Name: Base-Probe Real-time PCR Approcci per la misurazione quantitativa dei microRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Impara tre metodi di PCR in tempo reale con sonde per quantificare i microRNA in plasma e siero. Questa tecnica consente di scoprire nuovi biomarcatori per malattie come tumori e diabete.

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Tutti gli autori riconoscono il supporto infrastrutturale del NHMRC CTC, Università di Sydney, la Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), l&#39;Australia e la Cooper Fondazione Rebecca, Australia. Questa ricerca è stata finanziata attraverso sovvenzioni dal Consiglio australiano Research (FT110100254) e la JDRF, Australia (CRN201314) per AAH WW, RJF e MVJ effettuato tutto bagnato laboratorio di sperimentazione, ASJ effettuata l&#39;analisi dei dati. WW ha scritto la prima bozza. AAH pianificato lo studio e analizzato i dati. Tutti gli autori hanno letto e hanno concordato la versione finale del manoscritto, figure e fogli di lavoro presentati per la pubblicazione.

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Articolo costi di trasformazione / pubblicazione sono stati coperti da Life Technologies, dopo l&#39;accettazione di questo manoscritto per la pubblicazione.

Le fasi critiche all&#39;interno dei protocolli qPCR sonda-based per ottenere risultati accurati e riproducibili sono per assicurarsi che 1) lo stesso volume e la concentrazione di RT-prodotto viene caricato in ogni reazione qPCR, 2) i rapporti ei volumi corretti dei componenti necessari per reazione qPCR sono preparati e ben mescolato, 3) i volumi corretti e coerenti vengono aggiunti ogni reazione qPCR, e 4) la preparazione e caricamento di ogni campione e reazione mix è completato nel più breve lasso di tempo possibile, mentre ancora memore di i punti critici di cui sopra in precedenza. Le schede matrice microfluidica bisogno adatto centrifuga e secchi specifici. Ogni secchio può contenere fino a 3 schede (caricato / vuoto). Verificare sempre che tutti e 3 gli slot di un secchio sono occupati e il secchio è bilanciato mettendo bucket simile (questo secchio dovrebbe contenere anche 3 carte, vuote o piene) nella fessura opposta della centrifuga. Pur ponendo la scheda nel buckeSupporto t, accertarsi che le 8 serbatoi proiettano verso l&#39;alto e pozzetti di reazione di fronte la parete esterna di centrifuga. Spin carte a 331 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. Dopo il primo giro, aprire la centrifuga e verificare visivamente la miscela di reazione è stato erogato attraverso i 384 pozzi. Ripetere il lancio a stesse impostazioni per 1 più tempo. Rimuovere la carta dal secchio e garantire che il livello della miscela di reazione in ciascuna delle 8 serbatoi è uniforme. Eventuali incoerenze nei volumi di liquido lasciato nei serbatoi rendono la scheda inappropriato utilizzare ulteriormente. Per avere la stessa concentrazione del RT-prodotto, stessa concentrazione di ingresso di RNA viene aggiunto in ciascuna reazione RT. La concentrazione di RNA totale viene misurata usando un micro-volumespectrophotometer. Il 260/280 rapporto osservato può essere a partire da 1.3 per l&#39;RNA isolato da plasma / siero; questo non sembra avere un effetto sul downstream processo qPCR correlati o dati generati 30. Analogamente, il rapporto di 260/280i campioni di RNA qui testati sono stati tra 1,3-1,7 senza effetti anomali nel qPCR osservati. Quando si utilizzano campioni a basso contenuto di RNA, come quelli di biofluidi, può essere difficile quantificare RNA prima dell&#39;elaborazione. Si consiglia l&#39;uso del sintetico spike-in presso l&#39;isolamento di RNA e le fasi di trascrizione inversa. Nella nostra esperienza, i candidati Arabidopsis thaliana miRNA (ATH-miR-159A e ath-miR-172 bis) è preferito su Caenorhabditis elegans miRNA (come CEL-miR-39 o cel-miR-54), che nella nostra esperienza può avere maggiore omologia di quelli A. thaliana. L&#39;uso di tale picco-in specifici per fase può spiegare la normalizzazione dei dati miRNA su più campioni analizzati in tempi diversi. Utilizzando un volume d&#39;ingresso fisso di RNA per reazione di sintesi cDNA è anche raccomandato 32,33. I tre protocolli sonda-based per miRNA quantificazione descritte richiedono quantità variabilidell&#39;ingresso RNA totale, diversi flussi di lavoro e costi. Ciascuno dei flussi di lavoro sono progettati per soddisfare diverse throughput in base al numero di bersagli miRNA e il numero di campioni da analizzare. Con l&#39;aumento della velocità (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), il costo per reazione diminuisce con un aumento della quantità di dati ottenuti in una unità di tempo. Poiché tutte queste piattaforme TaqMan utilizzano la chimica, la qualità dei dati ottenuti si può aspettare che sia simile. TaqMan qPCR è un metodo consolidato per identificare l&#39;abbondanza di miRNA in campioni di siero / plasma 9,11,27. Anche se i tre piattaforme discussi qui condividono la stessa chimica, una diminuzione del volume di reazione porta ad una diminuzione della gamma dinamica di