Base-Probe Real-time PCR Approcci per la misurazione quantitativa dei microRNA

L'obiettivo generale del seguente esperimento è dimostrare tre diversi metodi di PCR in tempo reale basati su sonda utilizzati per quantificare il micro RNA in campioni di plasma e siero. La PCR in tempo reale basata su sonda si ottiene mediante idrolisi e rilevamento della sonda con tag fluorescente, che contiene un reporter fluorescente e un quencher. Quando la polimerasi si estende dal primer a monte e raggiunge l'estremità quinta della sonda, porta a una dissociazione fisica dell'emettitore fluorescente dal quencher.

Successivamente, viene rilasciata una singola molecola di fluoro quattro, che viene registrata dal rivelatore e presentata come un aumento incrementale del segnale fluorescente da quella reazione. In definitiva, la quantità di prodotto PCR generata può essere misurata in base all'aumento della fluorescenza, consentendo una quantificazione accurata dell'amplifi target amplificato. Questo metodo sta emergendo come un metodo promettente per scoprire nuovi biomarcatori per vari tipi di cancro e altre malattie come il diabete.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'abbondanza di microRNA nel siero e nel plasma, può essere applicato anche ad altri campioni come cellule e tessuti periferici. Una dimostrazione visiva di questo protocollo è fondamentale in quanto alcuni dei passaggi coinvolti nella sigillatura del vetrino dell'array nanofluidico possono essere difficili da apprendere semplicemente leggendo il protocollo Per la rilevazione quantitativa di micro RNA maturo PCR quantitativa basata su sonda a 4,2 microlitri delle singole miscele di reagenti QPCR in ciascun pozzetto di una piastra ottica a 96 pozzetti, seguito da 0,8 microlitri della soluzione di reazione CDNA appropriata appena preparata. Sigillare la piastra con l'apposito coperchio ottico e quindi avviare la QPCR sul sistema di PCR in tempo reale.

Per preparare una scheda array microfluidica con uno a 1000 nanogrammi di RNA totale in ingresso prima scongelare il tampone dei primer del pool A e B, i fosfati desossinucleotidi, il cloruro di magnesio e l'inibitore degli RNA su ghiaccio. Quindi, per eseguire la trascrizione inversa, aliquotare 100 nanogrammi di ciascun campione di RNA in una provetta del pool A o del pool B, seguita dall'aggiunta del volume appropriato di acqua priva di nucleasi per portare il volume totale in ciascuna provetta a tre microlitri. Successivamente, aliquotare 4,5 microlitri della miscela di reagenti per trascrizione inversa appropriata nelle provette corrispondenti appropriate.

Quindi posizionare i campioni nel termociclatore e avviare la trascrizione inversa. Mentre la trascrizione inversa sta progredendo. Per input di campioni di RNA totali compresi tra uno e 350 nanogrammi, scongelare il pool predefinito di primer di preamplificazione su ghiaccio quando i campioni sono pronti, aliquotare 22,5 microlitri del reagente del preamplificatore appropriato.

Miscelare nelle provette del pool A e del pool B e aggiungere 2,5 microlitri del campione di CDNA trascritto inversamente in ciascuna. Quindi caricare i campioni nel termociclatore e avviare il ciclo di preamplificazione. Alla fine del ciclo, aggiungere 75 microlitri di tampone 0,1 x tris EDTA al CDNA preamplificato per caricare la scheda microfluidica.

Successivamente, aggiungere 450 microlitri di miscela di reagenti QPCR a nove microlitri di CDNA amplificato PREPL diluito per la scheda A, utilizzare il prodotto amplificato PREPL preparato utilizzando il pool di primer A e aggiungere 441 microlitri di acqua priva di nucleasi fino a un volume finale di 900 microlitri. Quindi, una volta raggiunta la temperatura ambiente, rimuovere la scheda Tack Man Low Density Array dalla confezione e posizionarla con la carta stagnola rivolta verso il basso su un'area pulita. Aggiungere 100 microlitri di reazione PCR.

Mescola in ciascuna delle otto porte di riempimento sulla scheda. Girare la carta per un minuto a 331 GS e temperatura ambiente. Quindi, con una corsa lenta, costante e uniforme, spingere il carrello attraverso la carta fino a raggiungere il punto finale della sigillatrice.

Rimuovere la scheda array sigillata e tagliare i serbatoi. Quindi verificare che il coperchio riscaldato a blocchi e il supporto del campione corretti siano installati nel sistema di PCR in tempo reale dell'array microfluidico. Per caricare gli array nanofluidici, scongelare il prepl diluito, il CDNA amplificato e il reagente QPCR in tempo reale tack man.

