Name: Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Scopri un saggio cellulare con reporter luciferasi per identificare composti che modulano la regolazione post-trascrizionale attraverso la regione 3' UTR. Questo metodo facilita la scoperta di nuovi agenti terapeutici.

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Ringraziamo la Fondazione Italiana Neuroblastoma per il pieno sostegno finanziario a questo progetto.

NOTA: La portata di tali sistemi di dosaggio dipende dalla disposizione apparecchiature di laboratorio HTS. Questo protocollo è facilitato da una EVO 200 robot Tecan Freedom, che svolge gestione dei liquidi in formato 96-bene. La miniaturizzazione a 384 pozzetti è anche possibile. Il sistema di gestione dei liquidi robotizzato è posizionata sotto una cappa a flusso laminare per mantenere condizioni di asetticità durante tutte le fasi sperimentali. Se no automazione-liquido trattamento è disponibile, il protocollo può essere facilmente adattato in formato a bassa velocità. Screening primario 1. Giorno 1: Preparare e Celle Seed NOTA: cellule seme di resa 80% di confluenza al momento di saggiare l&#39;attività luciferasica, cioè 48 ore dopo la semina. <ol><li> Risospendere tripsinizzate cellule di neuroblastoma CHP134-mycn3UTR ad una concentrazione di 2 x 10 5 cellule / ml in RPMI contenente 10% FBS e 1% di L-glutammina. Per 27 piastre preparare almeno 250 ml di<html> sospensione cellulare tenendo conto di gestione dei liquidi, Trogoli volumi morti e fasi di pipettamento ripetuti. Versare la sospensione cellulare nel serbatoio sterile e posizionarlo sulla scrivania robot. </li><li> Collocare 9 piastre a 96 pozzetti a barre bianche a fondo piatto e una scatola di 200 microlitri puntali sterili sulla scrivania robot. Mescolare la sospensione cellulare pipettando prima di ogni passo dispensa per evitare cellule sedimentazione per gravità. Dispensare 75 ml di cellule in ogni pozzetto di 9 dischi per ottenere una densità finale di 1,5 × 10 4 cellule per bene. </li><li> Coprire le piastre con i coperchi e lasciarli all&#39;esterno del incubatore per 30 minuti per permettere alle cellule di sedimentare sul fondo del pozzo. Questo ridurrà al minimo gli effetti di bordo. </li><li> Ripetere le fasi 1.2 e 1.3 due volte per preparare un numero totale di 27 piastre. </li><li> Porre le piastre a 37 ° C e 5% di CO 2 e incubare per 24 ore. </li></ol> 2. Giorno 2: Trattare le Celle con Biblioteca Compounds S copi &quot;&gt; NOTA: La piccola biblioteca molecola di Spectrum Collection si compone di 2.000 composti disposti in 8 righe e 10 colonne in 25 piastre da 96 pozzetti alla concentrazione di 10 mM in DMSO I pozzi del primo e ultime colonne vengono lasciati vuoti per i controlli. test di screening. Compound sono tipicamente eseguiti a 1-10 micron concentrazione del composto 8. Il protocollo di screening descritto qui corregge 2 micron come la concentrazione di lavoro e 24 ore come il punto finale del test. <ol><li> Scongelare 9 piastre biblioteca composto a temperatura ambiente. </li><li> Preparare due vasche con PBS sterile e soluzioni% DMSO-0.5 PBS e metterli sulla scrivania robot. Per ogni piastra biblioteca, preparare e etichettare conseguenza una piastra di diluizione - un polipropilene U-bottom piastra a 96 pozzetti con un volume di lavoro di almeno 400 microlitri. Riempire ogni pozzetto di colonne da 2 a 11 piastre di diluizione con 398 ml di PBS sterile con punte fisse del conduttore liquido. Fill colonne 1 e 12, con 50 ml di PBS sterilecon 0,5% DMSO per riprodurre la concentrazione veicolo nei pozzetti di controllo (0,02%). </li><li> Mettere due piastre di libreria, le piastre di diluizione corrispondentemente etichettati, due scatole di 50 microlitri puntali sterili e sei celle piastre sulla scrivania robot. Scoprire cellule piatti. </li><li> Dispensare 2 ml di soluzione di MM 10 stock da una delle due piastre di libreria nella piastra di diluizione corrispondente e mescolare bene. Questo si tradurrà in una concentrazione intermedia composti di 50 pM. Utilizzando lo stesso set di punte, a meno di 3 ml di diluizione 50 micron di 3 piastre da 96 pozzetti bianche codice a barre con le cellule. Questa diluizione risultati schema a 2 micron concentrazione di ogni lavoro testati composto. NOTA: Per evitare manipolazioni inutili con le punte, utilizzare un set completo di 96 consigli fin dall&#39;inizio, anche se i piatti della biblioteca contengono solo 80 composti. Questo è