Novel microscopia a forza atomica Based biopanning per isolamento di Morfologia reagenti specifici contro TDP-43 varianti di Sclerosi Laterale Amiotrofica

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare reagenti specifici per la morfologia contro la proteina legante il DNA di tar. 43 varianti presenti in un LS utilizzando una tecnologia di panatura radioattiva basata su A FM in due fasi. Questo viene ottenuto sottoponendo innanzitutto una libreria diversificata di fagi a diversi cicli di panatura negativa contro antigeni fuori bersaglio utilizzando tubi immunologici.

Il panning negativo viene eseguito in modo sequenziale contro albumina sierica bovina, alfa-sinucleina aggregata e tessuto cerebrale umano sano. Il secondo passaggio consiste nel completare una verifica FM dopo ogni serie di panning negativo per assicurare la rimozione efficace di tutti i fagi indesiderati. In questo esempio di panning negativo, utilizzando fagi dell'alfa-sinucleina aggregata, i fagi sono visibili dopo un ciclo, ma assenti dopo il 10° ciclo.

Successivamente, a causa della limitata disponibilità del campione, vengono effettuati i successivi cicli di panatura negativa su MICA. I fagi reattivi al TDP-43 immunoprecipitato da tessuto sano e da tessuto affetto da demenza frontotemporale o FTD vengono rimossi in modo sequenziale. L'ultimo passaggio consiste nell'isolare i fagi che si legano all'a LS immunoprecipitato.

I TDP-43 utilizzando fagi legati alla mica sono elusi mediante tripsina, trietilammina e TG una cellula. Alla fine, la specificità di queste potenziali linee cellulari ALS viene verificata mediante saggio indiretto ELISA e dot blot, in cui tessuti cerebrali umani omogeneizzati provenienti da pazienti ALS-FTD e da soggetti sani vengono immobilizzati in entrambi i saggi. Di solito si osserva una maggiore reattività verso il tessuto ALS rispetto agli altri gruppi testati.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla bio-pannatura fagica convenzionale è l'utilizzo di protocolli di pannatura negativa esaustivi, verificati mediante un MF, per garantire l'isolamento di reagenti che riconoscono selettivamente varianti proteiche specifiche della malattia direttamente da campioni biologici complessi, anche quando presenti a basse concentrazioni. Sebbene un MF possa fornire informazioni utili per lo studio delle caratteristiche biomolecolari e delle interazioni, può essere applicato anche ad altri sistemi, come il monitoraggio dell'andamento della bio-pannatura e la conferma della specificità di singoli CLO. Iniziare questa procedura con la produzione dei fagi come descritto nel protocollo testuale, eseguendo prima la pannatura negativa contro BSA, aggiungendo quattro millilitri di una soluzione di un milligrammo per millilitro.

Soluzione di BSA in soluzione salina tamponata al fosfato o PBS in 12 provette immuno e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, combinare le particelle fagiche provenienti da ciascuna delle tre librerie, mettendo da parte una piccola quantità di questa miscela di fagi per la successiva verifica del processo di panning negativo. Poi scartare la soluzione di BSA dalla prima provetta e lavare la provetta due o tre volte con PBS per rimuovere qualsiasi BSA non legata, aggiungere le librerie fagiche combinate a questa prima provetta, incubare per 30 minuti a temperatura ambiente sul rotatore prima di raccogliere i fagi non legati.

Tenere presente che è importante conservare una piccola quantità di fago dopo aver completato i numerosi cicli di panatura negativa contro ciascun bersaglio, al fine di verificare il successo del processo di panatura e in caso di contaminazione, ripetere il processo di panatura negativa utilizzando ogni volta i tubi rimanenti di soluzione di BSA. Utilizzare i fagi non legati raccolti dopo l'incubazione del tubo precedente. Successivamente, verificare l'eliminazione di tutti i fagi leganti la BSA mediante la procedura A FM descritta nella sezione successiva del video.

Per visualizzare il legame del fago mediante microscopia a forza atomica (FM), aggiungere da 10 a 20 microlitri dell'antigene bersaglio alla mica scissa e incubare per cinque-dieci minuti. Lavare la MICA cinque volte con acqua, quindi aggiungere da 10 a 20 microlitri dei fagi alla MICA e incubare per cinque-dieci minuti. Lavare nuovamente la mica cinque volte con acqua e lasciare asciugare all'aria.

Eseguire un processo di imaging in FM utilizzando una modalità tapping in FM con un nanoscopio tre, un controller in aria a temperatura ambiente. Le sonde in silicio per FM hanno una frequenza di risonanza di 300 kilohertz e una costante elastica di 40 newton al metro. Inserire la punta per FM nel caricatore di punte.

Collegare il caricatore della punta al microscopio A FM. Posizionare il campione sotto il microscopio A FM. Utilizzare le manopole per allineare il laser sulla punta A FM.

Impostare la velocità di scansione a 3,05 hertz e la risoluzione di scansione a 512 campioni per riga. Eseguire l'Auto-Tuning della macchina per ottimizzare la vibrazione della silice. Frequenza della punta, avviare la scansione del campione.

La punta scansionerà la superficie della MICA misurando l'altezza del fago legato. I fagi sono le lunghe linee bianche che seguono il processo di acquisizione delle immagini mediante un semplice appiattimento dello sfondo, in modo da garantire che tutte le dimensioni delle particelle siano confrontabili all'interno di ciascuna immagine. La larghezza del fago può variare da un'immagine all'altra a causa delle dimensioni di altre particelle e dell'area di scansione, ma non comprometterà mai l'accuratezza della determinazione del legame o meno del fago all'antigene.

