Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Questo esperimento esamina le librerie chimiche alla ricerca di composti che modulano i meccanismi di controllo post-trascrizionale attraverso le tre prime regioni non tradotte dei trascritti. In primo luogo, identificare le tre principali regioni non tradotte di interesse nel gene bersaglio. Clona questi tre UTR primi nel plasmide reporter di controllo della luciferasi El per creare la trascrizione chimerica UTR a tre UTR primi di El luciferasi.

Poi stabilmente. Integrare i due plasmidi in una linea cellulare rilevante per la malattia seminare le cellule che trasportano il trascritto chimerico in 96. Le piastre a pozzetti li trattano con una libreria di composti per 24 ore e quindi identificano le molecole che influenzano l'attività della luciferasi.

Scegliete le molecole selezionate per un ulteriore screening di convalida e, successivamente, trattate sia le cellule di controllo che le cellule che trasportano la luciferasi tre trascritti chimerici UTR principali con un sottoinsieme di librerie selezionate con cura. I risultati differenzieranno se l'effetto di un composto è mediato attraverso la regione dei tre primi non tradotti o tramite altre sequenze vettoriali. A differenza della maggior parte dei saggi di screening basati sui reporter.

I saggi che si concentrano sulla regolazione della trascrizione, questi riportano saggi basati su cellule e si concentrano sull'identificazione di composti che modulano i livelli di trascrizione dell'mRNA attraverso tre regioni prime e tradotte. Raccogliere le cellule di neuroblastoma stabilmente trasfettate mediante tripsina asiatica. Diluire le cellule a una concentrazione di due volte 10 per la quinta cellula per millilitro.

In RPMI contenente il 10% di FBS e l'1% di L-glutammina per 27 piastre. Preparare almeno 250 millilitri di sospensione cellulare, tenendo conto della manipolazione dei liquidi, dei volumi morti minimi e delle fasi di pipettaggio ripetute. Quindi versare la sospensione cellulare in un serbatoio sterile e posizionarla sulla scrivania del robot.

Carica nove piatti bianchi con codice a barre. Sul fondo 96 piastre a pozzetti e una scatola di puntali per pipette sterili da 200 microlitri sulla scrivania del robot. Mescolare la sospensione cellulare, quindi erogare 75 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di nove piastre.

Coprire le piastre e lasciare sedimentare le cellule sul fondo del pozzetto per 30 minuti per ridurre al minimo gli effetti dei bordi. Quindi posizionare tutte e nove le piastre a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica e incubare per 24 ore. Allo stesso modo, procedi con le restanti piastre nove alla volta.

Scongelare le piastre della libreria composta a temperatura ambiente. Riempire una mangiatoia con PBS sterile e un'altra con DMSO allo 0,5% in soluzione PBS e posizionarle sulla scrivania del robot. Per ogni piatto della libreria.

Preparare ed etichettare di conseguenza. Una piastra di diluizione. Ora riempi ogni pozzetto di colonne, da due a 11 piastre di diluizione con 398 microlitri di PBS sterile.

Quindi riempire le colonne uno e 12 con 50 microlitri di DMSO allo 0,5% in PBS sterile. Quindi caricare le due piastre di diluizione. Due piastre per libreria, due scatole da 50 microlitri di puntali sterili e sei piastre per celle sulla scrivania del robot.

Ora scoprire le piastre cellulari, pipettare due microlitri della soluzione madre da 10 millimolari da una delle due piastre della libreria nella piastra di diluizione corrispondente e mescolare bene. Utilizzando lo stesso set di punte. Trasferire tre microlitri della diluizione a 50 micromolari nelle tre piastre bianche a 96 pozzetti con codice a barre contenenti le cellule.

Sostituire l'intero set di punte e ripetere le induzioni delle celle per la seconda piastra della libreria. Coprire le colture e incubare per 24 ore. Quindi ripetere il processo di diluizione del composto e di induzione cellulare per le restanti piastre della libreria.

Equilibrare il reagente luciferasi ricostituito a scelta a temperatura ambiente. Posiziona il serbatoio della luciferasi sulla scrivania del robot e versaci dentro il reagente. Rimuovere nove piastre di colture indotte dall'incubatrice.