possibile poiché il primo e l&#39;ultimo colonne delle piastre di libreria sono vuoti. </li><li> Sostituire i puntali e ripetere Step 2.4 per la seconda piastra libreria. </li><li> Coprire le piastre cellule e restituirli per l&#39;incubatore per 24 ore. </li><li> Ripetere i passaggi 2,3-2,6 altre due volte per le piastre di libreria rimanenti. </li></ol> 3. Giorno 3: Eseguire Luciferase Assay NOTA: Prima di eseguire il saggio luciferasi, è possibile multiplex con un test di vitalità cellulare basato sulla riduzione dei resazurina per ottenere un indice di vitalità cellulare da ciascun pozzetto 9. Multiplexing luciferasi e dosaggio redditività saggi determina una riduzione del segnale di luciferasi che, tuttavia, può essere ignorato se le cellule forniscono livello sufficientemente alto di attività luciferasica. Attività luciferasi può essere rilevato da una varietà di 10,11 luciferasi reagenti commerciali e fatti in casa con segnale stabile luminescenti. <ol><li> Equilibrare il reagente ricostituito luciferasi di scelta a temperatura ambiente. Assicurarsi che il volume è sufficiente per tutti i piatti analizzati. Per 27 piastras 170 ml di reattivo luciferasi sarà richiesto tenendo conto di gestione dei liquidi, Trogoli volume morto e fasi di pipettamento ripetuti. Versare il reagente luciferasi in un serbatoio e posizionarlo sulla scrivania robot. </li><li> Rimuovere 9 piatti con le cellule dal termostato, metterli sulla scrivania robot, scoprire e attendere fino riportati a temperatura ambiente. Aggiungere 50 ml di reagente luciferasi per piastra bene da piatto. Tra le piastre, introdurre un ritardo pari al tempo di lettura luminescenza di una piastra. Ciò assicurerà che tutte le piastre vengono misurate entro l&#39;intervallo di tempo pari dell&#39;aggiunta del reagente. </li><li> Dopo 30 min di incubazione, posizionare il primo piatto in luminometro e misurare luminescenza dopo una breve fase di agitazione. Ripetere l&#39;operazione per tutte le piastre. Registrare il codice a barre di ciascuna piastra e associarlo al file di dati corrispondente per evitare errori derivanti da un gran numero di piatti trattati. </li><li> Ripetere i passaggi 3,2-3,3 due volte per i restanti 18 piatti con le cellule. </li&gt; <li> Raccogliere il residuo reattivo luciferasi e conservarlo a -20 ° C. </li></ol> 4. Giorno 4: Analisi dei dati <ol><li> Processo dati sperimentali utilizzando la normalizzazione di tutti i campioni alla media di sulla piastra controlli trattati con veicolo. Per ogni composto biblioteca, calcolare il valore medio X e SD su triplica. </li><li> Selezionare up-regolazione e down-regolazione colpi fissando una soglia di X ± k × SD, dove la X valore medio e deviazione standard vengono calcolate su tutti i valori di analisi elaborati, e k è una costante definita. </li><li> Selezionare una soglia arbitraria cut-off &lt;20% dei controlli trattati con veicolo quando una riduzione del segnale di luciferasi è probabilmente associata a tossicità composto. Scartando i colpi di sotto di questa soglia ridurrà notevolmente il numero di colpi falsi positivi del contro-screening. NOTA: Invece di normalizzazione a base di controllo, dati sperimentali possono essere elaborati applicando Z punteggio o la sua robusta analogico B snucleo 12. Inoltre, approcci statistici alternativi per la selezione hit sono disponibili 12. </li></ol> 5. Counter-proiezione NOTA: composti identificati nella schermata principale (classificati come &#39;hits&#39;) sono confermate e valutate per la specificità da un contro-screening. <ol><li> Cherry raccogliere i successi selezionati dalle aliquote conservato in provette con codice a barre 2D singoli e creare nuovo &quot;hit piatti&quot;, salvare il layout corrispondente. Non dimenticate di lasciare posizioni libere per i controlli. NOTA: In mancanza di un efficiente sistema di cherry-picking, si potrebbe verificare sia il controllo e 3 &#39;UTR cellule-cuscinetto in parallelo nel screening primario. In questo caso, specifica selezione di composti con effetti dipendenti solo sulla introdotta 3 &#39;UTR sarà possibile dopo la proiezione primaria eliminando la necessità di contro-screening. Tuttavia, la proiezione parallelo due linee cellulari raddoppierà dosaggioi costi. </li><li> Seguendo il protocollo per lo screening primario (sezione &quot;Giorno 1: Preparare e Cells Seed&quot;), per ogni &quot;hit piastra&quot; preparare tre piastre da 96 pozzetti di ciascuna CHP134-mycn3UTR