></tr><tr><td>E. tenella F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCTTGTGAAGGTCAGCGTG</td></tr><tr><td>E. tenella B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>* GCTGAGTCCATACGTACTTCCT</td></tr><tr><td>E. tenella FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCCACTGCTATGGAAAGTCAC AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT</td></tr><tr><td>E. tenella BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT</td></tr><tr><td>E. tenella LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCATGTGCAGTTGAAGACA</td></tr><tr><td>E. tenella LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCAAATGTATCTGCTAGTTATA TTAACAAG</td></tr><tr><td>10 x tampone di reazione ThermoPol</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1330</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di betaina (5 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td></td></tr><tr><td>Bst polimerasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275S</td><td></td></tr><tr><td>Blu idrossinaptolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33936</td><td>Disciolto in acqua di grado molecolare.</td></tr><tr><td>Agarosio ultrapuro</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>10 tampone Tris/Borato/EDTA (TBE)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>Colorante di caricamento del DNA blu/arancione (x6)</td><td>Promega</td><td>G1881</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1Kb Scala del DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>SafeView colorazione per acido nucleico</td><td>NBS Biologicals</td><td>NBS-SV</td><td></td></tr></tbody></table>

isotermico di amplificazione (lampada) assays loop-mediata per rilevamento delle specie-specifica<em&gt; eimeria</em&gt; che infettano polli

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

I parassiti della specie Eimeria, protozoi che causano la malattia enterica coccidiosi, rappresentano una seria minaccia per la produzione e il benessere dei polli. In assenza di un controllo efficace, la coccidiosi clinica può essere devastante. La resistenza ai chemioprofilattici frequentemente utilizzati per controllare l'Eimeria è comune e l'infezione subclinica è diffusa, influenzando i rapporti di conversione alimentare e la suscettibilità ad altri agenti patogeni come il Clostridium perfringens. Nonostante la disponibilità di strumenti basati sulla reazione a catena della polimerasi (PCR), la diagnosi dell'infezione da Eimeria si basa ancora quasi interamente su approcci tradizionali come il punteggio delle lesioni e la morfologia delle oocisti, ma nessuno dei due è semplice. I limiti degli strumenti molecolari esistenti includono la necessità di attrezzature specializzate e le difficoltà di accesso al DNA come modello. In risposta, sono stati sviluppati un semplice protocollo di preparazione del DNA sul campo e un pannello di saggi di amplificazione isotermica mediata da loop specie-specifici (LAMP) per le sette Eimeria note per infettare il pollo. Ora forniamo un protocollo dettagliato che descrive la preparazione del DNA genomico dal tessuto intestinale raccolto post-mortem, seguito dall'impostazione e dalla lettura dei saggi LAMP. La LAMP specie-specifica di Eimeria può essere utilizzata per monitorare la presenza di parassiti, valutare l'efficacia della strategia anticoccidiale di un allevamento e per diagnosticare infezioni subcliniche o malattie cliniche di particolare valore quando non è disponibile una sorveglianza esperta.

