Tumore primario e isolamento delle cellule MEF per studiare Lung Metastasi

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare l'agenesi tumorale del cancro al seno nei topi. Innanzitutto, viene illustrata la preparazione di cellule primarie da tumori mammari murini. Successivamente, viene presentato come estrarre il polmone del topo per visualizzare le metastasi polmonari.

Infine, viene mostrata la preparazione di fibroblasti embrionali di topo a partire da embrioni di topo, poiché questi metodi dimostrano che i topi transgenici per l'antigene T medio del polioma del virus del tumore mammario del topo possono essere utilizzati per studiare la tumorigenesi del cancro al seno. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul carcinoma mammario, può essere applicato anche allo studio di altri tumori solidi. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché è importante isolare esclusivamente il tessuto tumorale e non altri tessuti durante i passaggi di dissezione del tumore. Iniziare utilizzando le forbici per aprire la pelle dall'orifizio uretrale fino al collo di un topo transgenico per l'antigene T medio del polioma del virus del tumore mammario del topo.

Quindi fissare la pelle e isolare il tumore mammario. Lavare il tumore in situ con PBS freddo e collocare il tumore in una piastra sterile per colture cellulari da 10 centimetri. Successivamente, trasferire la piastra in una cappa a flusso laminare sterile e utilizzare una lametta sterile e delle forbici per tagliare il tumore in pezzi di un millimetro cubo.

Incubare i frammenti con la collagenasi su un agitatore a 37 gradi Celsius. Dopo due ore, centrifugare la sospensione di tessuto tumorale ottenuta. Lavare il pellet altre tre volte in PBS Resus, sospendendo il pellet in due millilitri di tripsina EDTA dopo l'ultimo lavaggio per cinque minuti a 37 gradi Celsius con agitazione.

Quindi lavare le cellule altre tre volte e risospendere in mezzo di crescita normale. Infine, incubare le cellule in una piastra da coltura tissutale da 10 centimetri, cambiando il mezzo ogni giorno per i prossimi tre giorni fino a raggiungere il numero desiderato di cellule. Prima di estrarre il polmone, rimuovere il fegato e il diaframma e staccare le costole.

Quindi aprire la parte superiore della trachea, vicino alla vena giugulare, e utilizzare un catetere per iniettare l'agente appropriato attraverso la trachea al fine di riempire i polmoni, rimuovere i polmoni e, se si utilizza Z fix, includere il tessuto in paraffina. Se si utilizza l'inchiostro di India, trattenere il tessuto nella soluzione inec per cinque minuti; il tessuto polmonare normale apparirà di colore nero, mentre i noduli tumorali risulteranno bianchi. Classificare come metastasi tutti i noduli tumorali visualizzati in sedi secondarie con un diametro maggiore o uguale a 0,5 millimetri al fine di generare fibroblasti embrionali murini.

Per prima cosa, aprire la pelle di un topo gravido dalla porzione uretrale fino al collo, come appena dimostrato, avendo cura di non disturbare gli embrioni. Successivamente, rimuovere le corna uterine e risciacquarle in PBS sterile. Quindi, separare con attenzione gli embrioni dalla placenta, uno alla volta.

Posizionare ogni embrione in una piastra di coltura da 10 centimetri contenente PBS freddo su ghiaccio. Dopo aver rimosso la testa, il fegato e l'intestino, risciacquare la porzione rimanente dell'embrione in un pozzetto di una piastra per colture cellulari a 12 pozzetti contenente PBS, quindi tagliare il corpo in pezzi di un millimetro cubo. Trasferire in un altro pozzetto contenente cinque millilitri di tripsina-EDTA e incubare il tessuto a 37 gradi Celsius.

Dopo cinque minuti, aggiungere un millilitro di FBS per inattivare la digestione. Quindi centrifugare la sospensione cellulare ottenuta e risospendere il pellet in un millilitro di DMEM tiepido. Infine, trasferire le cellule in una piastra da coltura da 10 centimetri contenente 10 millilitri di DMEM integrato con antibiotici e coltivare le cellule fino al raggiungimento del numero cellulare desiderato.

La fase della progressione del tumore in cui sacrificare l'animale dipende dallo studio specifico e dalle linee guida del comitato I-A-C-U-C. Ad esempio, questo topo FVB di 100 giorni con il virus del tumore mammario murino polioma antigene medio T è stato sacrificato a tre mesi dall'isolamento di un tumore, come appena dimostrato nel topo femmina. Sono state ottenute cellule tumorali primarie.

Poiché molti geni regolano la metastasi del cancro al seno nei polmoni, anche i polmoni sono stati prelevati come appena illustrato per studiare il processo metastatico. I polmoni sono stati quindi gonfiati con Z fix e colorati con inchiostro di India per visualizzare le nodularità tumorali. Qui vengono mostrati fibroblasti embrionali di topo, isolati da embrioni di topo della linea FVB.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona conoscenza di come isolare cellule tumorali primarie da topo e fibroblasti embrionali di topo, nonché di come estrarre il polmone del topo. Non dimenticare che lavorare con il fluoro ISO può essere estremamente pericoloso, quindi è fondamentale adottare precauzioni adeguate, come lavorare sempre sotto cappa chimica F durante l'esecuzione di questa procedura.