e CHP134-CTRL cellule stabili. </li><li> Seguendo il protocollo per lo screening primario (sezione &quot;Giorno 2: Trattare celle con Biblioteca Compounds&quot;), utilizzare ogni piastra colpo per il trattamento di tre CHP134-mycn3UTR e tre piastre CHP134-CTRL a 2 micron concentrazione di lavoro. NOTA: Mentre il contatore schermo qui descritto viene eseguito in triplicato alla dose singola di 2 mM, potrebbe essere vantaggioso per sostituire i replicati standard e verificare i risultati in 3 concentrazioni diluizioni di 10 volte da 2 mM a 20 nM. L&#39;applicazione di questo approccio non solo consente di confermare i dati della schermata principale, ma anche di ottenere dati preliminari dose-risposta sui risultati primari, minimizzando tassi di falsi-positivi. In questo caso, una differente tubazione analisi dovrebbe essere applied elaborare i dati sperimentali e confermare i colpi. </li><li> Seguendo il protocollo per lo screening primario (sezione &quot;Giorno 3: Eseguire Luciferase Assay&quot;), misurare l&#39;attività luciferasi in tutte le piastre CHP134-mycn3UTR e CHP134-CTRL. </li><li> Seguendo il protocollo per lo screening primario (sezione &quot;Giorno 4: Analisi dei dati&quot;), normalizzare i dati sperimentali provenienti da pozzi trattati alla media di sulla piastra comandi del veicolo trattati e calcolare la media e SD su repliche. Per ogni composto testato, calcolare la variazione piega di attività luciferasi in CHP134-mycn3UTR vs. cellule CHP134-CTRL. Selezionare Cambia volte arbitrari cut-off di&gt; 1.5 e significatività p-valori &lt;0,01. NOTA: Nelle impostazioni descritte nel parametro determinante per il successo specificità è un cambiamento significativo di attività volte luciferasi in CHP134-mycn3UTR vs. cellule CHP134-CTRL. Se necessario, si potrebbe anche valutare la tossicità composto eseguendo contemporaneamente un test di vitalità cellulare in seComposti zionato. Questo potrebbe essere particolarmente utile se i colpi principali sono contro-proiettati in un&#39;analisi dose-risposta. Per una singola dose, la nostra esperienza indica una forte correlazione tra l&#39;attività luciferasi ridotta con diminuita vitalità cellulare 6. Pertanto, diminuita attività della luciferasi in cellule bersaglio così come cellule di controllo può essere considerato come un indicatore della tossicità composti, alle concentrazioni testate. </li></ol>

<ol><li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13 (1), 220(2012).</li>
<li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li>
<li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+3%E2%80%99+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).</li>
<li>Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cell-Based+High-Throughput+Screen+Addressing+3%E2%80%99+UTR-Dependent+Regulation+of+the+MYCN+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene.</a> Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).</li>
<li>Cheung, N. -K. V., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma%3A+developmental+biology%2C+cancer+genomics+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).</li>
<li>Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+early+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Principles of early drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li>
<li>Herbst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexing+a+high-throughput+liability+assay+to+leverage+efficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Techn%22%5BJournal%5D)">Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies.</a> Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).</li>
<li>van Olst, E. S. iebring-, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affordable+luciferase+reporter+assay+for+cell-based+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening.</a> J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).</li>
<li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li>
<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).</li>
<li>Hitti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+ribosomal+protein+promoter-based+reporter+system+for+selective+assessment+of+RNA+stability+and+post-transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control.</a> RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).</li>
<li>Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+regulatory+elements+in+conserved+3%E2%80%99+UTRs+of+human+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts.</a> Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J. Vis. Exp. (87), (2014).</li>
