Novel microscopia a forza atomica Based biopanning per isolamento di Morfologia reagenti specifici contro TDP-43 varianti di Sclerosi Laterale Amiotrofica

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare reagenti morfologici specifici contro la proteina legante il DNA del catrame. 43 varianti presenti in un LS utilizzando una tecnologia di radiopanoramica basata su A FM a due fasi. Ciò si ottiene sottoponendo prima una libreria di fagi diversificata a più cicli di panning negativo contro antigeni fuori bersaglio utilizzando provette immunologiche.

Il panning negativo viene eseguito in sequenza contro l'albumina sierica bovina, l'alfa sinucleina aggregata e il tessuto cerebrale umano sano. Il secondo passo consiste nel completare una verifica FM dopo ogni serie di panning negativi per garantire la corretta rimozione di tutti i fagi indesiderati. In questo esempio di panning negativo, l'utilizzo di fagi aggregati di alfa sinucleina sono visibili dopo un round, ma sono assenti dopo il 10th round.

Successivamente, i restanti cicli di panning negativi vengono eseguiti su MICA a causa della disponibilità limitata di campioni. I fagi reattivi alla TDP 43 immunoprecipitata da demenza sana e frontotemporale o da tessuto FTD vengono rimossi in sequenza. Il passo finale consiste nell'isolare i fagi che si legano all'immuno LS precipitato.

La TDP 43 che utilizza fagi legati alla mica è allusa utilizzando tripsina, trietile, ammina e cellule TG one. In definitiva, la specificità di questi potenziali cloni di LS A viene verificata utilizzando FA Eliza indiretta e dot blot omogeneizzati A-L-S-F-T-D e tessuti cerebrali umani sani vengono immobilizzati in entrambi i saggi. Di solito viene rilevata una maggiore reattività a un tessuto LS rispetto agli altri gruppi testati.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al bio panning fagico convenzionale è l'uso di protocolli di panning negativi esaustivi, verificati da un FM, per garantire l'isolamento di reagenti che riconoscono selettivamente le varianti proteiche specifiche della malattia direttamente da campioni biologici complessi, anche quando presenti a basse concentrazioni. Sebbene un FM possa fornire informazioni sullo studio delle caratteristiche biomolecolari e delle interazioni, può anche essere applicato in altri sistemi, come il monitoraggio dei progressi del biopenning e la conferma della specificità dei singoli CLO. Inizia questa procedura con la produzione di fagi come descritto nel protocollo di testo per eseguire prima il panning negativo contro BSA, aggiungi quattro millilitri di un milligrammo per millilitro.

Soluzione di BSA in soluzione salina tamponata con fosfato o PBS in 12 provette immunitarie e incubare per una notte a quattro gradi Celsius. Quindi, combina le particelle di fagi da ciascuna delle tre librerie, mettendo da parte una piccola quantità di questa miscela di fagi per la futura verifica del processo di panning negativo. Quindi scartare la soluzione di BSA dalla prima provetta e lavare la provetta due o tre volte con PBS per rimuovere l'eventuale BSA non legato, aggiungere le librerie di fagi combinate a questa prima provetta, incubare per 30 minuti a temperatura ambiente sul rotatore prima di raccogliere i fagi non legati.

Tieni presente che è importante conservare una piccola quantità di fago dopo aver terminato i numerosi cicli di panning negativo contro ciascun bersaglio per verificare il successo del processo di panning e, in caso di contaminazione, ripetere ogni volta il processo di panning negativo con le provette rimanenti della soluzione BSA. Utilizzare il fago non legato raccolto dopo l'incubazione della provetta precedente. Quindi verificare la rimozione di tutti i leganti fagici BSA utilizzando la procedura A FM descritta nella sezione successiva del video.

Per visualizzare il legame dei fagi utilizzando un FM, aggiungere da 10 a 20 microlitri dell'antigene bersaglio alla mica scissa e incubare per 5-10 minuti. Lavare la MICA cinque volte con acqua, quindi aggiungere da 10 a 20 microlitri di fagi alla MICA e incubare per cinque-10 minuti. Lavare la mica altre cinque volte con acqua e lasciarla asciugare all'aria.

Eseguire il processo di imaging FM utilizzando una modalità di tapping FM con un nano scope three, un controller in aria a temperatura ambiente. Le sonde FM al silicio hanno una frequenza di risonanza di 300 kilohertz e una costante elastica di 40 newton per metro. Inserire la punta FM nel caricatore di punte.

Collegare il caricatore di punte al microscopio A FM. Posizionare il campione sotto il microscopio A FM. Utilizzare le manopole per allineare il laser sulla punta A FM.

Impostare la velocità di scansione su 3,05 hertz e la risoluzione di scansione su 512 campioni per linea. Sintonizza automaticamente la macchina per ottimizzare la vibrazione della silice. Frequenza della punta, avviare la scansione del campione.

La punta scansionerà la superficie del MICA misurando l'altezza del fago legato. I fagi sono le lunghe linee bianche che seguono il processo di acquisizione delle immagini mediante appiattimento di base dello sfondo per garantire che tutte le dimensioni delle particelle siano comparabili all'interno di ciascuna immagine. La larghezza del fago può variare da immagine a immagine a causa di altre dimensioni delle particelle e dell'area di scansione, ma non comprometterà mai l'accuratezza del legame o meno del fago con l'antigene.

