Oro nanorod-assistito stimolazione ottica di cellule neuronali

Questo protocollo delinea come utilizzare il riscaldamento transitorio associato all'assorbimento ottico delle nanobarre d'oro per stimolare la differenziazione e l'attività intracellulare del calcio nelle cellule neuronali. Questi risultati aprono potenzialmente nuove applicazioni nelle protesi neurali e negli studi fondamentali nelle neuroscienze.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stimolare le cellule neuronali coltivate con nano barre d'oro utilizzando un diodo laser nel vicino infrarosso. Ciò si ottiene preparando prima le nanoparticelle d'oro alla giusta densità ottica. Il secondo passo consiste nel coltivare le cellule neuronali e aggiungere le nanoparticelle ad esse.

Il passo successivo è l'irradiazione laser. Il passo finale consiste nel verificare la differenziazione cellulare attraverso l'espressione di beta tre e tubulina. In definitiva, la microscopia confocale viene utilizzata per mostrare la transitorietà intracellulare del calcio.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo cercando un modo per stimolare il potenziale d'azione in singoli neuroni all'interno di una popolazione cellulare. A dimostrare la procedura saranno Jamie May e gli studenti universitari del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, posizionare un veterinario di soluzione di nano barre d'oro nello spettrofotometro UV visibile.

Misurare la densità ottica iniziale registrando i valori di assorbimento da 300 nanometri a 1000 nanometri con una risoluzione compresa tra 0,5 e due nanometri. Preparare una soluzione madre da un millilitro diluendo il campione iniziale di oro anoro alla densità ottica di una centrifuga. Un millilitro della soluzione di nano barre d'oro due volte per rimuovere qualsiasi eccesso chimico.

Quindi rimuovere i surnatanti e risospendere le nano barre d'oro in acqua deionizzata. Per prepararsi all'uso in coltura cellulare, sonicare la soluzione di oro Anoro per cinque minuti, quindi sterilizzarla con luce UV per 30 minuti. In questa procedura, preparare 500 millilitri di dmem sterile per il terreno di coltura cellulare.

Successivamente, far crescere le cellule neuronali NG 1 0 8 15 in 10 millilitri di terreno di coltura cellulare in un pallone T 75, successivamente incubato a 37 gradi Celsius e atmosfera umidificata. Quando le celle sono confluenti al 70-80%, cambiare il terreno con un terreno fresco caldo. Successivamente, staccare meccanicamente le cellule battendo delicatamente il fondo del pallone confluente.

Centrifugare una sospensione cellulare per cinque minuti a 600 G e risospendere la tavolozza cellulare in due millilitri di terreno di differenziazione cellulare caldo. Quindi vedere le cellule in una piastra a 96 pozzetti con 200 microlitri di terreno di differenziazione cellulare. Incubare il campione per un giorno a 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, aggiungi la soluzione di nano bacchetta d'oro e incubala per altre 24 ore. In questa procedura, accoppiare il laser con una fibra ottica monomodale e terminarla con un connettore FC. Misura la potenza del laser in uscita con un misuratore di potenza standard il terzo giorno di incubazione delle nano barre.

Fissare il connettore FC al pozzetto, irradiare il campione e il controllo a temperatura ambiente per un minuto in un'onda continua a diverse potenze laser il quinto giorno, rimuovere il mezzo di differenziazione cellulare dal campione e fissarlo con una soluzione di formaldeide al 3,7% in volume per volume per 10 minuti. Quindi permeare le cellule con lo 0,1% di volume per volume Triton X 100 per 20 minuti. Successivamente, aggiungere il 3% in peso per volume di BSA al campione per 60 minuti.

Per bloccare i siti di legame non reattivi della proteina, etichettare il campione con tubulina anti beta tre durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, incubare le cellule per 90 minuti al buio con un anticorpo secondario appropriato. Successivamente etichettare i nuclei cellulari con DAP E per 10 minuti.

Quindi visualizzare il campione con epifluorescenza o microscopia confocale utilizzando un obiettivo almeno 20x. Scegliere i filtri del microscopio in base all'anticorpo secondario e selezionare un filtro DAPI per visualizzare i nuclei di una cellula. In questa fase, preparare una soluzione madre al 20% in peso per volume di onic F1 27 sciogliendo due grammi di soluto in 10 millilitri di DMSO.

Riscaldare la soluzione di onic F1 27 a 40 gradi Celsius per 20 minuti per aumentare la solubilità. Il terzo giorno di incubazione dell'anaro, preparare una soluzione salina bilanciata. Quindi, rimuovere il mezzo di differenziazione cellulare e sostituirlo con la soluzione BSS.

Integrato con cinque micromolari di influenza, 4:00 AM in DMSO e 0,1% in peso per volume di soluzione madre onic F1 27. Successivamente, accoppiare il laser con una fibra ottica monomodale e tagliare la punta. Utilizzando la tecnica standard.

Osservare la punta risultante al microscopio ottico per assicurarsi che la punta sia piatta e perpendicolare all'asse della fibra. Quindi misurare la potenza del laser in uscita con il misuratore di potenza standard. Quindi, inserire la fibra di erogazione della luce in un supporto per fibra ottica e fissarla al micro posizionatore.

Successivamente, collegare un oscilloscopio al generatore di segnale. Per monitorare la modulazione ottica. Utilizza un segnale binario con frequenze e lunghezze di impulso variabili.

Quindi collegare il laser e utilizzare il segnale di modulazione come ingresso TTL per il microscopio. Utilizzare un laser a ioni argon per eccitare l'influenza internalizzata oh 4:00 AM dye e il laser sincronizzato dde. Per l'eccitazione delle nano barre endocitosiche, posizionare le cellule sotto un microscopio confocale invertito e posizionare la fibra di erogazione della luce lontano dalla cellula bersaglio in modalità di illuminazione a trasmissione.

Quindi calcolare il raggio del raggio sul bersaglio. Eseguire l'imaging del campione e il controllo a temperatura ambiente utilizzando l'obiettivo 40x e raccogliere le scansioni delle serie temporali con una risoluzione di 256 x 256 pixel per fotogramma in modalità andata e ritorno. Quindi eseguire la registrazione senza alcuna eccitazione laser DIO al fine di identificare qualsiasi interferenza laser di ioni argon di base, mostrata qui è un'immagine di epifluorescenza delle cellule NG differenziate 1, 0, 8, 15 coltivate da sole e irradiate con la potenza laser di 7,5 watt centimetro quadrato.

E questa è un'immagine delle cellule coltivate con nano barre d'oro irradiate con la potenza del laser di 1,25 watt centimetri quadrati. Ecco un esempio delle cellule neuronali differenziate NG 1, 0, 8, 15 caricate con l'influenza oh 4:00 AM indicatore di calcio. L'immagine è stata scattata utilizzando un microscopio confocale invertito con un obiettivo a immersione in olio 40x.

Questa figura mostra i campioni rappresentativi delle variazioni di calcio indotte dal laser in funzione del tempo. In NG 1 0 8 15, cellule neuronali coltivate in condizioni di assenza di siero per tre giorni con nano barre d'oro di polistirene solfonato, nano barre d'oro e senza nano barre. F max su F zero indica l'aumento della fluorescenza massima rilevata in NG 1 0 8 15 cellule neuronali Dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada a future applicazioni nella simulazione ottica delle cellule neuronali.