Analisi di autofagia in

Lo scopo di questa procedura è indurre e osservare l'autofagia in un fungo filamentoso. Questo obiettivo viene raggiunto innanzitutto inoculando piccoli volumi di mezzo contenente nutrienti con spore o piccoli frammenti di micelio. Nel secondo passaggio, vengono preparati dei tamponi di privazione nelle cavità di vetrini microscopici in vetro, quindi l'inoculo viene trasferito sui tamponi.

Nell'ultimo passaggio, i tamponi di privazione vengono incubati in una camera umida per indurre l'autofagia. In definitiva, l'autofagia può essere monitorata osservando il transito di proteine marcatrici fluorescenti di interesse verso le vacuole mediante microscopia fluorescente. Questo metodo può contribuire allo studio di questioni fondamentali nel campo della biologia cellulare, come l'identificazione di nuovi composti che modulano il processo di autofagia.

Per preparare un esperimento di privazione di nutrienti, se il ceppo di P cresa genum di interesse è conservato su riso verde, posizionare dapprima due o tre chicchi di riso ricoperti di micelio saturo in una provetta da centrifuga micro da 1,5 ml e riempire la provetta con 500 microlitri di mezzo di crescita YE (estratto di lievito e glucosio) o mezzo GG completo. Quindi vortexare la provetta per 30 secondi in modo che le spore si stacchino dal riso e incubare la provetta per un giorno a temperatura ambiente. Il giorno successivo, diluire il sospensione di spore a un rapporto di 1 a 50 in acqua del rubinetto sterile e mescolare accuratamente se il p cryogen è conservato su agar.

Utilizzare una pipetta per trasferire piccoli frammenti di micelio in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro contenente 400 microlitri di acqua di rubinetto sterile e circa 100 milligrammi di perline di vetro. Successivamente, vortexare il tubo per due minuti in modo che i miceli vengano frammentati. Per coltivare il genere PCE su un pad di privazione, riscaldare prima una piastra termica a circa 60 gradi Celsius.

Successivamente, sciogliere due grammi di aros in 100 millilitri di acqua di rubinetto nel microonde fino a quando la soluzione risultante è completamente limpida, mentre l'aros si raffredda a circa 60 gradi Celsius. Etichettare un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri per campione con 400 microlitri di acqua di rubinetto sterile o soluzione del composto. Quindi riscaldare i tubi e i vetrini portaoggetti sulla piastra riscaldante per almeno 60 secondi.

Trasferire 400 microlitri di aros a 60 gradi Celsius in tutti i tubi, portando il volume totale in ciascun tubo a 800 microlitri, quindi vortexare brevemente i tubi e rimetterli sulla piastra riscaldante per evitare la solidificazione prematura. Ora pipettare 140 microlitri della soluzione di aros appropriata nella cavità di ciascun vetrino da microscopio. Facendo attenzione a non formare bolle, appiattire immediatamente l'aros con coprioggetti, quindi lasciare riposare i vetrini per circa quattro minuti.

A temperatura ambiente, quando i pad di agarosio si sono solidificati, utilizzare il pollice o l'indice per rimuovere con attenzione i coverslip e posizionare i vetrini con i pad in una camera umida. Successivamente, pipettare cinque microlitri del P. aeruginosa precedentemente preparato al centro del pad di privazione e avvolgere la camera umida in un sacchetto di plastica per una maggiore protezione contro la disidratazione, avendo cura di non muovere eccessivamente la scatola né di disturbare le colture. Quindi conservare gli inoculi a temperatura ambiente per almeno 20 ore prima di analizzare i campioni.

Il giorno successivo, trasferire i vetrini su carta assorbente asciutta e quindi aggiungere 50 microlitri di acqua su ciascun tampone di privazione. Utilizzare un coprioggetto per espellere l'acqua in eccesso, rimuovendola con carta assorbente fresca. Successivamente, per ogni vetrino, utilizzare un obiettivo 20x per acquisire una visione d'insieme della crescita del micelio.

Per valutare la localizzazione della GFP nell'Hy-Fi, aprire le immagini con l'obiettivo 63 x o 100 x. Infine, riposizionare i vetrini nella camera umida dopo ogni osservazione, fino al successivo punto sperimentale.

In queste immagini, il ceppo G-F-P-S-K-L-P Creo Genum è stato utilizzato per valutare la degradazione dei perossisomi a 20 ore di incubazione. La GFP non è stata osservata nei vacuoli, né questi organelli erano ingranditi. Tuttavia, a 40 ore di crescita, i vacuoli marcati con GFP sono stati visualizzati in alcuni ife, indicando l'attivazione dell'autofagia, con ulteriore osservazione della fluorescenza GFP e vacuoli ingranditi a 60 ore.

In questo esperimento, un mutante delta 80 G uno di p caressa Genum è stato utilizzato come controllo negativo. Si noti l'assenza di ingrandimento della vacuolo e di GFP, anche dopo 60 ore di crescita. Come controllo positivo, è stato utilizzato il farmaco stimolante l'autofagia, la rapamicina, come osservato con il ceppo G-F-P-S-K-L non trattato. Le vacuole marcate con GFP sono diventate visibili dopo 40 ore di crescita, con l'Hy-Fi che si è riempito completamente di grandi vacuole contenenti GFP entro 60 ore.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare l'autofagia nei funghi mentis.