Convalida Assay Durante la convalida ogni Eimeria specie-specifico test LAMP è stata testata utilizzando un pannello di campioni puri di DNA che rappresentano tutte le sette specie Eimeria che infettano il pollo, così come il pollo DNA genomico come controllo host. Elettroforesi su gel di agarosio è stato utilizzato per risolvere ogni test e ha dimostrato la specificità specie assoluto senza padrone cross-reattività 18. Poi, una volte dieci serie di diluizione in serie preparata utilizzando purificato tenella Eimeria genomico del DNA ha rivelato un limite di sensibilità del test tra uno e dieci copie del genoma del 18. Nessun limite massimo è stato determinato con risultati positivi ottenuti fino ad includere la più alta concentrazione (100.000 copie di genoma) 18. Applicazione con campioni di campo I campioni raccolti per il test Eimeria sono suscettibili di essere derivati ​​da polli trovati morti, abbattuti come conseguenza di poor salute o abbattuti per la sorveglianza sanitaria sentinella, che indica un campione probabilmente tra uno e tre anni quando parte di una routine. Test tre uccelli raccolti da un allevamento di polli da carne degli Stati Uniti come parte di un programma di sorveglianza ha prodotto tre serie di campioni intestinali. Applicazione delle specie-specifiche analisi LAMP mirato, privilegiando i siti intestinali preferiti per ciascuna specie Eimeria (Tabella 1), ha permesso l&#39;identificazione visiva di infezione eimerian in tutti gli uccelli testato con Blu di idrossinaftolo come indicatore (Figura 2A). Il colore ottenuto con una reazione negativa LAMP utilizzando Blu di idrossinaftolo può variare dal viola al rosa, ma è sempre distinto dal blu raggiunti da un risultato positivo. Conferma mediante elettroforesi su gel di agarosio fornito risultati comparabili (Figura 2B). Durante l&#39;applicazione campo l&#39;utente può scegliere di applicare l&#39;intero schermo contro tutte le sette specie, o indirizzare solo quelle specie prioritarie comeimportante o conosciuto da circolando in azienda o la zona circostante. Il fallimento degli approcci basati sulla PCR per affermata come la diagnostica per il verificarsi di Eimeria sottolinea l&#39;esigenza di semplicità in qualsiasi nuovo test. Mentre la lampada offre la preparazione semplice e di trasformazione di PCR, l&#39;obbligo di testare più siti intestinali per volatile rimane scoraggiante. Produzione di un singolo campione di DNA pool per uccello, che possono poi essere sottoposta a uno o più saggi LAMP, è probabile che sia più attraente. Elaborando un campione riunito per uccello, rappresentando materiale raccolto da ciascuno dei siti intestinali specifici descritti nella Tabella 1 e aggregati prima della preparazione del DNA, per le prove con tutti e sette saggi LAMP disponibile lo stesso risultato di quando ogni sito intestinale è stata trattata separatamente (Figura 2 rispetto alla figura 3). <img alt="Figura 1" src=&quot;/files/ftp_upload/52552/52552fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. intestinali punti di campionamento per la rilevazione LAMP di Eimeria parassiti specie che infettano i polli. Le regioni intestinali interessati dal ciascuna specie Eimeria è evidenziato dalle linee colorate, con i siti preferiti di campionamento indicato dal numero tra le linee nere tratteggiate (E. acervulina: giallo / 1, E. Brunetti: rosa / 2, E. maxima: blu / 3, E. mitis: arancio / 4, E. necatrix: rosso / 5, E. praecox: verde / 6 e E. tenella: grigio / 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52552/52552fig2.jpg" /> Figura 2. La diagnosi di infezione LAMP eimerian from tre polli commerciali. Le reazioni LAMP risolte utilizzando (A) Blu di idrossinaftolo, dove un cielo blu reazione è stata positiva e una viola di reazione rosa è stata negativa, e elettroforesi su gel (B) agarosio. I siti intestinali campione sono state come indicato nella Tabella 1 per ogni specie di parassiti. A = E. acervulina, B = E. Brunetti, Ma = E. maxima, Mi = E. mitis, N = E. necatrix, P = E. praecox e T = E. tenella. Corsia 1 conteneva la scala GeneRuler 1Kb DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52552/52552fig3.jpg" /> Figura 3. La diagnosi di infezione eimerian LAMP utilizzando campioni provenienti da tre polli commerciali separate. REAC LAMPle risolto utilizzando blu hydroxynaphthol, dove un cielo blu reazione è stata positiva e viola alla reazione rosa è stata negativa. A = E. acervulina, B = E. Brunetti, Ma = E. maxima, Mi = E. mitis, N = E. necatrix, P = E. praecox e T = E. tenella. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Sito di esempio </td><td> Eimeria test specie (più probabile) </td></tr><tr><td> Duodeno (D) </td><td> E. acervulina, E. praecox </td></tr><tr><td> Digiuno / ileo * (J / I) </td><td> E. maxima, E. necatrix </td></tr><tr><td> Caeca (C) </td><td> E. necatrix, E. tenella </td></tr><tr><td> Ileo terminale (TI) </td><td> E. Brunetti, E. mitis </td></tr&gt; <tr><td> Campione aggregato (P) </td><td> E. acervulina, E. Brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox, E. tenella </td></tr></tbody></table> Tabella 1. intestinale selezione specifica regione di candidato Eimeria saggi specie. La scelta della regione da campionare varia per ogni specie Eimeria come illustrato in Figura 1. Campioni aggregati includono materiale raccolto da tutti i quattro siti specifici che sono stati poi combinati per la preparazione del DNA. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Primer * </td><td> Concentrazione della (micron) </td><td> Volume (ml) </td></tr><tr><td> Acqua </td><td> - </td><td> 60 </td></tr><tr><td> Forward interno Primer (FIP) </td><td> 100 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Indietro interno Primer (BIP) </td><td> 100 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Forward Outer Primer (F3) </td><td> 100 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Backward Outer Primer (B3) </td><td> 100 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Loop Forward (LF) </td><td> 100 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Loop Backward (LB) </td><td> 100 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Totale </td><td></td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Preparazione di un premiscelato LAMP primer. I componenti e le proporzioni necessari per preparare un premiscelato primer per LAMP. I volumi indicati sono per 100 reazioni LAMP. * Identità Primer come mostrato nei Materiali e Barkway et al (2011) 18. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Archivio conc n </td><td> Reazione finale conc n </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> DDW </td><td> - </td><td> - </td><td> 10.1 </td></tr><tr><td> Buffer THERMOPOL </td><td> 10 x </td><td> 1 x </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 100 MM </td><td> 2 mm </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> Mix Primer * </td><td colspan="2"> Tabella 2 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> dNTP </td><td> 25 MM </td><td> 400 uM </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Betaina </td><td> 5 M </td><td> 1 M </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Blu di idrossinaftolo </td><td> 3 mM </td><td> 120 micron </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DNA polimerasi Bst </td><td> 8.000 U / ml </td><td> 8 U </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Totale </td><td></td><td></td><td> 23 </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Preparazione di un LAMMastermix reazione P. * Eimeria specie-specifico.

