Visualizzazione Streptococcus pneumoniae Entro cardiache microlesioni e successive rimodellamento cardiaco

L'obiettivo generale del seguente esperimento è dimostrare un protocollo riproducibile per la formazione di microlesioni cardiache ESMO all'interno del cuore di topi infetti. Ciò si ottiene infettando i topi con ESMO e consentendo lo sviluppo della batteriemia, dando così ai batteri l'accesso al sistema vascolare cardiaco dove possono invadere il miocardio e formare lesioni microscopiche. Quindi i cuori vengono decora, incorporati e colorati in modo convenzionale o fissati in un composto OCT per la colorazione immunofluorescente.

La valutazione delle sezioni colorate può mostrare microlesioni cardiache distribuite in modo casuale attraverso le deposizioni di collagene del miocardio e le sezioni cardiache convalescenti e le capsule pneumococciche all'interno della microlesione cardiaca Dimostrazione della procedura. Armand Brown è uno studente laureato nel mio laboratorio? Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sugli effetti dannosi cardiaci della polmonite S durante la malattia pneumococcica invasiva nei topi.

Può anche essere applicato a campioni cardiaci provenienti da altri sistemi, come primati non umani o esseri umani. Inizia con la crescita del sierotipo ESMO quattro ceppo Tiger four in brodo Todd Hewitt fino a una densità ottica di 0,5 a 620 nanometri. Quando ha la densità corretta, pellettare la coltura a 3, 500 G per 10 minuti.

Quindi rimuovere il surnatante utilizzando una linea a vuoto e risospendere i batteri con PBS sterile a 10.000 unità formanti colonie per millilitro. Ora topi anestetizzati con valvola C di 10-12 settimane e confermano il loro stato anestetizzato con un leggero pizzicotto del dito del piede da un paio di pinzette smussate, siringa di loto con la sospensione batterica e collegare un ago da 27 a 30 gauge. Quindi afferrare un topo anestetizzato per la collottola con una mano mentre si iniettano intraperitonealmente 100 microlitri di sospensione con l'altra mano, riposizionare ogni topo nella sua gabbia.

I topi in genere si svegliano da 30 a 40 secondi dopo l'iniezione. Ottenere la dose corretta di polmonite S è fondamentale, oppure i topi possono riprendersi dall'infezione o arrivano alla malattia pneumococcica invasiva troppo rapidamente per lo sviluppo delle lesioni. Poiché ogni ceppo batterico ha diversi livelli di lente dell'orecchio, potrebbero essere necessari tentativi ed errori per identificare la dose corretta.

Lasciare che l'infezione proceda per almeno 24 ore fino a uno stadio iniziale o fino a 30 ore per un'infezione in stadio avanzato. Successivamente sopprimere ogni topo infetto. Per prima cosa, prelevare un campione di sangue, disinfettare la coda con un tampone imbevuto di alcol e tagliare una sezione di due o tre millimetri.

Raccogli due microlitri di sangue dal sito di taglio. Diluire in serie il sangue dieci volte in PBS contenente eparina sodica a un'unità per millilitro. Piastra cinque livelli di diluizioni su piastre di agar sangue di soia a trittico e incubale durante la notte.

Il giorno successivo fai il conteggio delle colonie. Procedere con la raccolta del cuore come descritto nella sezione successiva. In alternativa, 30 ore dopo l'infezione.

Tentare di salvare il topo somministrando ampicillina interperitoneale in 100 microlitri di soluzione fisiologica. Continua a fornire ampicillina ogni 12 ore per 36 ore e raccogli i cuori nei punti temporali desiderati. Per prima cosa, raccogli il cuore.

Immobilizzare il topo soppresso in posizione supina su una piattaforma chirurgica, spruzzare il torace con etanolo al 70% e asciugarlo. Usando forbici chirurgiche e pinze, aprire la cavità toracica. Rimuovere la gabbia toracica e sezionare il diaframma per esporre il cuore e i polmoni.