rilevamento trascrizione (Farr RJ et al., Dati non pubblicati). La piattaforma qPCR 96-bene è un rendimento più basso, ma la piattaforma alta sensibilità e, a nostro avviso, il &quot;gold standard&quot; per tutti i probe-based (o la tintura a base) piattaforme PCR. Tuttavia, questo puònon essere la piattaforma più economico o efficiente se diverse centinaia o migliaia di campioni vengono analizzati e per più microRNA. Microfluidics (TLDA) e nanofluidica piattaforme (OA) sono piattaforme high-throughput / contenuti progettate per consentire l&#39;acquisizione di dati più grandi in un tempo più breve. Anche se le differenze lotti sono state osservate nelle carte TLDA, questo può essere minimizzato richiedendo carte TLDA dallo stesso lotto. Osserviamo che la piattaforma TLDA (Figura 3) ha mostrato variazioni significative nel 17% dei media - miRNA bassa abbondanza durante il test con lo stesso campione in diversi lotti di carte TLDA. Si consiglia pertanto di utilizzare gli stessi numeri di lotto per l&#39;analisi utilizzando carte TLDA. Questa variazione potrebbe anche essere dovuto alla variabilità tecnica, comprese eventuali potenziali errori di caricamento e di pipettamento. Tuttavia, si consiglia di ordinazione / richiesta dello stesso lotto di carte TLDA. Nessuna variazione lotto significativo è stato osservato sulla piattaforma OA. Nonostante questo, TaqMan speri baseTal qPCR avvicina offerta facilità di misurare l&#39;abbondanza di miRNA in campioni di plasma / siero. Gli approcci di throughput a bassa, media e alta discussi qui offrono la flessibilità necessaria per analizzare una serie di campioni e miRNA con un (a basso rumore di fondo) chimica altamente efficiente, riproducibile e pulita.

I microRNA (miRNA) sono ~ 22 nucleotidi non codificanti (nc) RNA, funzionante come regolatori dell&#39;espressione genica 1-3. La maggior parte dei miRNA negli animali funzionano attraverso specifiche-sequenza di basi accoppiamento con un mRNA, targeting 3 &#39;UTR, che porta a regolazione negativa dell&#39;espressione genica 2-4. Questo di solito avviene attraverso l&#39;inibizione della traduzione mRNA o ribosomiale drop-off. miRNA in circolazione hanno dimostrato di essere nuovi biomarcatori nella ricerca e campo clinico per una varietà di malattie, come il diabete 5-7, ovaie 8, 9 prostata e della mammella 10,11, l&#39;epatite B 12 e di altre malattie autoimmuni 13. La ricerca è stata condotta per identificare miRNA abbondanti in cellule o tessuti differenti, così come in circolazione dal plasma umano e campioni di siero, che è più accessibile e meno invasivo 9,11-15. Diversi metodi di quantificazione miRNA sono stati estituito utilizzando più piattaforme, come ad esempio la piattaforma piastra standard 96 pozzetti 4,12,16-18, la piattaforma di carta microfluidica 12,18-23 e la piattaforma nanofluidica matrice 17,24. Quantitativa real-time PCR (qPCR) offre la possibilità di misurare i numeri relativi o assoluti di trascrizioni con multipla (di coloranti o sonda-based) chimiche. Base-Probe real-time PCR chimica offre il vantaggio di sfondo bassa fluorescenza e alta sensibilità per rilevare una singola copia trascrizione. E &#39;relativamente conveniente, semplice da usare e altamente riproducibile, che lo rende un metodo preferito per quantificare e determinare miRNA 25. Metodo qPCR base-Probe prevede generalmente due fasi: trascrizione inversa (RT) e qPCR 4,26,27. RT è dove il primer stem-loop RT è ibridato ad una molecola di miRNA maturo o primario e convertito complementare (c) del DNA. La quantificazione del prodotto cDNA viene quindi effettuata utilizzando miRNA-specifici primer PCR26-28. Il principio di base di sonda qPCR è basato sul rilevamento di estensione filamento complementare in tempo reale, che comporta l&#39;idrolisi della sonda fluorescente-tag. Queste sonde sono progettate per contenere un reporter fluorescente e un quencher che sono solo parte per consentire FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Rilevamento delle emissioni dal giornalista di fluorescenza (emettitore) è mascherato dalla vicinanza della molecola quencher. Quando Taq polimerasi (pol) si estende dal primer monte e raggiunge una forcella (estremità 5 &#39;della sonda), la Taq attività esonucleasi pol idrolizza la sonda, portando ad una fisica di dissociazione / separazione dell&#39;emettitore fluorescente dal quencher. Questa versione di una singola molecola di fluorescenza emettitore è registrato dal rivelatore e presentato come un aumento incrementale nel segnale di fluorescenza da tale bene / reazione. L&#39;aumento della fluorescenza è proporzionale alla quantità di prodotto di PCR generato, permettendo una accurata quantification del 26,28 bersaglio amplificato. Con l&#39;aumento della domanda in miRNA quantificazione, medio tecnologie high-throughput sono stati sviluppati per consentire a un maggior numero di campioni da elaborare in un breve lasso di tempo. TaqMan Low Density Array (TLDA) è un mezzo throughput microfluidica disegno innovativo basato su sonda basata qPCR chimica offrendo un aumento del numero di miRNA analizzati