Imaging Ca

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare segnali di calcio indotti da stimoli luminosi nei fotorecettori dei coni nella retina del topo, utilizzando un biosensore fluorescente. Ciò si ottiene isolando la retina da una linea di topo transgenico che esprime un sensore di calcio codificato geneticamente esclusivamente nei fotorecettori dei coni. Il secondo passaggio consiste nel tagliare fette verticali del tessuto retinico.

Successivamente, le sezioni retiniche vengono montate sui coverslip e posizionate sotto un microscopio a due fotoni. L'ultimo passaggio consiste nel registrare i segnali del calcio provenienti dai singoli terminali sinaptici dei fotorecettori a cono in risposta alla stimolazione luminosa. Infine, i segnali del calcio registrati vengono analizzati in post-elaborazione.

Con questo metodo, possiamo registrare l'attività di molti recettori alimentari del mais simultaneamente e con risoluzione subcellulare. Questo rappresenta il principale vantaggio rispetto alle tecniche esistenti, come le registrazioni elettriche da singola cellula, che risultano più difficili e dispendiose in termini di tempo. La domanda che intendiamo affrontare è dunque se e in che modo il calcio sia coinvolto nella degenerazione dei fotoricettori.

Questo metodo ci permette di determinare se l'afflusso di calcio è la causa della degenerazione dei fotoricettori o se invece è una conseguenza del fatto che la cellula sta morendo. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontra difficoltà soprattutto perché la sensibilità alla luce della retina deve essere preservata settimanalmente, e pertanto tutte le fasi delicate, compresa la dissezione della retina e il taglio in fette, devono essere eseguite sotto luce rossa o verde. Per iniziare questa procedura, trasferire un bulbo oculare di topo in una piastra di Petri contenente una soluzione extracellulare appena carbonatata e ossigenata.

Bucare il bulbo oculare in un punto qualsiasi lungo il margine tra cornea e sclera con un ago da iniezione affilato. Successivamente, tenere l'occhio dalla sclera con una pinza e inserire delicatamente una lama delle forbici nel foro. Tagliare lungo la ora serrata per separare la parte anteriore dell'occhio dalla coppa oculare.

Successivamente, effettuare un taglio radiale nella coppa oculare in corrispondenza del segno a penna per indicare la posizione dorsale sulla retina. Quindi posizionare la coppa oculare in modo che il taglio dorsale sia orientato verso l'esterno. Afferrare la sclera ai lati sinistro e destro della coppa oculare inserendo le punte della pinzetta tra la retina e la sclera.

In seguito, staccare la retina invertendo delicatamente la parte sclerale dell'iica. Infine, recidere il nervo ottico per liberare la retina dalla sclera. Afferrare il bordo della retina con una pinzetta e rimuovere delicatamente detriti e corpo vitreo dalla superficie retinica utilizzando una seconda pinzetta.

Quando la superficie retinica è pulita, effettuare altre tre incisioni radiali più corte. Immergere ora lentamente un vetrino nell'apposita soluzione extracellulare vicino al tessuto. Tirare delicatamente la retina sul vetrino con il lato delle cellule gangliari rivolto verso l'alto, afferrando il bordo per ridurre al minimo i danni meccanici e le piegature del tessuto.

Successivamente, ritagliare un rettangolo di circa uno per due millimetri dalla regione retinica selezionata utilizzando una lama curva da bisturi, quindi rimuovere la soluzione in eccesso intorno al tessuto. Posizionare quindi la membrana in fibra di nitrocellulosa precedentemente preparata sulla porzione di retina, in modo che il lato contenente le cellule gangliari aderisca alla membrana. Aggiungere immediatamente una goccia di mezzo extracellulare sulla membrana per fissare saldamente il tessuto ad essa.

Trasferire il tessuto retinico montato su membrana alla camera per tagli contenente soluzione extracellulare fresca. Quindi tagliare la retina in sezioni verticali di spessore pari a 200 micrometri. Utilizzando una colla per tessuti, fissare un singolo taglio montato su membrana su un'ampolla di vetro precedentemente preparata con grasso da vuoto ad alto rendimento.

