Visualizzazione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è dimostrare un protocollo riproducibile per la formazione di microlesioni cardiache da ESMO all'interno del cuore di topi infettati. Questo risultato si ottiene infettando i topi con ESMO e permettendo lo sviluppo di una batteriemia, consentendo così ai batteri l'accesso alla vascolarizzazione cardiaca, dove possono invadere il miocardio e formare lesioni microscopiche. Successivamente, i cuori vengono inclusi in paraffina e colorati con metodiche convenzionali oppure fissati in composto OCT per la colorazione immunofluorescente.

La valutazione delle sezioni colorate può mostrare microlesioni cardiache distribuite in modo casuale nel miocardio, depositi di collagene e sezioni di miocardio in fase di convalescenza, nonché capsule pneumococciche all'interno delle microlesioni cardiache. Questo dimostra la procedura. Armand Brown è uno studente laureando nel mio laboratorio? Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sugli effetti dannosi a livello cardiaco di S. pneumoniae durante la malattia pneumococcica invasiva nei topi.

Si può applicare anche a campioni cardiaci provenienti da altri sistemi, come primati non umani o esseri umani. Iniziare coltivando il ceppo di Sierotipo quattro ESMO Tiger quattro in brodo Todd Hewitt fino a una densità ottica di 0,5 a 620 nanometri. Quando si raggiunge la densità corretta, centrifugare la coltura a 3.500 G per 10 minuti.

Quindi rimuovere il soprannatante utilizzando una linea a vuoto e risospendere i batteri in PBS sterile a 10.000 unità formanti colonie per millilitro. Anestetizzare ora i topi valve C di 10-12 settimane e confermare lo stato di anestesia con una leggera pressione sul dito del piede esercitata con una pinzetta ottusa, riempire una siringa con la sospensione batterica e applicare un ago da 27 a 30 gauge. Successivamente, afferrare un topo anestetizzato per la nuca con una mano e somministrare per via intraperitoneale 100 microlitri di sospensione con l'altra mano, quindi rimettere ogni topo nella propria gabbia.

I topi si risvegliano tipicamente da 30 a 40 secondi dopo l'iniezione. È fondamentale calibrare correttamente la dose di S pneumoniae, altrimenti i topi potrebbero riprendersi dall'infezione o sviluppare una malattia pneumococcica invasiva troppo rapidamente, impedendo la formazione di lesioni. Poiché ogni ceppo batterico presenta diversi livelli di virulenza otica, potrebbe essere necessario procedere per tentativi ed errori per identificare la dose corretta.

Lasciare procedere l'infezione per almeno 24 ore fino a uno stadio iniziale o per 30 ore per uno stadio avanzato. Successivamente, eutanasia ogni topo infetto. Prelevare prima un campione di sangue, disinfettare la coda con un batuffolo di alcol e asportare una sezione lunga due o tre millimetri.

Prelevare due microlitri di sangue dal sito dell'incisione. Diluire in modo seriale il sangue di dieci volte in PBS contenente eparina sodica a un'unità per millilitro. Seminare cinque livelli di diluizione su piastre di agar sangue soia triptica e incubare durante la notte.

Il giorno successivo effettuare il conteggio delle colonie. Procedere con il prelievo del cuore come descritto nella sezione successiva. In alternativa, 30 ore dopo l'infezione.

Cercare di salvare il topo somministrando ampicillina per via intraperitoneale in 100 microlitri di soluzione salina. Continuare a somministrare ampicillina ogni 12 ore per un totale di 36 ore e raccogliere i cuori nei diversi tempi desiderati. Per prima cosa, isolare il cuore.

Fissare il topo eutanasizzato in posizione supina su un piano chirurgico e spruzzare la zona toracica con etanolo al 70%, quindi asciugare tamponando. Utilizzando forbici e pinze chirurgiche, aprire la cavità toracica. Rimuovere la gabbia toracica e sezionare il diaframma per esporre cuore e polmoni.