su una piastra. TLDA comporta l&#39;uso di una piscina predefinito di RT-primers utilizzati per sintetizzare il cDNA. Questi cDNA vengono poi filata in una misura 384 carta e micro-fluidico per determinare l&#39;espressione di più miRNA utilizzando qPCR 22,26,29. Ogni pozzetto della card contiene asciugato primer e sonde per amplificare specifici miRNA (s), quindi fino a 384 reazioni possono essere trasformati in carta singola TLDA 26. L&#39;array nanofluidics è una piattaforma ad alta produttività che viene utilizzato per il rilevamento di trascritti genici <sup&gt; 24 utilizzando la stessa chimica probe-based. Si utilizza una matrice proprietaria offre interazioni idrofobiche-idrofilo per facilitare il caricamento della miscela di reazione 33 nanolitri in una matrice di 3072 fori passanti su uno scivolo 24 in acciaio inossidabile. Questo articolo si concentra su che dimostra come vengono eseguiti questi metodi per quantificare miRNA nel siero / plasma ed i fattori critici che devono essere considerati quando si esegue e interpretare tali dati. Preso di conto, i loro benefici individuali e limitazioni saranno discussi in questo articolo.

<table><tbody><tr><td>96 pozzetti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>piattaforma per la trascrizione</td><td></td><td></td><td></td>inversa</tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&nbsp;</td><td>Biosistemi applicati &nbsp;</td><td>4427975</td><td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 I test vengono forniti in una confezione di primer RT e primer PCR.</td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa TaqMan MicroRNA</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4366597 o 4366596</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 o http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 Il kit di trascrizione inversa TaqMan MicroRNA è lo stesso kit utilizzato per la trascrizione inversa in tutte le tre piattaforme TaqMan: piattaforma a 96 pozzetti, TLDA e OpenArray.</td></tr><tr><td>Per la qPCR eseguita su una piattaforma</td><td></td><td></td><td></td>a 96 pozzetti</tr><tr><td>, 2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, senza AmpErase UNG&nbsp;</td><td>Biosistemi applicati &nbsp;</td><td>4367846</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 Il 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix viene utilizzato per la qPCR on&nbsp; le due piattaforme TaqMan-piattaforma a 96 pozzetti e TLDA.</td></tr><tr><td>Pellicola adesiva ottica MicroAmp</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td></tr><tr><td>Piastra di reazione ottica rapida a 96 pozzetti, 0,1 ml&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td></tr><tr><td>Piattaforma di microfluidica (TLDA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Per la trascrizione</td><td></td><td></td><td></td>inversa</tr><tr><td>fare riferimento al kit del kit di trascrizione inversa TaqMan MicroRNA a 96 pozzetti (4366597 o 4366596) (come mostrato sopra).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer Megaplex RT, Human Pool A v2.1</td><td>Biosistemi applicati &nbsp;</td><td>4399966</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 Il Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 viene utilizzato per RT on&nbsp; le due piattaforme TaqMan: TLDA e OpenArray.</td></tr><tr><td>Primer Megaplex RT, Human Pool B v3.0</td><td>Biosistemi applicati &nbsp;</td><td>4444281</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 Il Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 viene utilizzato per RT su&nbsp; le due piattaforme TaqMan: TLDA e OpenArray.</td></tr><tr><td>O</td><td></td><td></td><td>O</td></tr><tr><td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4444750</td><td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 Il Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 viene utilizzato per RT on&nbsp; le due piattaforme TaqMan: TLDA e OpenArray.</td></tr><tr><td>Per la pre-amplificazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4391128 o 4488593</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 o http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 Il TaqMan PreAmp Master Mix viene utilizzato per la preamplificazione della qPCR on&nbsp; le due piattaforme TaqMan: TLDA e OpenArray.</td></tr><tr><td>Primer Megaplex PreAmp, Human Pool B v3.0&nbsp;</td><td>Biosistemi applicati &nbsp;</td><td>4444303</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 Il Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 viene utilizzato per la pre-amplificazione della qPCR on&nbsp; le due piattaforme TaqMan: TLDA e OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4399233</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 Il Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 viene utilizzato per la pre-amplificazione della qPCR on&nbsp; le due piattaforme TaqMan: TLDA e OpenArray.</td></tr><tr><td>1x tampone TE (100 ml)</td><td>Invitrogen</td><td>12090-015</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product Il tampone 1x TE viene utilizzato per la preamplificazione della qPCR le due piattaforme TaqMan: TLDA e OpenArray.