Mescolare e mescolare il flacone di reagente QPCR facendo roteare. Quindi, aggiungere 22,5 microlitri di miscela di reagenti QPCR a 22,5 microlitri di CDNA diluito e amplificato. Quindi aggiungere cinque microlitri di ciascun campione in otto pozzetti della piastra campione a 384 pozzetti del flusso di lavoro dell'array di nanofluidica, avendo cura di posizionare il pool A e il pool B di ciascun campione.

Nei blocchi adiacenti di otto pozzetti, quando tutti i campioni sono stati trasferiti, coprire ogni sezione della piastra con pezzi di sigillante per piastre per campioni ad array aperto. Quindi scongelare il primo vetrino dell'array nanofluidico a temperatura ambiente dopo circa 15 minuti. Confermato che il coperchio di modifica del blocco e il supporto del campione corretti sono installati nel sistema di array nano fluidics, quindi allentare lo stantuffo della siringa del fluido di immersione tirando delicatamente.

Rimuovere il tappo, posizionare la punta e sciacquare l'aria dalla punta. Quindi posizionare le punte del sistema di caricamento all'interno del sistema di caricamento. Aprire il coperchio e posizionare la piastra del campione nel sistema di caricamento.

Ora indossa un paio di guanti aderenti. Aprire con cautela la confezione del vetrino e inclinare lentamente il vetrino fuori dalla confezione senza toccare la parte superiore. Posizionare il vetrino nel sistema di caricamento con il codice a barre a sinistra.

Quindi rimuovere il sigillante dalla parte della piastra del campione destinata al caricamento e utilizzare il software del sistema di caricamento per inserire la posizione del codice a barre del cursore, la posizione del campione e la configurazione della punta. Durante il caricamento del vetrino, rimuovere la plastica trasparente e rossa dalla parte inferiore del coperchio del vetrino. Quindi rimuovere e sigillare con cura il vetrino entro 90 secondi dalla fine del processo di caricamento.

Posizionare il vetrino all'interno della piastra clamp e il coperchio del vetrino sul vetrino per 30 secondi, verificando che il coperchio sia posizionato in modo che il codice a barre sia visualizzato correttamente. Quindi posizionare la siringa del fluido da immersione all'interno del vetrino in modo che la punta prema contro il coperchio e riempire lentamente il vetrino con il liquido da immersione, facendo attenzione che il fluido scorra lungo il coperchio. Una volta che il carrello è pieno, sigillarlo con il tappo, ruotando la vite fino a quando la maniglia non si rompe.

Infine, rimuovere il coperchio di plastica sulla parte superiore del coperchio del vetrino e posizionare con cura il vetrino nel supporto del vetrino del sistema PCR in tempo reale. Fare attenzione a sostenere la parte inferiore della guida mentre viene abbassata senza toccare la parte superiore della guida. Quindi inizializzare il sistema PCR e avviare il programma di PCR quantitativa entro un'ora dal caricamento dei campioni.

Utilizzando questa procedura, un volume di reazione di cinque microlitri può produrre risultati simili a quelli ottenuti utilizzando un volume di 20 microlitri con una forte correlazione. Fino a 39 cicli qui, vengono mostrati blandi grafici di Altman e di correlazione per tutti i 754 micro RN testati sullo stesso campione utilizzando schede array microfluidiche, poiché i microRNA appena dimostrati che hanno valori CT compresi tra zero e 19,99 in entrambi i percorsi mostrano anche espressioni simili con un coefficiente di determinazione del 98%Inoltre, il numero di microRNA con differenze significative osservate tra gli studi aumenta quando vengono selezionati valori CT compresi tra 30 e 40. In questo grafico, vengono mostrati i dati della piattaforma di array nano fluidics per tutti i 754 microRNA.

È importante esaminare le curve di amplificazione per assicurarsi che i risultati siano indicativi di una vera amplificazione. Anche i microRNA domestici, come U six, dovrebbero essere esaminati per la variabilità. Ad esempio, in questo grafico, viene mostrato un tipico clustering di U sei repliche che mostrano una bassa deviazione standard che indica l'affidabilità dei dati.

Infine, questi dati illustrano l'aumento della variabilità delle repliche di U sei in un secondo campione. Le tecnologie basate su sonde ad alta produttività, come la microfluidica e gli array fluidici Nana, offrono la facilità di rilevare in modo riproducibile ed efficiente l'abbondanza di più microRNA in un gran numero di campioni in un tempo molto breve. Ciascuno dei flussi di lavoro è progettato per soddisfare diverse produzioni in base al numero di bersagli di microRNA e al numero di campioni da analizzare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire diverse tecniche di PCR in tempo reale basate su sonda per aumentare l'abbondanza di micro NA.