La diagnosi di infezione da Eimeria nei polli rimane impegnativa. Gli approcci guidati dalla morfologia dei parassiti e dalla patologia dell'ospite sono comunemente inconcludenti, mentre gli approcci molecolari basati sulla PCR si sono dimostrati impegnativi in termini di costi e competenze. Lo scopo di questo protocollo è quello di stabilire l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) come diagnostica molecolare semplice per l'infezione di Eimerian.

Isotermico di amplificazione (lampada) Assays Loop-mediata per rilevamento delle specie-specifica<em&gt; Eimeria</em&gt; Che infettano Polli

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è diagnosticare la presenza di parassiti della specie I myea in un pollo o in un allevamento di polli. Ciò si ottiene preparando prima i reagenti per l'amplificazione isotermica mediata da loop o la reazione della lampada. Successivamente, il DNA genomico totale viene preparato da uno o più siti intestinali post mortem.Quindi il DNA genomico viene aggiunto alla miscela master della lampada e incubato. Infine, viene valutato l'esito del test della lampada. In definitiva, LAMP viene utilizzato per determinare la presenza di specifiche specie di Imiría per migliorare la gestione degli stock e come strumento per la diagnosi di malattie.Quindi il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi tradizionali come la microscopia morfologica o la PCR è che è meno soggettiva e non richiede costose strutture di laboratorio. L'uso di questo approccio può migliorare la salute e il benessere dei polli migliorando la diagnosi dell'infezione da Arian. Per preparare il modello per l'asise della lampada Erea, scegliere la sezione di intestino da testare.Utilizzare questa tabella come guida per la selezione del sito di campionamento e le specie di eria che hanno maggiori probabilità di essere presenti. Questo è di fondamentale importanza poiché ogni specie che infetta i polli è definita dalla regione intestinale che prende di mira utilizzando forbici sterili o un bisturi. Asciugare lunghezze di cinque centimetri o più delle sezioni intestinali selezionate per il test di eria.Tagliare il campione longitudinalmente. Rimuovere la maggior parte del contenuto intestinale e utilizzare il bordo di un microscopio di vetro sterile. Far scorrere o sterilizzare la lama delle forbici per raschiare le cellule dallo strato mucoso.Mettere il materiale raschiato in una provetta sterile da 1,5 millilitri per microcentrifuga contenente 100 microlitri di TE sterile con il 10% di resina in peso, ma in volume X 100 e avvitare saldamente la parte superiore. Agitare energicamente i campioni per un minuto, quindi incubare a bagnomaria bollente per 10 minuti. Dopo l'ebollizione, lasciare raffreddare ogni campione a temperatura ambiente per uno o due minuti.Centrifugare i campioni a 10.000 volte G per un minuto prima di raccogliere due microlitri di surnatante per saggio della lampada da utilizzare come modello per preparare le scorte di primer della lampada I miria adeguate per 100 saggi. Ricostituire ogni primer per lampada di I miria liofilizzato aggiungendo acqua di grado molecolare a una concentrazione di 100 pipette micromolari 60 microlitri di acqua di grado molecolare in una provetta per microcentrifuga flip top da 0,5 millilitri separata per ogni specie di iria da analizzare. Utilizzando il volume mostrato in questa tabella.Aggiungere all'acqua i primer, F-I-P-B-I-P-F, tre, B, tre, LF e LB specifici per le specie di eria target. Creazione di una serie di sette miscele di primer specifiche per specie. Capovolgere brevemente le soluzioni di primer per mescolarle, pulsare micro e congelare fino al momento del bisogno.Utilizzando i volumi elencati in questa tabella e le linee guida nel protocollo di testo, preparare una miscela master di reazione con lampada per ciascuna specie di iria da analizzare per eseguire la pipetta per test con lampada 23 microlitri di miscela master per lampada di polimerasi specifica per specie IEA B-S-G-D-N-A in una provetta per microcentrifuga da 0,5 millilitri. Aggiungere due microlitri di modello di DNA precedentemente preparato ottenendo un volume di reazione finale di 25 microlitri come controllo positivo. Aggiungi due microlitri di DNA genomico specifico per specie eria a una reazione.Aggiungere due microlitri di acqua di grado molecolare a una reazione come controllo negativo, incubando un bagno d'acqua o un blocco di calore a 62 gradi Celsius per 30 minuti. Opzionalmente disattivare la polimerasi B-S-T-D-N-A riscaldandola a 80 gradi Celsius per 10 minuti. Se la reazione non verrà letta immediatamente al termine dell'incubazione sotto la luce interna, valutare il colore di ciascuna reazione a occhio.I risultati negativi appariranno di colore dal rosa al viola e appariranno i risultati positivi. Cielo azzurro opzionalmente. Per confermare il risultato del saggio della lampada, mescolare cinque microlitri di prodotto di reazione della lampada con un microlitro di tampone di caricamento del gel di DNA ed eseguire l'analisi con un gel prestain 2%ARO.Utilizzare una scala di DNA di dimensioni molecolari a base killer per determinare il test della dimensione del frammento tre. Gli uccelli raccolti da un allevamento di polli da carne negli Stati Uniti come parte di un programma di sorveglianza hanno prodotto tre serie di campioni intestinali, come mostrato qui. Applicazione mirata dei saggi con lampada specie-specifici e priorità dei siti intestinali preferiti per ogni miria.La specie ha permesso l'identificazione visiva di un'infezione da irie in tutti gli uccelli testati utilizzando il blu idrossinatale come indicatore. Il colore ottenuto con una reazione negativa della lampada quando si utilizza l'idrossi può variare dal viola al rosa, ma è sempre distinto dal blu ottenuto da un risultato positivo. La conferma mediante elettroforesi su gel aose ha fornito risultati comparabili come mostrato qui.La preparazione del DNA da un campione prelevato per uccello che rappresenta il materiale raccolto da ciascuno dei siti intestinali specifici e testato con tutti e sette i saggi con lampada ha fornito lo stesso risultato di quando ciascun sito intestinale è stato elaborato separatamente Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 45 minuti se viene eseguita correttamente seguendo questa procedura. Altre tecniche come il punteggio delle lesioni possono essere eseguite anche per valutare la salute generale dell'intestino.