<li>Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3%E2%80%99+untranslated+region+of+messenger+RNA%3A+A+molecular+%E2%80%9Chotspot%E2%80%9D+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology.</a> Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).</li>
<li>Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+methods+to+monitor+the+modulation+of+mRNA+stability%3A+a+novel+approach+to+drug+discovery+and+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention.</a> J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).</li>
<li>Pascale, A., Govoni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+world+of+post-transcriptional+mechanisms%3A+is+their+deregulation+a+common+link+for+diseases%3F+Focus+on+ELAV-like+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins.</a> Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).</li>
<li>Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+pre-mRNA+processing+and+altered+architecture+of+3%E2%80%99+untranslated+regions+contribute+to+the+development+of+human+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).</li>
<li>Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+GEMS--a+novel+platform+technology+targeting+post-transcriptional+control+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Mining the GEMS--a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms.</a> Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).</li>
<li>Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+post-transcriptional+control+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting post-transcriptional control for drug discovery.</a> RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo descrive un saggio del gene reporter basato su cellule che mira all'identificazione di modulatori che mirano a processi post-trascrizionali 3' UTR-dipendenti. Comprende lo screening primario e il contro-screening e, se necessario, può essere accompagnato da un test di citotossicità. Il risultato dello screening primario è costituito da una serie di preziosi composti candidati, la cui riproducibilità e specificità è ulteriormente convalidata nel contro-screening.
L'identificaz...

Per un lungo periodo di regolazione trascrizionale dell&#39;espressione genica è stato pensato per svolgere un importante ruolo, se non esclusivo controllo della produzione di proteine. Accumulando prove, tuttavia, indica che regolazione post-trascrizionale contribuisce tanto quanto, se non di più, regolazione trascrizionale di determinare proteina cellulare abbondanza 1,2. Controllo post-trascrizionale dell&#39;espressione genica è molto più complesso ed elaborato di quanto non fosse in primo pensiero. In realtà, tutte le varie fasi di controllo post-trascrizionale sono emerse da disciplinare, tra cui l&#39;elaborazione mRNA, localizzazione, fatturato, traduzione 3, nonché il nuovo descritto reversibile RNA metilazione 4. Da una serie di processi di regolazione post-trascrizionali potenzialmente interessati, il saggio di seguito descritto si concentra su quelli che coinvolgono &#39;regione non tradotta (3&#39; del mRNA 3 UTR). 3 &#39;UTR colpisce ampiamente mRNA destino principalmente attraverso specifica interazione tra RNA-binding proteins e RNA non codificanti per le sue sequenze di regolazione e / o strutture secondarie 5. Perciò, piccole molecole che modificano queste interazioni o interferiscono con a monte trasduzione del segnale sarà spostare l&#39;equilibrio che regola la proteina abbondanza. Questo approccio terapeutico è particolarmente importante per le patologie umani per i quali esistono evidenze che dimostrano che geni malattia rilevanti sono sottoposte a regolazione post-trascrizionale, che rappresenta quindi un potenziale bersaglio per l&#39;intervento farmacologico. Pertanto, i sistemi che consentono per lo screening dei modulatori livelli di mRNA &#39;attraverso l&#39;interferenza con i meccanismi di controllo post-trascrizionale in un formato ad alta velocità possono diventare strumenti utili all&#39;identificazione di potenziali trattamenti innovativi. Il saggio basato su cellule gene reporter descritto consente l&#39;identificazione di composti capaci di modulare mRNA destino attraverso meccanismi dipendenti dalla sua 3 &#39;UTR. Si compone di diverse parti principali componenti (Figura 1) e richiede pochi passi preliminari per convalidare