</td></tr><tr><td>Per caricare ed eseguire la scheda</td><td></td><td></td><td></td>TLDA (Microfluidics) a 384 pozzetti</tr>, <tr><td>TaqMan Array, Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444913</td><td></td></tr><tr><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913 piattaforma Nanofluidics (OpenArray)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Per la trascrizione</td><td></td><td></td><td></td>inversa</tr><tr><td>fare riferimento al kit del kit di trascrizione inversa TaqMan MicroRNA a 96 pozzetti (4366597 o 4366596) (come mostrato sopra).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Per la preamplificazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fare riferimento ai reagenti di preamplificazione TLDA (come mostrato sopra)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Per caricare ed eseguire i vetrini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 pannello)</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4470187</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td></tr><tr><td>Kit di accessori QuantStudio 12K Flex OpenArray.</td><td>Biosistemi applicati &nbsp;</td><td>4469576</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td></tr><tr><td>Piastre campione OpenArray a 384 pozzetti&nbsp; &nbsp;</td><td>Biosistemi applicati &nbsp;</td><td>4406947</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td></tr><tr><td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4462159</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td></tr><tr><td>Suggerimenti per il sistema OpenArray AccuFill&nbsp</td><td>Biosistemi applicati &nbsp;</td><td>4457246</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td></tr><tr><td>altri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>acqua priva di nucleasi</td><td>Qiagen</td><td>129117</td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td></tr></tbody></table>

base-probe real-time pcr approcci per la misurazione quantitativa dei microrna

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Base-Probe PCR quantitativa (qPCR) è un metodo preferito per misurare trascrizione abbondanza, poiché è uno dei metodi di rilevamento più sensibili che fornisce un&#39;analisi accurata e riproducibile. Chimica a base-Probe offre lo sfondo minimo di fluorescenza rispetto ad altri (di tipo dye) chimiche. Attualmente, ci sono diverse piattaforme disponibili che la chimica a base di probe uso per quantificare trascrizione abbondanza. qPCR in una piastra ben 96 è il metodo più utilizzato di routine, ma solo un massimo di 96 campioni o miRNA può essere testato in un unico passaggio. Questo richiede tempo e noioso se un gran numero di campioni / miRNA sono da analizzare. High-throughput piattaforme sonda-based come microfluidica (es TaqMan carte Array) e gli array nanofluidica (es OpenArray) offrono facilità per rilevare riproducibile ed efficiente l&#39;abbondanza di più microRNA in un gran numero di campioni in breve tempo. Qui, dimostriamo il setup sperimentalend protocollo per miRNA quantificazione da siero o campioni di plasma EDTA, utilizzando la chimica probe-based e tre piattaforme differenti (96 pozzetti, microfluidica e array nanofluidica) offrono livelli crescenti di throughput.

Il volume consigliato per un saggio basato sonda miRNA reazione qPCR è di 20 ml. NOTA: Abbiamo confermato che un volume di reazione di 5 microlitri può produrre risultati simili a quelli ottenuti usando 20 ml di volume 4,7,30. Abbassando il volume di reazione di 5 microlitri consente una diminuzione del 75% dei costi dei reagenti senza perdita apprezzabile sensibilità. Come illustrato nella figura 2, volumi di reazione di 20 microlitri e 5 microlitri mostrano una forte co-relazione entro 39 cicli (con r 2 di 0,92, p = 0,0002). Matrice Microfluidics fornisce uno strumento per ottenere dati su 754 miRNA espressi in un campione di circa 5 ore (per la scheda A e Scheda B), che è un modo più efficiente di analizzare più campioni rispetto ai tradizionali 96 PCR pozzetti. Abbiamo confrontato miRNA carte di array microfluidica per lo stesso campione (campione A e campione A ripetizione) Figura 3A -. B mostra un grafico Bland-Altman (&lt;strong&gt; 3A) e Correlazione plot (3B) per tutti i 754 miRNA testati per questi campioni. Ci sono 3 differenti miRNA controllo (U6, RNU44 e RNU48) disposte casualmente su entrambe le schede (scheda A e B) in più posizioni. Quando i valori di soglia ciclo U6 (R) sono confrontati tra le 2 piste, non abbiamo osservato differenze significative tra i valori (Tabella 4). E &#39;anche importante notare qui che U6 è espresso in maggiore abbondanza (valore Ct inferiore) nel campione valutato. Abbiamo quindi confrontato tutti i miRNA che hanno valori Ct tra 0-19,99 in entrambe le corse (n = 150), che avevano simile espressione dei miRNA nel complesso con un coefficiente di determinazione del 98% (Figura 3C-D). Di tutti i 277 miRNA che hanno valori Ct tra 20 e 29.99 in entrambe le corse, 16 miR differivano significativamente tra l&#39;originale e la ripetizione piste (Figura 3E - F) Il numero di