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L'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) è un test di amplificazione dell'acido nucleico isotermico (iNAAT) che ha attirato un ampio interesse nel campo del rilevamento degli agenti patogeni. Qui presentiamo un protocollo Salmonella LAMP convalidato in più laboratori come metodo rapido, affidabile e robusto per lo screening della Salmonella negli alimenti per animali e la conferma della Salmonella presuntiva dall'isolamento della coltura.

Amplificazione isotermica mediata ad anello per lo screening della Salmonella negli alimenti animali e conferma della Salmonella dall'isolamento della coltura

Abbiamo sviluppato un metodo per rilevare gli zoospori di Phytophthora capsici nelle fonti d'acqua utilizzando un metodo di estrazione del DNA della carta filtro accoppiato con un'amplificazione isotermica mediata a ciclo (LAMP) che può essere analizzata sul campo o in laboratorio.

Rilevamento di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando l'amplificazione isotermica mediata a ciclo

Vari agenti patogeni batterici possono causare infezioni del tratto respiratorio e portare a gravi problemi di salute se non rilevati con precisione e trattati tempestivamente. Il rilevamento rapido e accurato di questi patogeni tramite amplificazione isoterma mediata da loop fornisce una gestione e un controllo efficaci delle infezioni del tratto respiratorio in ambito clinico.

Rilevamento rapido di agenti patogeni batterici che causano infezioni del tratto respiratorio inferiore tramite amplificazione isotermica mediata da loop basata su chip microfluidico

Questo protocollo descrive un semplice nastro adesivo a base di approccio per il campionamento di pomodoro e di altre superfici di prodotti freschi, seguita da una rapida individuazione cellule intere...

Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ</emIbridazione> per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

Impara a diagnosticare le infezioni da Eimeria nei polli con l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP). Questo metodo rapido ed economico offre risultati visivi chiari in circa 45 minuti, migliorando la gestione sanitaria del pollame.

Isotermico di amplificazione (lampada) Assays Loop-mediata per rilevamento delle specie-specifica

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