Isotermico di amplificazione (lampada) Assays Loop-mediata per rilevamento delle specie-specifica

L'obiettivo generale di questa procedura è diagnosticare la presenza di parassiti della specie I myea in un pollo o in un allevamento di polli. Ciò si ottiene preparando prima i reagenti per l'amplificazione isotermica mediata da loop o la reazione della lampada. Successivamente, il DNA genomico totale viene preparato da uno o più siti intestinali post mortem.

Quindi il DNA genomico viene aggiunto alla miscela master della lampada e incubato. Infine, viene valutato l'esito del test della lampada. In definitiva, LAMP viene utilizzato per determinare la presenza di specifiche specie di Imiría per migliorare la gestione degli stock e come strumento per la diagnosi di malattie.

Quindi il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi tradizionali come la microscopia morfologica o la PCR è che è meno soggettiva e non richiede costose strutture di laboratorio. L'uso di questo approccio può migliorare la salute e il benessere dei polli migliorando la diagnosi dell'infezione da Arian. Per preparare il modello per l'asise della lampada Erea, scegliere la sezione di intestino da testare.

Utilizzare questa tabella come guida per la selezione del sito di campionamento e le specie di eria che hanno maggiori probabilità di essere presenti. Questo è di fondamentale importanza poiché ogni specie che infetta i polli è definita dalla regione intestinale che prende di mira utilizzando forbici sterili o un bisturi. Asciugare lunghezze di cinque centimetri o più delle sezioni intestinali selezionate per il test di eria.

Tagliare il campione longitudinalmente. Rimuovere la maggior parte del contenuto intestinale e utilizzare il bordo di un microscopio di vetro sterile. Far scorrere o sterilizzare la lama delle forbici per raschiare le cellule dallo strato mucoso.

Mettere il materiale raschiato in una provetta sterile da 1,5 millilitri per microcentrifuga contenente 100 microlitri di TE sterile con il 10% di resina in peso, ma in volume X 100 e avvitare saldamente la parte superiore. Agitare energicamente i campioni per un minuto, quindi incubare a bagnomaria bollente per 10 minuti. Dopo l'ebollizione, lasciare raffreddare ogni campione a temperatura ambiente per uno o due minuti.

Centrifugare i campioni a 10.000 volte G per un minuto prima di raccogliere due microlitri di surnatante per saggio della lampada da utilizzare come modello per preparare le scorte di primer della lampada I miria adeguate per 100 saggi. Ricostituire ogni primer per lampada di I miria liofilizzato aggiungendo acqua di grado molecolare a una concentrazione di 100 pipette micromolari 60 microlitri di acqua di grado molecolare in una provetta per microcentrifuga flip top da 0,5 millilitri separata per ogni specie di iria da analizzare. Utilizzando il volume mostrato in questa tabella.

Aggiungere all'acqua i primer, F-I-P-B-I-P-F, tre, B, tre, LF e LB specifici per le specie di eria target. Creazione di una serie di sette miscele di primer specifiche per specie. Capovolgere brevemente le soluzioni di primer per mescolarle, pulsare micro e congelare fino al momento del bisogno.

Utilizzando i volumi elencati in questa tabella e le linee guida nel protocollo di testo, preparare una miscela master di reazione con lampada per ciascuna specie di iria da analizzare per eseguire la pipetta per test con lampada 23 microlitri di miscela master per lampada di polimerasi specifica per specie IEA B-S-G-D-N-A in una provetta per microcentrifuga da 0,5 millilitri. Aggiungere due microlitri di modello di DNA precedentemente preparato ottenendo un volume di reazione finale di 25 microlitri come controllo positivo. Aggiungi due microlitri di DNA genomico specifico per specie eria a una reazione.

Aggiungere due microlitri di acqua di grado molecolare a una reazione come controllo negativo, incubando un bagno d'acqua o un blocco di calore a 62 gradi Celsius per 30 minuti. Opzionalmente disattivare la polimerasi B-S-T-D-N-A riscaldandola a 80 gradi Celsius per 10 minuti. Se la reazione non verrà letta immediatamente al termine dell'incubazione sotto la luce interna, valutare il colore di ciascuna reazione a occhio.

I risultati negativi appariranno di colore dal rosa al viola e appariranno i risultati positivi. Cielo azzurro opzionalmente. Per confermare il risultato del saggio della lampada, mescolare cinque microlitri di prodotto di reazione della lampada con un microlitro di tampone di caricamento del gel di DNA ed eseguire l'analisi con un gel prestain 2%ARO.

Utilizzare una scala di DNA di dimensioni molecolari a base killer per determinare il test della dimensione del frammento tre. Gli uccelli raccolti da un allevamento di polli da carne negli Stati Uniti come parte di un programma di sorveglianza hanno prodotto tre serie di campioni intestinali, come mostrato qui. Applicazione mirata dei saggi con lampada specie-specifici e priorità dei siti intestinali preferiti per ogni miria.

La specie ha permesso l'identificazione visiva di un'infezione da irie in tutti gli uccelli testati utilizzando il blu idrossinatale come indicatore. Il colore ottenuto con una reazione negativa della lampada quando si utilizza l'idrossi può variare dal viola al rosa, ma è sempre distinto dal blu ottenuto da un risultato positivo. La conferma mediante elettroforesi su gel aose ha fornito risultati comparabili come mostrato qui.

La preparazione del DNA da un campione prelevato per uccello che rappresenta il materiale raccolto da ciascuno dei siti intestinali specifici e testato con tutti e sette i saggi con lampada ha fornito lo stesso risultato di quando ciascun sito intestinale è stato elaborato separatamente Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 45 minuti se viene eseguita correttamente seguendo questa procedura. Altre tecniche come il punteggio delle lesioni possono essere eseguite anche per valutare la salute generale dell'intestino.