Posizionali sulla scrivania del robot, scoprili ed equilibrali a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 50 microlitri di reagente luciferasi per pozzetto tra le piastre. Introdurre un ritardo pari al tempo di lettura della luminescenza di una piastra.

Dopo un'incubazione di 30 minuti. Per prima cosa registrare il codice a barre della targa per associarlo al file di dati corrispondente. Quindi, posiziona la prima lastra nel luminometro e misura la luminescenza.

Dopo una breve fase di agitazione, ripetere le letture della luminescenza per tutte le piastre di induzione. Quindi raccogli il reagente rimanente della razza Lucifero e conservalo a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Una volta elaborati i dati sperimentali dello screening primario, selezionare i risultati per confermare la specificità del composto mediante un contatore di screening della ciliegia.

Scegli i colpi selezionati e crea un layout per la nuova piastra di vagliatura, comprese le posizioni per i controlli. Quindi, dalle aliquote memorizzate in singole provette con codice a barre 2D, creare nuove piastre HIIT. Seguire lo stesso protocollo è per lo screening.

Preparare 3 piastre da 96 pozzetti di ciascuna linea cellulare stabile per ogni piastra hi. Il giorno successivo, trattare le cellule con composti di libreria. Utilizzare ciascuna piastra hi per trattare tre piastre di CHP 1 34 micken, tre UTR primarie e tre piastre con celle di controllo a due concentrazioni di lavoro micromolari in 24 ore.

Misurare l'attività della luciferasi in tutte le piastre CHP 1 34, i tre set principali non tradotti e di controllo. Come per l'analisi dei dati nello screening primario, normalizzare i dati sperimentali dai pozzetti trattati alla media dei controlli trattati con veicolo su targa. Quindi calcola la media e la deviazione standard sulle repliche per ogni composto testato calcolare.

La variazione di piega dell'attività della luciferasi in CHP 1 34 McIn tre UTR prime rispetto a CHP 1 34. Le celle di controllo selezionano cutoff di modifica completa arbitrari superiori a 1,5 e valori P di significatività inferiori a 0,01. Questo esperimento ha esaminato una libreria di 2000 composti per potenziali modulatori dei meccanismi di controllo post-trascrizionale esercitati attraverso i tre UTR primari del microfono e dell'oncogene, i risultati dei segnali luciferasi di una singola piastra di libreria rappresentativa su 25 visualizzata come percentuale del veicolo trattato.

I controlli mostrano che la maggior parte dei composti non ha suscitato alcun effetto apparente sui tre UTR primari. I risultati sono stati selezionati in cui il valore medio e la deviazione standard sono stati calcolati su tutti i valori del saggio, i composti che riducono l'attività della luciferasi al di sotto del 20% sono molto probabilmente indicativi di una tossicità cellulare pronunciata del composto. Entrambi i composti W e X determinano un aumento dell'espressione della luciferasi dal reporter UTR principale dell'oncogene, come indicato dalla differenza di variazione di piega e dal test T. Si noti che, mentre gli effetti di entrambi i composti W e X dipendono realmente dai tre composti UTR primari, W non ha alcun effetto significativo sulla vitalità cellulare.

Mentre il composto X mostra una certa attività citotossica come indicato dal segnale normalizzato della luciferasi nelle cellule di controllo CHP 1 34, né il composto Y né il composto Z a due concentrazioni micromolari mostrano un effetto dipendente da UTR a tre primi sui livelli di luciferasi. La diminuzione dell'attività della luciferasi rilevata nello screening primario dopo il trattamento con il composto Y è piuttosto una conseguenza della citotossicità. Nel caso del composto Z, l'aumento dell'attività della luciferasi è dovuto all'attivazione non specifica in termini di tre prime UTR del promotore virale.

Poiché si osserva una sovraregolazione equivalente sia nei set di controllo che in quelli non tradotti in questo saggio ad alto rendimento, si ricorda che la convalida del calore primario nelle celle di controllo è fondamentale per la discriminazione dei composti che agiscono realmente attraverso la regione primaria non tradotta da quei composti che operano tramite promotore.