Quindi recidere i vasi sanguigni collegati al cuore e utilizzare pinze per escindere delicatamente il cuore senza provocare contusioni. Sciacquare il cuore con PBS e collocarlo in una cassetta per campioni di tessuto destinata a sezioni coronali. Trasferire quindi le cassette in una soluzione di formalina tamponata al 10%; il giorno successivo, inviare per inclusione in paraffina.

In stadi precoci, le lesioni cardiache possono essere identificate per il cambiamento nell'aspetto del colore e, in alcuni casi, per la presenza di cellule immunitarie. In lesioni avanzate, le cellule immunitarie saranno assenti e saranno presenti ampie lesioni di tipo VA.

Utilizzando una sezione cardiaca di cinque micron su vetrini in vetro con carica positiva, congelare prima le sezioni, quindi scongelarle e lasciarle asciugare all'aria. Fissare i vetrini in formalina al 10% tampone neutro per 10 minuti a 25 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere il fissativo con tre lavaggi in PBS per cinque minuti ciascuno.

Permeabilizzare il tessuto con Triton X-100 al 0,2% in PBS per 15 minuti. Rimuovere il detergente con altri tre lavaggi in PBS. Quindi bloccare il tessuto con siero di bovino al 10% in PBS per un'ora, dopo un risciacquo in PBS, quindi coprire la sezione con antisiero per due ore a 37 gradi Celsius.

Trattare i controlli negativi con siero antirabbia naïve. Poiché il tessuto cardiaco assorbe facilmente la colorazione immunofluorescente XI, determinando livelli di fondo elevati, sarà probabilmente necessario ottimizzare la concentrazione e il tempo di incubazione per diversi tipi di anticorpi. Due ore dopo, lavare via il siero antiserico con PBS. Quindi sostituire la soluzione con un anticorpo secondario e lasciare incubare i vetrini a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Applicare ora il DPI a cinque milligrammi per millilitro e lavare i vetrini con PBS.

Infine, montare i vetrini in balsamo, conservarli e acquisirne le immagini mediante microscopia confocale. Iniziare rimuovendo la paraffina e idratando le sezioni di tessuto. Utilizzare lavaggi con xilene seguiti da una serie progressiva di lavaggi con alcol.

Quindi immergere le sezioni in acido fosfomolibdico allo 0,2% per cinque minuti, seguito da un risciacquo in acqua per cinque minuti; successivamente colorare con rosso serio allo 0,1% in acido ricinoico per due ore. Lavare quindi le sezioni in acido cloridrico 0,01 N per tre minuti e risciacquare in etanolo al 70% per un minuto. A questo punto disidratare le sezioni invertendo la serie di bagni alcolici a gradazione decrescente, seguita da lavaggi in xilene, montare per microscopia ottica e valutare le preparazioni.

I topi hanno sviluppato una malattia pneumococcica invasiva in seguito a una sfida con il tiger. Sono state osservate lesioni microcardiache del quattro ceppi nei ventricoli, e un aumento della dimensione e del numero delle lesioni è stato rilevato tra le 24 e le 30 ore dal contagio, per verificare che effettivamente gli S. pneumoniae fossero presenti all'interno delle lesioni. Le sezioni sono state colorate per individuare il polisaccaride capsulare del sierotipo quattro prodotto dal Tiger quattro.

Ciò ha confermato la presenza di aggregati densi e strettamente compatti all'interno dei siti di microlesione. È stata eseguita una colorazione con rosso pirogallolo sulle sezioni cardiache di topi trattati con ampicillina e su controlli non infetti. Nei trattamenti di salvataggio.

Si è verificato un aumento significativo della presenza e dell'intensità della colorazione, con bande che si irradiano da quelle che sembrano essere sedi di lesioni pregresse nei ventricoli. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di infettare i topi con un'adeguata quantità di S. pneumoniae, in modo che l'infezione possa proseguire per almeno 28-30 ore, consentendo sufficiente tempo per la formazione di batteriemia e microlesioni cardiache.