la fattibilità del test. Prima di tutto, il costrutto giornalista è progettato per includere UTR 3 &#39;da un gene di interesse. Il 3 &#39;UTR si fonde alla fine di un gene reporter luciferasi di lucciola come (Figura 1). Eventuali cambiamenti di meccanismi di controllo post-trascrizionali esercitate attraverso l&#39;inserimento 3 &#39;UTR altereranno la stabilità e / o l&#39;efficienza della traduzione di questa trascrizione chimerico, causando diversi livelli luciferasi. Pertanto, le variazioni di attività luciferasica servono come misura indiretta della colpita regolazione post-trascrizionale del gene di interesse. Il secondo componente del sistema è un costrutto di controllo giornalista, un plasmide di espressione identica che esprime lo stesso gene reporter, ma non contiene alcun 3 &#39;UTR. I due plasmidi reporter possono essere progettati in laboratorio utilizzando protocolli di biologia molecolare convenzionali o acquistati da fonti commerciali. La selezione di una linea cellulare appropriata è fondamentale per la costruzione dosaggio. Quale linea cellulare è il modello ottimale dipende da numerosi fattori che vanno dai requisiti clinici come somiglianza massima alla patologia a questioni solo pratici come caratteristiche disponibilità, transfectability, e la crescita. È importante sottolineare che, prima di procedere si deve fare in modo che la fusione del 3 &#39;UTR al gene reporter ha un effetto previsto sul livello di trascrizione chimerico. L&#39;assenza di una significativa differenza di segnale luciferasi dal 3 &#39;UTR-cuscinetto e controllo giornalista costruisce trasfettate nelle celle selezionate indicherebbe che il 3&#39; UTR non è funzionale in questo modello cellulare, spingendo per la ricerca di quelli alternativi. Per il formato ad alta velocità, le 3 &#39;UTR portante e controllo costrutti reporter luciferasi dovrebbero essere stabilmente integrati nella linea cellulare selezionata. Utilizzando un stabilmente integrato su transitoriamente trasfettatelinea cellulare è preferibile per diverse ragioni. Questo amplierà la scelta di un modello di cellulare, incluse le linee di cellule di difficile trasfezione, diminuire la variabilità dei dati derivanti dalle fluttuazioni di efficienza di trasfezione, abbasserà i costi. Inoltre, su cellule trasfezione transiente sono molto spesso sovraccarico di un plasmide di DNA che porta alla saturazione del sistema. In queste impostazioni un ulteriore aumento dell&#39;espressione giornalista potrebbe essere difficile, con conseguente diminuzione della sensibilità verso i potenziali composti upregulating. Infine, quando tutti i componenti del dosaggio sono impostati, è fondamentale prima di passare al formato high-throughput per determinare la fattibilità del test, vale a dire, se l&#39;attività luciferasi può essere davvero up- e down-regolato specificamente tramite inserito 3 &#39; UTR. I migliori controlli sarebbero piccole molecole segnalati per modulare la stabilità o traducibilità dell&#39;mRNA attraverso UTR 3 &#39;di interesse. Se avere questi ènon è possibile, si accettano controlli surrogate imitano l&#39;effetto desiderato. Questi potrebbero essere miRNA o RNA-binding proteins noti per esercitare i loro effetti attraverso il legame al 3 &#39;UTR di interesse. La valutazione di tali controlli prima della proiezione principale indica non solo la funzionalità del test sviluppato, ma consente anche per la stima della sua gamma dinamica, sensibilità e prestazioni nel formato ad alta produttività. Utilizzando il protocollo descritto abbiamo proiettato una biblioteca di 2.000 composti 6. Neuroblastoma, il tumore solido extracranico più comune dell&#39;infanzia, è stato utilizzato come modello biologico e la 3 &#39;UTR dell&#39;oncogene MYCN, la cui amplificazione predice fortemente esito negativo di neuroblastoma, come gene bersaglio 7. Figura 2 ne illustra lo schema sperimentale. La proiezione è stata divisa in tre corse con la dimensione del lotto di 27 lastre proiettati in una corsa. Il lotto di 27 piatti inclusi biblioteca Spectrum CollectionPiastre n.1-n.8 + n.25 (prima esecuzione),-n.16 n.9 + n.25 (seconda manche) e n.16, n.24 + n.25 (terza pista), ciascun Piastra proiettato in triplice copia. Così, una piastra biblioteca (n.25) è stato analizzato in tutti i tre piste che rendono possibile il confronto inter-run. Il protocollo che segue descrive una singola esecuzione di 9 dischi biblioteca testati in triplice copia.