miRNA con differenza significativa betwee.n le corse sono aumentate (89 su 327) in cui sono stati selezionati i valori Ct tra 30-40 per entrambe le corse (Figura 3G - H). La piattaforma nanofluidics matrice fornisce dati per 754 miRNA da ciascun campione di siero / plasma testati, come rappresentato nella Figura 4A È importante esaminare queste curve di amplificazione -. Come è con tutto qPCR - garantire che il risultato è indicativo della vera amplificazione. Ognuna delle 48 sottoarray (figura 1), contiene anche un saggio per i tre più popolari &quot;pulizia&quot; ncRNAs:. U6, RNU44 e RNU48 figura 4B mostra un raggruppamento tipico di U6 replica da un unico campione. Queste repliche mostrano bassa deviazione standard (SD &lt;0,5) e quindi sono un indicatore di affidabilità. In alternativa, la figura 4C mostra la maggiore variabilità dei replicati U6 (SD&gt; 0,5) in un secondo campione. Questo non nega la validità of rimanenti saggi, sebbene non richiedere una critica più approfondita. U6, come con la maggior parte dei miRNA &quot;pulizia&quot; nei fluidi biologici, può avere una espressione variabile. Va notato che uno dei campioni, illustrate nella Figura 4C, visualizza 4 volte minore contenuto U6 quello illustrato nella figura 4B. Poiché il livello di U6 in campione presentato in 4C è del 75% inferiore a cominciare da quello presentato nel 4B pannello, maggiore variabilità tecnica è previsto a causa della distribuzione di Poisson di trascritti, aggravata dal piccolo volume di reazione 17. Un altro strumento utile è le immagini di controllo di qualità (QC), disponibili per l&#39;esportazione una volta che la corsa è stata completata. Una lista di questi utilizza la fluorescenza ROX, colorante passivo trovato nella miscela reagente qPCR, per confermare che ciascun foro passante è stato caricato correttamente (Figura 5). Un foro passante, o addirittura un en<html> pneumatici subarray, non può caricare a causa di volume del campione insufficiente, l&#39;evaporazione, bolle presenti nei pozzetti della piastra del campione 384-bene, la mancata rimuovere completamente il sigillo piatto del campione, o difetti nel sistema Accufill o dei suoi suggerimenti. Qualsiasi scaricati fori passanti devono essere identificati per evitare miRNA etichettatura come &quot;non rilevabile&quot;, quando in realtà il test è stato mai caricato. Se si verifica questo problema, verificare che almeno 5 ml di campione / mastermix viene caricato in ciascun pozzetto della piastra campione di 384 pozzetti, piatto del campione sia correttamente centrifugato prima del caricamento, il sigillo di alluminio è completamente rimosso, e il OpenArray caricata scivolo è sigillata ed eseguire entro il tempo previsto per tutte le esecuzioni successive. Se i problemi di carico persistono, questi possono essere più probabile di pertinenza di gruppo specifico o sacco di array o di consumo correlati e in seguito si debba sollecitare assistenza attraverso il produttore. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 52586 / 52586fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Layout di campioni per il flusso di lavoro Array Nanofluidics: (A) Ogni piatto del campione da 384 e può contenere i campioni per un massimo di 8 matrici nanofluidica. (B) diluito, pre-amplificato cDNA viene inserito in 8 pozzi (2 colonne di 4 righe), con Pool A e Pool B in gruppi da 8 e adiacenti. Ogni cerchio rappresenta un pozzetto. (C) Ciascun pozzetto della piastra campione verrà caricato in uno sottomatrice dell&#39;array nanofluidics. Ogni piccolo quadrato rappresenta una subarray. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> Figura 2: Analisi Co-relazione per convenzionali 96 pozzetti piattaforme PCR: Co-relazione tra 20 ml e 5 volumi di reazione microlitri di TaqMan Real-time qPCR utilizzando una piattaforma standard 96 pozzetti in valori CT (39 cicli). Abbiamo confrontato 4 microRNA differenti (miR-375, miR-30c, miR-30d e miR-7) in 4 diversi campioni di siero e plasma umano. Solo 11 punti dati vengono tracciati dal momento che le altre erano rilevabili. R 2 = 0,92, p = 0,0002. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . Figura 3: circolazione miRNA profiling utilizzando carte di microfluidica array utilizzando 2 schede microfluidica (carta-A e carta-B), viene generato un profilo di 754 miRNA (A - B). Come mostrato qui, abbiamo usato lo stesso campione per 2 array di microfluidica corre per verificare la riproducibilità dei risultati delle carte microfluidica. Abbiamo osservato una simile espressione dei miRNA nel complesso, con valori Ct tra 0-19,99 (C - D). Ci sono pochi miRNA (16 su 277), con valori Ct tra 20-29,99 e significative differenze tra piste di ripetizione (E - F). L&#39;ottanta nove di 327microRNA con valori Ct più alti (30-40) hanno mostrato differenze significative tra le due piste (G - H). &#160; I dati vengono analizzati utilizzando il test T abbinato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> Figura 4: Profilo Rappresentante di curve PCR prodotto di amplificazione: è una figura rappresentativa delle curve (A) di amplificazione combinati