Mantenere la superficie di vetro al di sotto della retina e priva di grassi. Successivamente, aggiungere una goccia di soluzione extracellulare su ciascun vetrino con sezione montata nella camera di mantenimento a temperatura ambiente. Introdurre carbogeno nella camera attraverso la bollitura di una piccola riserva d'acqua e mantenere l'atmosfera nella camera di mantenimento umidificata.

Lasciare i preparati riposare nella camera di mantenimento per 10-15 minuti prima di trasferirli uno alla volta nella camera di registrazione. Trasferire un preparato dalla camera di mantenimento alla camera di registrazione e iniziare immediatamente a perfonderlo con una soluzione extracellulare gassata. Mantenere una portata di perfusione di due millilitri al minuto e una temperatura di 37 gradi Celsius.

Nella camera di registrazione. Utilizzare un obiettivo ad immersione in acqua 20 x 0,95 NA e una telecamera CCD in combinazione con un LED a infrarossi posizionato al di sotto della camera di registrazione. Per individuare la sezione retinica, avviare il sistema di imaging a due fotoni come indicato dal produttore.

Successivamente, accendere il laser e impostarlo a 860 nanometri. Accendere i due canali di rilevamento per l'immagine di fluorescenza di ECFP e citrina. Quindi, utilizzando il software di acquisizione delle immagini, controllare il microscopio a due fotoni per eseguire la scansione e selezionare una fila di terminali dei coni per la registrazione; impostare l'acquisizione delle immagini su immagini di 128 per 16 pixel o una configurazione simile, limitando l'area scansionata ai terminali dei coni per evitare il fotoblecamento dei pigmenti fotosensibili nei segmenti esterni.

Accendere il laser. Lasciare adattare i coni al laser di scansione e alla luce di fondo dello stimolo per 20-30 secondi prima di presentare stimoli luminosi o applicare agenti farmacologici. Iniziare ora la presentazione degli stimoli arbitrari.

Gli stimoli vengono generati modulando nel tempo l'intensità dei due LED, utilizzando una scheda microprocessore controllata da un software personalizzato. Successivamente, avviare la registrazione simultanea dei due canali di fluorescenza mediante il rispettivo software di acquisizione delle immagini. Le registrazioni erano focalizzate sui terminali sinaptici dei fotoricettori a cono nelle sezioni di retina.

Questo è un esempio di una regione registrata con sette terminali individuali. La fluorescenza è stata registrata utilizzando due canali, uno per il citrina libera dello scepter e uno per il donatore FRET ECFP. Qui vengono mostrati i cambiamenti indotti dalla luce nella fluorescenza della citrina e dell'ECFP registrati in una singola regione di interesse.

Ecco le risposte al calcio di un terminale di cono a una serie di lampi di luce intensa di un secondo a intervalli di cinque secondi. Questa figura mostra l'analisi quantitativa esemplificativa delle risposte al calcio nei coni indotte dalla luce. E qui sono riportate le risposte al calcio indotte dalla luce da un singolo terminale di cono.

Questa figura mostra la determinazione della risposta media al calcio. Il livello di calcio a riposo rappresenta la linea di base precedente alla stimolazione luminosa e l'ampiezza della risposta è ra, ovvero l'area compresa tra il livello di calcio a riposo e l'ampiezza del picco, nonché tra la cinetica dell'insorgenza e della cessazione della risposta. Questa procedura può essere ulteriormente estesa.

Ad esempio, i segnali di calcio nei fotorecettori possono essere misurati in condizioni diverse di stimolazione farmacologica e intensa per indagare, ad esempio, l'adattamento o studiare in dettaglio le diverse fasi della trasduzione luminosa. Questa tecnica consente di analizzare la dinamica del calcio nei fotorecettori coni sotto condizioni fisiologiche normali. Ciò risulta particolarmente rilevante per comprendere la degenerazione primaria e secondaria dei fotorecettori coni in malattie umane che causano cecità, come l'acro topia o la retinite pigmentosa.