Quindi tagliare i vasi sanguigni collegati al cuore e utilizzare una pinza per asportare delicatamente il cuore senza lividi. Sciacquare il cuore con PBS e inserirlo in una cassetta per la raccolta di campioni di tessuto per la sezione coronale. Quindi trasferire le cassette in una soluzione di formalina tamponata al 10% e, il giorno successivo, inviare per l'inclusione di paraffina.

Nelle fasi iniziali, le lesioni cardiache possono essere identificate dal loro cambiamento di colore, aspetto e, in alcuni casi, dalla presenza di cellule immunitarie. Nelle lesioni avanzate, le cellule immunitarie saranno assenti e di grandi dimensioni. Al loro posto si trovano lesioni simili a VA.

Utilizzando una sezione cardiaca da cinque micron su vetrini caricati positivamente, prima congelare le sezioni, quindi scongelarle e lasciarle asciugare all'aria. Fissare i vetrini in formina tamponata neutra al 10% per 10 minuti a 25 gradi Celsius. Quindi rimuovere il fissativo con tre lavaggi e PBS per cinque minuti per lavaggio.

Seguire permeabile il tessuto con tritton X 100 allo 0,2% in PBS per 15 minuti. Rimuovere il detersivo con altri tre lavaggi in PBS dritto. Quindi bloccare il tessuto con il 10% di siero di rivestimento in PBS per un'ora dopo un risciacquo in PBS, coprire la sezione con antisiero per due ore a 37 gradi Celsius.

Trattare i controlli negativi con un antisiero di coniglio naïve Poiché il tessuto cardiaco assorbe facilmente la colorazione immunofluorescente XI portando a livelli di fondo elevati, la concentrazione nel tempo di incubazione per diversi tipi di anticorpi dovrà probabilmente essere ottimizzata Due ore dopo, lavare via il siero antis con PBS. Quindi sostituire la soluzione con un anticorpo secondario e lasciare incubare i vetrini a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Ora applica DPI a cinque milligrammi per millilitro e lava i vetrini con PBS.

Infine, montare i vetrini a pavimento, salvarli e visualizzarli con la microscopia confocale. Inizia rimuovendo la paraffina e idratando le sezioni di tessuto. Utilizzare lavaggi allo xilene seguiti da una serie graduale di lavaggi con alcol.

Quindi bagnare le sezioni in acido fosfometico allo 0,2% per cinque minuti, seguito da un risciacquo con acqua per cinque minuti con la macchia successiva con lo 0,1% di rosso grave e acido ric per due ore. Quindi lavare le sezioni in acido cloridrico normale 0,01 per tre minuti e sciacquarle in etanolo al 70% per un minuto. Ora disidratare le sezioni invertendo la serie di bagni alcolici graduati, seguiti da lavaggi con xilene utilizzando il supporto per microscopia ottica e valutare i vetrini.

I topi hanno sviluppato una malattia pneumococcica invasiva a seguito di una sfida con la tigre. Sono state osservate quattro microlesioni cardiache nei ventricoli e un aumento delle dimensioni e del numero delle lesioni è stato osservato tra 24 e 30 ore dopo l'infezione per verificare che la polmonite fosse effettivamente all'interno delle lesioni. Le sezioni sono state colorate per il polisaccaride capsulare del sierotipo quattro prodotto dal Tiger four.

Ciò ha confermato la presenza di aggregati strettamente impacchettati e densi all'interno dei siti di microlesione. La colorazione rossa Piro è stata eseguita su sezioni cardiache di topi che erano stati salvati con ampicillina e controlli non infetti. Nei salvataggi.

C'è stato un drammatico aumento della presenza e dell'intensità della macchia con bande che fluivano da quelli che sembrano essere ex siti di lesione nei ventricoli. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di infettare i topi con sufficiente dose di polmonite S per consentire all'infezione di procedere per almeno 28-30 ore in modo che la batteriemia e le microlesioni cardiache abbiano abbastanza tempo per formarsi.