di tutti i bersagli miRNA per un campione di plasma umano. Un test per U6 (a comune controllo ncRNA) è posto in ogni subarray. Il campione in (B) dimostra bassa variabilità (SD &lt;0,5), mentre (C) mostra alta deviazione standard (SD&gt; 0.5) entro U6 replica. Entrambi i campioni sono total RNA isolato dal plasma umano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> Figura 5: Analisi QC di nanofluidica Array: controllo della qualità (QC) immagini di un nanofluidica matrice caricato correttamente (a sinistra) e un nanofluidica matrice erroneamente caricata (a destra). Il colorante passiva, ROX (presente nella miscela reagente qPCR), fluorescenza per indicare un corretto caricata foro passante. La matrice di destra ha diverse sottoarray / fori passanti che non sono caricati con la miscela dei reagenti qPCR e questi dovrebbero essere identificati come reazioni falsi negativi PCR. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componenti </td><td> Volume per 5 reazione microlitri (ml) </td></tr&gt; <tr><td> Tampone RT (10x) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> dNTP (100 mm) </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> RNase inibitore </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 1.39 </td></tr><tr><td> Trascrittasi inversa </td><td> 0,33 </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 2.33 </td></tr></tbody></table> Tabella 1A: RT componenti della miscela di reagente in 5 microlitri RT preparazione di reazione per TaqMan tempo reale qPCR utilizzando una piattaforma standard piastra a 96 pozzetti. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componenti </td><td> Volume per 5 reazione microlitri (ml) </td><td> Volume per 20 microlitri di reazione (ml) </td></tr><tr><td> Veloce Mastermix PCR (2x) </td><td> 2.5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> TaqMan qPCR assay (20x) * </td><td> 0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Senza Nucleaseacqua </td><td> 1.45 </td><td> 5.8 </td></tr><tr><td> Volume totale: </td><td> 4.2 </td><td> 16.8 </td></tr></tbody></table> * Componente saggio basato sulla miRNA selezionato testato. Tabella 1B: qPCR componenti della miscela di reagente in un 5 o 20 microlitri qPCR preparazione di reazione per TaqMan tempo reale qPCR utilizzando una piattaforma standard piastra a 96 pozzetti. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componenti </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primer (10x) </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> dNTP con dTTP (100 mm) </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> MultiScribe trascrittasi inversa (50 U / ml) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor &amp; #<html> 160; (20 U / ml) </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tabella 2A: RT componenti della miscela di reagente in 5 microlitri RT preparazione di reazione per pannello TLDA miRNA. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componenti </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex preamplificatore Primer (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> Tabella 2B: preamplificatore componenti della miscela di reagente in un preparato reazione 25 microlitri di pre-amplificazione per il pannello TLDA miRNA. &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Componenti </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primer (10x) </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> dNTP con dTTP (100 mm) </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> MultiScribe trascrittasi inversa (50 U / ml) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (20 U / ml) </td><td> 0.09 </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 0.35 </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tabella 3A: RT componenti della miscela di reagente in 5 microlitri RT preparazione di reazione per pannello nanofluidica miRNA probe-based. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex preamplificatore Primer (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> Tabella 3B:. Preamplificatore componenti della miscela di reagente in un preparato reazione 25 microlitri di pre-amplificazione per il pannello nanofluidica miRNA sonda-base NOTA: Il supplementare interattivo fogli di calcolo Excel previste per le tre piattaforme, rappresenta già l&#39;aggiunta del 5% per compensare pipettaggio errore. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Campione A </td><td> Campione A ripetizione </td></tr><tr><td> 15,535 </td><td> 16,156 </td></tr><tr><td> 15,471 </td><td> 15,652 </td></tr><tr><td> 15.623 </td><td> 16,063 </td></tr><tr><td> 15,963 </td><td> 15,889 </td></tr><tr><td> 14,006 </td><td> 13,993 </td></tr><tr><td> 14,502 </td><td> 14,623 </td></tr><tr><td> 14,907 </td><td> 14,384 </td></tr><tr><td> 13,732 </td><td> 14,946 </td></tr></tbody></table> Tabella 4: circolazione miRNA U6 profiling utilizzando microfluidica carta array. Utilizzando due carte di matrice microfluidica (A e B). Ct-valori di miRNA controllo U6 da Campione A (totale = 8). Controllo U6 coerente miRNA abbondanza osservata tra le piste.