<table><tbody><tr><td>Piastra di coltura a 96 pozzetti</td><td>Bianco PerkinElmer</td><td>6005688</td><td></td></tr><tr><td>StorPlate 96 pozzetti Fondo a U (piastra di diluizione)</td><td>PerkinElmer</td><td>6008190</td><td></td></tr><tr><td>100 ml trogolo monouso per reagenti</td><td>Tecan</td><td>10 613 048</td><td></td></tr><tr><td>300 ml serbatoio robotico monouso</td><td>VWR</td><td>PB12001301</td><td></td></tr><tr><td>Punte per robot DITI 50&nbsp; &mu; l</td><td>Tecan</td><td>sterile 30038607</td><td></td></tr><tr><td>Punte per robot DITI 200&nbsp; &mu; l Matrice sterile</td><td>Tecan</td><td>30038617</td><td></td></tr><tr><td>1,4 ml 2D con codice a barre con provette a fondo piatto</td> Sistema di analisi della luciferasi <td>Thermo Scientific</td><td>3711</td><td></td></tr><tr><td>ONE-GLO&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E6120</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-918F</td><td></td></tr><tr><td>PBS-1x, senza Ca2+, Mg2+</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina 200&nbsp; mM</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>La collezione Spectrum (libreria composta)</td><td>MicroSource Discovery Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Robot Tecan Freedom EVO200&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lettore multipiastra Tecan F200&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di genes post-trascrizionale regolamentati

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Sia trascrizionale e regolazione post-trascrizionale hanno un profondo impatto sulla espressione dei geni. Tuttavia, i saggi di screening basati su cellule comunemente adottati concentrarsi sulla regolazione trascrizionale, essendo essenzialmente finalizzata alla identificazione di molecole promotore-targeting. Come risultato, meccanismi post-trascrizionali sono ampiamente privi di espressione genica sviluppo di farmaci mirati. Qui si descrive un saggio basato su cellule finalizzata a studiare il ruolo di &#39;regione non tradotta (3&#39; UTR 3) nella modulazione del destino del suo mRNA, e ad identificare composti in grado di modificarlo. Il saggio si basa sull&#39;impiego di un costrutto reporter di luciferasi contenente la 3 &#39;UTR di un gene di interesse stabilmente integrati in una linea cellulare malattie rilevanti. Il protocollo è diviso in due parti, con la messa a fuoco iniziale sul screening primario finalizzato alla identificazione di molecole che influenzano l&#39;attività della luciferasi dopo 24 ore di trattamento. La seconda parte del protocollodescrive the-counter di screening necessario per discriminare i composti modulanti attività luciferasi in particolare attraverso UTR 3 &#39;. Oltre al protocollo dettagliato e risultati rappresentativi, forniamo importanti considerazioni circa lo sviluppo del test e la validazione del colpo (s) sul bersaglio endogena. Il reporter assay gene cell-based descritto permetterà agli scienziati di identificare molecole che modulano i livelli di proteina attraverso meccanismi post-trascrizionali dipendenti da una &#39;UTR 3.

Utilizzando l&#39;approccio descritto, abbiamo proiettato una biblioteca 2.000 composti per potenziali modulatori di meccanismi di controllo post-trascrizionale esercitata attraverso la 3 &#39;UTR del gene MYCN. La figura 3 illustra i risultati dello screening primario esemplificato da una singola piastra di libreria. Segnale luciferasi visualizzato come percentuale dei controlli trattati con veicolo è stata ottenuta misurando l&#39;attività luciferasica in triplicato in piastre di cellule CHP1...