L'immagine viene appiattita in un'immagine 2D e le regioni scarsamente visualizzate causate dalla contaminazione da PEG vengono evidenziate per la rimozione dall'analisi futura dei dati. L'immunoprecipitato sano della proteina TDP 43 dal tessuto cerebrale umano sano come descritto nel protocollo di testo a causa della minore quantità di proteina immunoprecipitata. Eseguire questi cicli di panning negativo utilizzando prima MICA Dividere otto superfici di MICA sulla prima MICA a circa 100 microlitri di proteina immunoprecipitata e incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente dopo l'incubazione.

Lavare la MICA cinque volte con soluzione salina tamponata con fosfato allo 0,1% con tween 20 abbreviato PBST. Quindi aggiungere circa 100 microlitri di fago dopo il panning negativo contro il tessuto cerebrale umano sano e incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente. A metà incubazione, aggiungere la proteina immunoprecipitata alla seconda mica.

Raccogliere il fago dalla prima MICA prima di lavare la MICA cinque volte con 0,1% di PBST. Dopo aver lavato la seconda mica, aggiungere il fago precedentemente raccolto. Ripetere l'intero processo fino a quando il fago non viene stroncato negativamente contro tutte e otto le amiche con la proteina immunoprecipitata.

Verificare il successo del processo di panning utilizzando il fago dopo il primo e otto cicli di panning negativo con un FM per iniziare a precipitare immuno la proteina TDP 43 dal cervello di individui con un LS come descritto nel protocollo di testo, tagliare tre superfici MICA. Quindi aggiungere 50 microlitri di A LS TDP 43 alla prima MICA dopo un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare la MICA cinque volte con 0,1% di PBST.

Successivamente, aggiungere 50 microlitri del fago raccolto dopo una panoramica negativa contro il sano TDP 43 al MICA e incubare per cinque minuti. Raccogli i fagi non legati. È importante tenere separati tutti i fagi raccolti in questi passaggi di panoramica.

Successivamente, raccogli i fagi legati usando tre metodi eluciani. Per prima cosa, aggiungere 50 microlitri di tripsina a ciascuna MICA e incubare per non più di 10 minuti. Raccogli la soluzione e salva.

Quindi, aggiungere 50 microlitri di trietilammina 100 millimolare a ciascuna MICA e incubare per non più di 10 minuti. Raccogliere la soluzione ad un volume uguale di un tampone tris HCL molare pH 7,4 e conservare il terzo, aggiungere 50 microlitri di cellule TG one direttamente alla MICA e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Inoltre, aggiungere i fagi raccolti dai primi due metodi eluciani a 100 microlitri di cellule TG one alla stessa concentrazione e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Quindi, ripeti questo processo con una seconda mica. Prendi il fago raccolto non legato usando la prima MICA con A LST DP 43 e aggiungilo alla seconda MICA con A-A-L-S-T-D-P 43 incuba per cinque minuti. Combinare le cellule TG one infettate con i fagi, alluse con tripsina da ciascuna A LST DP 43 MICA e piastra su tutta la piastra a coclea di luria burani con ampicillina o piastra LBA.

Ripetere lo stesso processo per i fagi trietilammina e TG uno alluso dai due set di A LS TDP 43 MICA per un totale di tre piastre. Ripetere tutti i passaggi con una terza mica A LS, tuttavia, in questo caso, utilizzare il fago raccolto dopo due cicli di panning negativo contro la demenza frontotemporale. T DP 43 piastra le cellule TG one infette su tre piastre LBA e incuba per una notte a 37 gradi Celsius.

Il giorno dopo. Conta il numero di colonie sulle sei piastre LBA con un potenziale clone di LS. Dovrebbero esserci meno colonie sulle tre piastre LBA della terza A LS MICA rispetto alle tre piastre LBA dopo i due cicli di panning positivo utilizzando il fago dopo il panning negativo contro il TDP sano 43 producono frammenti di anticorpi a dominio variabile a catena singola solubile o s cvs da questi cloni e analizzano utilizzando diversi saggi immunologici per verificare la specificità di un tessuto LS.

Un'imaging FM viene utilizzata per monitorare le fasi di panning negative rispetto ai vari bersagli per garantire che tutti i fagi reattivi vengano rimossi. I risultati di A FM hanno mostrato un legame fagico dopo un ciclo di panning negativo contro l'alfa sinucleina aggregata e nessun legame dopo otto cicli. Il panning negativo contro il tessuto cerebrale umano sano è stato eseguito per rimuovere il legame dei fagi con i molti antigeni presenti nell'omogenato cerebrale umano sano.

Qui viene mostrato il legame dei fagi al tessuto sano dopo un ciclo di panning negativo e nessun legame rimasto dai fagi dopo 10 round di panning negativo. Dopo aver preparato sia il fago che l'SCFE solubile da potenziali cloni, sono stati testati in Eliza indiretta per la specificità su un tessuto LS. Quasi tutti i fagi hanno mostrato una preferenza per un tessuto LS rispetto al tessuto sano.

Risultati simili si ottengono confrontando il legame dei fagi con una LS con la demenza frontotemporale o il tessuto FTD. Il confronto del legame di SCFV a un tessuto LS sia nel tessuto sano che in quello FTD ha mostrato ancora una volta un legame selettivo a un tessuto LS in quasi tutti i cloni. Il test immunologico dot blot è stato utilizzato per verificare ulteriormente il legame con un tessuto LS e anche per accertare quali cloni sono reattivi in altre applicazioni immunologiche.

Qui, viene mostrato il clone due che si lega a un tessuto LS. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare un biop panning basato su FM per isolare reagenti contro la malattia, target specifico di interessi, reagenti, che possono servire come potenziali strumenti diagnostici e/o terapeutici.