MicroRNA circolanti sono recentemente emersi come biomarcatori promettenti e innovativi per vari tipi di cancro e di altre malattie. L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di discutere di tre diverse piattaforme di PCR real-time sonda-based e metodi che sono disponibili per quantificare e determinare l&#39;abbondanza dei microRNA circolanti.

Base-Probe Real-time PCR Approcci per la misurazione quantitativa dei microRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è dimostrare tre diversi metodi di PCR in tempo reale basati su sonda utilizzati per quantificare il micro RNA in campioni di plasma e siero. La PCR in tempo reale basata su sonda si ottiene mediante idrolisi e rilevamento della sonda con tag fluorescente, che contiene un reporter fluorescente e un quencher. Quando la polimerasi si estende dal primer a monte e raggiunge l'estremità quinta della sonda, porta a una dissociazione fisica dell'emettitore fluorescente dal quencher.Successivamente, viene rilasciata una singola molecola di fluoro quattro, che viene registrata dal rivelatore e presentata come un aumento incrementale del segnale fluorescente da quella reazione. In definitiva, la quantità di prodotto PCR generata può essere misurata in base all'aumento della fluorescenza, consentendo una quantificazione accurata dell'amplifi target amplificato. Questo metodo sta emergendo come un metodo promettente per scoprire nuovi biomarcatori per vari tipi di cancro e altre malattie come il diabete.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'abbondanza di microRNA nel siero e nel plasma, può essere applicato anche ad altri campioni come cellule e tessuti periferici. Una dimostrazione visiva di questo protocollo è fondamentale in quanto alcuni dei passaggi coinvolti nella sigillatura del vetrino dell'array nanofluidico possono essere difficili da apprendere semplicemente leggendo il protocollo Per la rilevazione quantitativa di micro RNA maturo PCR quantitativa basata su sonda a 4,2 microlitri delle singole miscele di reagenti QPCR in ciascun pozzetto di una piastra ottica a 96 pozzetti, seguito da 0,8 microlitri della soluzione di reazione CDNA appropriata appena preparata. Sigillare la piastra con l'apposito coperchio ottico e quindi avviare la QPCR sul sistema di PCR in tempo reale.Per preparare una scheda array microfluidica con uno a 1000 nanogrammi di RNA totale in ingresso prima scongelare il tampone dei primer del pool A e B, i fosfati desossinucleotidi, il cloruro di magnesio e l'inibitore degli RNA su ghiaccio. Quindi, per eseguire la trascrizione inversa, aliquotare 100 nanogrammi di ciascun campione di RNA in una provetta del pool A o del pool B, seguita dall'aggiunta del volume appropriato di acqua priva di nucleasi per portare il volume totale in ciascuna provetta a tre microlitri. Successivamente, aliquotare 4,5 microlitri della miscela di reagenti per trascrizione inversa appropriata nelle provette corrispondenti appropriate.Quindi posizionare i campioni nel termociclatore e avviare la trascrizione inversa. Mentre la trascrizione inversa sta progredendo. Per input di campioni di RNA totali compresi tra uno e 350 nanogrammi, scongelare il pool predefinito di primer di preamplificazione su ghiaccio quando i campioni sono pronti, aliquotare 22,5 microlitri del reagente del preamplificatore appropriato.Miscelare nelle provette del pool A e del pool B e aggiungere 2,5 microlitri del campione di CDNA trascritto inversamente in ciascuna. Quindi caricare i campioni nel termociclatore e avviare il ciclo di preamplificazione. Alla fine del ciclo, aggiungere 75 microlitri di tampone 0,1 x tris EDTA al CDNA preamplificato per caricare la scheda microfluidica.Successivamente, aggiungere 450 microlitri di miscela di reagenti QPCR a nove microlitri di CDNA amplificato PREPL diluito per la scheda A, utilizzare il prodotto amplificato PREPL preparato utilizzando il pool di primer A e aggiungere 441 microlitri di acqua priva di nucleasi fino a un volume finale di 900 microlitri. Quindi, una volta raggiunta la temperatura ambiente, rimuovere la scheda Tack Man Low Density Array dalla confezione e posizionarla con la carta stagnola rivolta verso il basso su un'area pulita. Aggiungere 100 microlitri di reazione PCR.Mescola in ciascuna delle otto porte di riempimento sulla scheda. Girare la carta per un minuto a 331 GS e temperatura ambiente. Quindi, con una corsa lenta, costante e uniforme, spingere il carrello attraverso la carta fino a raggiungere il punto finale della sigillatrice.Rimuovere la scheda array sigillata e tagliare i serbatoi. Quindi verificare che il coperchio riscaldato a blocchi e il supporto del campione corretti siano installati nel sistema di PCR in tempo reale dell'array microfluidico. Per caricare gli array nanofluidici, scongelare il prepl diluito, il CDNA amplificato e il reagente QPCR in