Qui descriviamo un saggio genetico reporter basato su cellule come uno strumento prezioso per lo screening di librerie chimiche per composti che modulano i meccanismi di controllo post-trascrizionale esercitati attraverso 3' UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Questo esperimento analizza librerie chimiche alla ricerca di composti che modulano i meccanismi di controllo post-trascrizionale attraverso la regione non tradotta all'estremità tre primi degli RNA messaggeri. Per prima cosa, identificare la regione non tradotta all'estremità tre primi di interesse nel gene bersaglio. Clonare questa UTR tre primi in un plasmide reporter di controllo della luciferasi El per creare un trascritto chimera di luciferasi El con UTR tre primi.Quindi in modo stabile, integrare i due plasmidi in una linea cellulare rilevante per la malattia, seminare le cellule portatrici del trascritto chimerico in piastre a 96 pozzetti, trattarle con una libreria di composti per 24 ore e quindi identificare le molecole che influenzano l'attività della luciferasi.Selezionare manualmente le molecole scelte per ulteriori screening di convalida, quindi trattare sia le cellule di controllo che le cellule portatrici del trascritto chimera con la regione UTR tre primi della luciferasi con un sottoinsieme di libreria precedentemente selezionato. I risultati permetteranno di distinguere se l'effetto di un composto è mediato attraverso la regione tre primi non tradotta o attraverso altre sequenze del vettore. A differenza della maggior parte degli saggistica basati su reporter.Test che si concentrano sulla regolazione della trascrizione; questi test basati su cellule si focalizzano sull'identificazione di composti che modulano i livelli di trascritto mRNA attraverso la regione tre prime e quella tradotta. Raccogliere le cellule di neuroblastoma stabili trasfettate mediante tripsinizzazione. Diluire le cellule a una concentrazione di due volte 10 alla quinta cellule per millilitro.In RPMI contenente 10% di FBS e 1% di L-glutamina per 27 piastre. Preparare almeno 250 millilitri di sospensione cellulare, tenendo conto delle operazioni di movimentazione dei liquidi, dei volumi morti nei serbatoi e delle ripetute operazioni di pipettaggio. Versare quindi la sospensione cellulare in un serbatoio sterile e posizionarlo sul banco del robot.Caricare nove piastre bianche a fondo piatto con codice a barre e una scatola di puntali sterili da 200 microlitri sul banco del robot. Mescolare la sospensione cellulare, quindi distribuire 75 microlitri di cellule in ciascun pozzetto delle nove piastre.Coprire le piastre e lasciare sedimentare le cellule sul fondo del pozzetto per 30 minuti al fine di minimizzare gli effetti di bordo. Successivamente, posizionare tutte e nove le piastre a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e incubare per 24 ore. Procedere in modo analogo con le piastre rimanenti, nove alla volta.Scongelare le piastre della libreria di composti a temperatura ambiente. Riempire un serbatoio con PBS sterile e un altro con soluzione di PBS contenente DMSO 0,5% e posizionarli sul banco del robot. Per ogni piastra della libreria.Preparare ed etichettare di conseguenza. Una piastra di diluizione. Ora aggiungere 398 microlitri di PBS sterile in ciascun pozzetto delle colonne da due a 11 delle piastre di diluizione.Quindi riempire le colonne uno e 12 con 50 microlitri di DMSO al 0,5% in PBS sterile. Successivamente, caricare le due piastre di diluizione. Due piastre di libreria, due scatole di puntali sterili da 50 microlitri e sei piastre cellulari sul banco del robot.Ora scoprire le piastre cellulari, pipettare due microlitri della soluzione stock da 10 millimolari da una delle due piastre della libreria nella piastra di diluizione corrispondente e mescolare bene. Utilizzando lo stesso set di punte. Trasferire tre microlitri della diluizione da 50 micromolari nelle tre piastre bianche codificate a barre da 96 pozzetti contenenti le cellule.Sostituire l'intero set di punte e ripetere l'induzione cellulare per la seconda piastra di libreria. Coprire le colture e incubare per 24 ore. Quindi ripetere il processo di diluizione del composto e di induzione cellulare per le piastre di libreria rimanenti.Portare il reagente di luciferasi ricostituito scelto a temperatura ambiente. Posizionare il serbatoio di luciferasi sul banco del robot e versare il reagente al suo interno. Prelevare nove piastre di colture indotte dall'incubatore.Posizionarli sul bancone del robot, scoprirli