L'immagine viene appiattita in un'immagine 2D e le regioni mal immaginate causate dalla contaminazione da PEG vengono evidenziate per essere rimosse dalle future analisi dei dati. Immunoprecipitare la proteina TDP-43 sana da tessuto cerebrale umano sano come descritto nel protocollo testuale, a causa della minore quantità di proteina immunoprecipitata. Eseguire questi cicli di panning negativo utilizzando prima MICA, dividendo otto superfici MICA alla prima MICA con circa 100 microlitri della proteina immunoprecipitata e incubare per cinque-dieci minuti a temperatura ambiente dopo l'incubazione.

Lavare la MICA cinque volte con soluzione salina fosfato allo 0,1 % contenente Tween 20, abbreviata PBST. Successivamente, aggiungere circa 100 microlitri di fago dopo il panning negativo contro tessuto cerebrale umano sano e incubare per cinque-dieci minuti a temperatura ambiente. A metà dell'incubazione, aggiungere la proteina immunoprecipitata alla seconda mica.

Raccogliere il fago dalla prima MICA prima di lavare la MICA cinque volte con PBST 0,1%. Dopo aver lavato la seconda mica, aggiungere il fago precedentemente raccolto. Ripetere l'intero processo fino a quando il fago non viene sottoposto a panatura negativa contro tutte e otto le miche con la proteina immuno-precipitata.

Verificare l'esito positivo del processo di panning utilizzando il fago dopo il primo e l'ottavo ciclo di panning negativo con un FM per iniziare l'immunoprecipitazione della proteina TDP 43 dai cervelli di individui affetti da SL, come descritto nel protocollo testuale, e scindere tre superfici MICA. Successivamente aggiungere 50 microlitri di TDP 43 da SL al primo MICA dopo un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare la MICA cinque volte con PBST 0,1%.

Successivamente, aggiungere 50 microlitri del fago raccolto dopo il panning negativo contro TDP 43 sano alla MICA e incubare per cinque minuti. Raccogliere i fagi non legati. È importante mantenere separati tutti i fagi raccolti in questi passaggi di panning.

Successivamente, raccogliere i fagi legati utilizzando tre metodi di eluizione. Per prima cosa, aggiungere 50 microlitri di tripsina in ciascuna MICA e incubare per non più di 10 minuti. Raccogliere la soluzione e conservarla.

Successivamente, aggiungere 50 microlitri di trietilammina 100 millimolare a ciascun MICA e incubare per non più di 10 minuti. Raccogliere la soluzione a un volume equivalente di tampone tris HCl 1 M, pH 7,4 e conservare. In terzo luogo, aggiungere 50 microlitri di TG one cells direttamente al MICA e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere inoltre i fagi raccolti dai primi due metodi di eluizione a 100 microlitri di TG one cells alla stessa concentrazione e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Successivamente, ripetere questo processo con una seconda mica. Prendere il fago non legato raccolto utilizzando la prima MICA con A LST DP 43 e aggiungerlo alla seconda MICA con A-A-L-S-T-D-P 43, incubare per cinque minuti. Combinare le cellule TG una infettate con i fagi, eluite con tripsina da ciascuna MICA A LST DP 43, e piastrarle su una piastra di agar luria con ampicillina o su una piastra LBA.

Ripetere lo stesso processo per la trietilammina e i fagi TG one ottenuti dai due set di A LS TDP 43 MICA, per un totale di tre piastre. Ripetere tutti i passaggi con una terza A LS mica, ma in questo caso utilizzare i fagi raccolti dopo due cicli di panatura negativa contro la demenza frontotemporale. Piastrare i fagi infettivi TG one su tre piastre LBA e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, conta il numero di colonie sulle sei piastre LBA con potenziali cloni a LS. Dovrebbe esserci un numero inferiore di colonie sulle tre piastre LBA provenienti dal terzo A LS MICA rispetto alle tre piastre LBA ottenute dopo due cicli di panning positivo utilizzando il fago dopo il panning negativo contro il TDP 43 sano. Produce fagi e frammenti solubili di dominio variabile a catena singola di anticorpo o s cvs da questi cloni e analizzali mediante diversi saggi immunoistochimici per verificare la specificità verso il tessuto a LS.

Un'analisi FM viene utilizzata per monitorare i passaggi di panatura negativa contro i vari target, al fine di garantire la rimozione di tutti i fagi reattivi. I risultati dell'analisi FM hanno mostrato un legame dei fagi dopo un ciclo di panatura negativa contro l'alfa-sinucleina aggregata e nessun legame dopo otto cicli. È stata eseguita una panatura negativa contro tessuto cerebrale umano sano per rimuovere i fagi che si legano ai numerosi antigeni presenti nell'omogenato di cervello umano sano.

Qui viene mostrato il legame del fago con tessuto sano dopo un ciclo di panning negativo e nessun legame di fago residuo dopo 10 cicli di panning negativo. Dopo aver preparato sia i fagi che la SCFE solubile da cloni potenziali, sono stati testati mediante ELISA indiretto per la specificità verso un tessuto LS. Quasi tutti i fagi hanno mostrato preferenza per il tessuto LS rispetto al tessuto sano.

Risultati simili sono ottenuti quando si confronta il legame del fago a un LS con tessuto di demenza frontotemporale o FTD. Il confronto del legame di SCFV a tessuto LS sia sano che FTD ha nuovamente mostrato un legame selettivo al tessuto LS in quasi tutti i cloni. Il saggio immunoistochimico su membrana è stato utilizzato per verificare ulteriormente il legame al tessuto LS e anche per determinare quali cloni siano reattivi in altre applicazioni immunologiche.

Qui viene mostrato un clone a legato a un tessuto LS. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come applicare un panning biop basato su FM per isolare reagenti contro malattie, specifici bersagli di interesse, reagenti che potrebbero fungere da potenziali strumenti diagnostici e/o terapeutici.