tempo reale tack man.Mescolare e mescolare il flacone di reagente QPCR facendo roteare. Quindi, aggiungere 22,5 microlitri di miscela di reagenti QPCR a 22,5 microlitri di CDNA diluito e amplificato. Quindi aggiungere cinque microlitri di ciascun campione in otto pozzetti della piastra campione a 384 pozzetti del flusso di lavoro dell'array di nanofluidica, avendo cura di posizionare il pool A e il pool B di ciascun campione.Nei blocchi adiacenti di otto pozzetti, quando tutti i campioni sono stati trasferiti, coprire ogni sezione della piastra con pezzi di sigillante per piastre per campioni ad array aperto. Quindi scongelare il primo vetrino dell'array nanofluidico a temperatura ambiente dopo circa 15 minuti. Confermato che il coperchio di modifica del blocco e il supporto del campione corretti sono installati nel sistema di array nano fluidics, quindi allentare lo stantuffo della siringa del fluido di immersione tirando delicatamente.Rimuovere il tappo, posizionare la punta e sciacquare l'aria dalla punta. Quindi posizionare le punte del sistema di caricamento all'interno del sistema di caricamento. Aprire il coperchio e posizionare la piastra del campione nel sistema di caricamento.Ora indossa un paio di guanti aderenti. Aprire con cautela la confezione del vetrino e inclinare lentamente il vetrino fuori dalla confezione senza toccare la parte superiore. Posizionare il vetrino nel sistema di caricamento con il codice a barre a sinistra.Quindi rimuovere il sigillante dalla parte della piastra del campione destinata al caricamento e utilizzare il software del sistema di caricamento per inserire la posizione del codice a barre del cursore, la posizione del campione e la configurazione della punta. Durante il caricamento del vetrino, rimuovere la plastica trasparente e rossa dalla parte inferiore del coperchio del vetrino. Quindi rimuovere e sigillare con cura il vetrino entro 90 secondi dalla fine del processo di caricamento.Posizionare il vetrino all'interno della piastra clamp e il coperchio del vetrino sul vetrino per 30 secondi, verificando che il coperchio sia posizionato in modo che il codice a barre sia visualizzato correttamente. Quindi posizionare la siringa del fluido da immersione all'interno del vetrino in modo che la punta prema contro il coperchio e riempire lentamente il vetrino con il liquido da immersione, facendo attenzione che il fluido scorra lungo il coperchio. Una volta che il carrello è pieno, sigillarlo con il tappo, ruotando la vite fino a quando la maniglia non si rompe.Infine, rimuovere il coperchio di plastica sulla parte superiore del coperchio del vetrino e posizionare con cura il vetrino nel supporto del vetrino del sistema PCR in tempo reale. Fare attenzione a sostenere la parte inferiore della guida mentre viene abbassata senza toccare la parte superiore della guida. Quindi inizializzare il sistema PCR e avviare il programma di PCR quantitativa entro un'ora dal caricamento dei campioni.Utilizzando questa procedura, un volume di reazione di cinque microlitri può produrre risultati simili a quelli ottenuti utilizzando un volume di 20 microlitri con una forte correlazione. Fino a 39 cicli qui, vengono mostrati blandi grafici di Altman e di correlazione per tutti i 754 micro RN testati sullo stesso campione utilizzando schede array microfluidiche, poiché i microRNA appena dimostrati che hanno valori CT compresi tra zero e 19,99 in entrambi i percorsi mostrano anche espressioni simili con un coefficiente di determinazione del 98%Inoltre, il numero di microRNA con differenze significative osservate tra gli studi aumenta quando vengono selezionati valori CT compresi tra 30 e 40. In questo grafico, vengono mostrati i dati della piattaforma di array nano fluidics per tutti i 754 microRNA.È importante esaminare le curve di amplificazione per assicurarsi che i risultati siano indicativi di una vera amplificazione. Anche i microRNA domestici, come U six, dovrebbero essere esaminati per la variabilità. Ad esempio, in questo grafico, viene mostrato un tipico clustering di U sei repliche che mostrano una bassa deviazione standard che indica l'affidabilità dei dati.Infine, questi dati illustrano l'aumento della variabilità delle repliche di U sei in un secondo campione. Le tecnologie basate su sonde ad alta produttività, come la microfluidica e gli array fluidici Nana, offrono la facilità di rilevare in modo riproducibile ed efficiente l'abbondanza di più microRNA in un gran numero di campioni in un tempo molto breve. Ciascuno dei flussi di lavoro è progettato per soddisfare diverse produzioni in base al numero di bersagli di microRNA e al numero di campioni da analizzare.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire diverse tecniche di PCR in tempo reale basate su sonda per aumentare l'abbondanza di micro NA.

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