e portarli all'equilibrio alla temperatura ambiente. Quindi aggiungere 50 microlitri di reagente luciferasi per pozzetto tra le piastre. Introdurre un ritardo pari al tempo di lettura della luminescenza di una piastra.Dopo un'incubazione di 30 minuti. Registrare innanzitutto il codice a barre della piastra per associarlo al file di dati corrispondente. Successivamente, posizionare la prima piastra nel luminometro e misurare la luminescenza.Dopo un breve passaggio di agitazione, ripetere le letture di luminescenza per tutte le piastre di induzione. Quindi raccogliere il reagente Lucifer race rimanente e conservarlo a meno 20 gradi Celsius. Una volta elaborati i dati sperimentali dello screening primario, selezionare i risultati positivi per confermare la specificità del composto mediante un cherry-picking di contro-screening.Selezionare i colpi positivi e creare un layout per la nuova piastra di screening, includendo le posizioni per i controlli. Successivamente, a partire dagli aliquote conservati in singole provette con codice a barre 2D, preparare nuove piastre HIIT. Seguire lo stesso protocollo utilizzato per lo screening.Preparare 3 piastre a 96 pozzetti per ciascuna linea cellulare stabile per ogni piastra hi. Il giorno successivo, trattare le cellule con i composti della libreria. Utilizzare ogni piastra hi per trattare tre piastre di CHP 1 34 micken, tre piastre con UTR prime e tre piastre con cellule di controllo a una concentrazione lavorativa di due micromoli per 24 ore.Misurare l'attività della luciferasi in tutte le piastre CHP 1 34, nei tre gruppi di controllo e nelle sequenze non tradotte della regione 3' prime. Come nell'analisi dei dati dello screening primario, normalizzare i dati sperimentali dei pozzetti trattati rispetto alla media dei controlli della stessa piastra trattati con il veicolo. Quindi calcolare la media e la deviazione standard sulle repliche per ciascun composto testato.Il cambio di espressione dell'attività della luciferasi in CHP 1 34 McIn tre prime UTR rispetto alle cellule di controllo CHP 1 34. Si selezionano arbitrariamente cutoff di cambio di espressione maggiori di 1,5 e valori di significatività P inferiori a 0,01. Questo esperimento ha esaminato una libreria di 2000 composti per identificare potenziali modulatori dei meccanismi di controllo post-trascrizionale esercitati attraverso il tre prime UTR dell'oncogene mic. I risultati dei segnali di luciferasi di una singola piastra rappresentativa su 25 della libreria sono riportati come percentuale rispetto al trattamento con veicolo.I controlli mostrano che la maggior parte dei composti non ha indotto alcun effetto apparente sul three prime UTR. I composti selezionati ("hit") sono quelli in cui il valore medio e la deviazione standard sono stati calcolati su tutti i valori dell'assay; i composti che riducono l'attività della luciferasi sotto il 20% indicano probabilmente una tossicità cellulare pronunciata. Questo grafico mostra risultati rappresentativi per lo screening di controllo di quattro composti selezionati indicati con WX, Y e Z. Entrambi i composti W e X determinano un aumento dell'espressione della luciferasi da parte del reporter del three prime UTR dell'oncogene, come indicato dalla differenza nel fold change e dal test T. Si noti che, sebbene gli effetti di entrambi i composti W e X siano effettivamente dipendenti dal three prime UTR, il composto W non ha alcun effetto significativo sulla vitalità cellulare.Sebbene il composto X mostri una certa attività citotossica, indicata dal segnale di luciferasi normalizzato nelle cellule di controllo CHP 1 34, né il composto Y né il composto Z a una concentrazione di due micromolar non mostrano un effetto dipendente dalla regione UTR tre primi sui livelli di luciferasi. La riduzione dell'attività della luciferasi rilevata nel test primario dopo trattamento con il composto Y è piuttosto una conseguenza della citotossicità. Nel caso del composto Z, l'aumento dell'attività della luciferasi è dovuto a un'attivazione aspecifica, in termini di UTR tre primi, del promotore virale.Dato che un analogo aumento è osservato sia nei gruppi di controllo che in quelli non tradotti, in questo saggio ad alta capacità ricordare che la conferma dell'effetto primario nel calore delle cellule di controllo è fondamentale per discriminare i composti che agiscono effettivamente attraverso la regione non tradotta tre prime da quelli che operano tramite il promotore.

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