Maggiore analisi genetica di singole bioparticelle umani recuperati da semplificato Micromanipolazione da Forensic Evidence 'tocco DNA'

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di recuperare cellule singole o agglomerate denominate bioparticelle putative da prove forensi del DNA tattile e ottenere un profilo del DNA del donatore. Durante la commissione di un crimine violento, un piccolo numero di celle viene trasferito da un individuo a un altro individuo, come quando un aggressore afferra il polso di una vittima. Per recuperare prima il piccolo numero di cellule, utilizzare una pellicola di gel a bassa adesione attaccata a un vetrino da microscopio per campionare l'area di contatto.

Il secondo passo consiste nel colorare le particelle biologiche trasferite per facilitarne la visualizzazione al microscopio. Quindi, isolare le particelle bio dal film di gel utilizzando la micromanipolazione. Raccogli l'adesivo solubile in acqua sulla punta di un ago di tungsteno e usalo per rimuovere le particelle biologiche di interesse dalla superficie del film di gel.

Il passaggio finale consiste nel trasferire con cura le particelle biologiche raccolte individualmente in una miscela di amplificazione PCR nella parte inferiore di una raccolta PCR per migliorare i metodi di tipizzazione del DNA per ottenere un profilo del DNA del donatore di tracce di prove di DNA. Ok, nel mio laboratorio ci concentriamo sull'analisi genetica del piccolo numero di cellule che vengono trasferite durante la commissione di un crimine violento contro la persona tra un individuo e un altro individuo, o tra un individuo e un oggetto. I metodi tradizionali spesso non riescono a recuperare il profilo del DNA da un numero così piccolo di cellule.

Qui abbiamo sviluppato un metodo semplificato per il recupero fisico e l'analisi genetica di un numero così piccolo di cellule, sia singole cellule che agglomerati di cellule, che possono essere incorporate in qualsiasi laboratorio forense. A dimostrare la procedura sarà Katie Fairish, una studentessa laureata nel mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, preparare la pellicola di gel che verrà utilizzata per la raccolta delle bioparticelle.

Tagliare la pellicola di gel alla dimensione desiderata appropriata per il vetrino del microscopio utilizzato come supporto solido. Ad esempio, per un vetrino da tre pollici per un pollice, utilizzare la dimensione della pellicola in gel di due pollici per 0.75 pollici. Rimuovere il supporto bianco dalla pellicola in gel e fissare la pellicola in gel al vetrino del microscopio, premendo con decisione verso il basso per garantire un fissaggio completo.

Si noti che esiste uno strato protettivo superiore trasparente che non deve essere rimosso per consentire l'applicazione di pressione lungo il pezzo di pellicola di gel senza contaminare la superficie del film di gel I vetrini di pellicola di gel preparati con lo strato protettivo attaccato possono essere conservati a temperatura ambiente fino al momento del bisogno. Quando sei pronto per utilizzare la pellicola in gel, usa una pinzetta sterile per rimuovere lo strato protettivo superiore trasparente. Posizionare la superficie della pellicola in gel a diretto contatto con l'oggetto o la superficie toccata desiderata.

Ad esempio, la pelle umana dal polso. Applicare una piccola quantità di pressione per garantire un trasferimento efficiente delle particelle biologiche al film di gel. Non applicare troppa pressione perché il vetrino potrebbe rompere più campioni dallo stesso oggetto o la superficie può essere raccolta sullo stesso pezzo di pellicola di gel Allo stesso modo, le particelle biologiche possono essere raccolte da oggetti e capi di abbigliamento come il colletto di una camicia.

Per confermare il trasferimento delle particelle bio sulla pellicola in gel, esaminare il vetrino su uno stereomicroscopio utilizzando l'illuminazione trans o epi. Un ingrandimento di circa 20x è il migliore per visualizzare aree più grandi del film in gel, mentre un ingrandimento di circa 200x è il migliore per visualizzare singole particelle biografiche. Conservare il vetrino del campione in pellicola gel a temperatura ambiente in una scatola per vetrini coperta.

Fino a quando non sono pronte per la colorazione e/o la raccolta delle particelle biologiche, le particelle biologiche possono essere colorate per facilitare la visualizzazione. Per fare ciò, posizionare prima il vetrino del campione di pellicola gel preparato come mostrato in precedenza su un rack di colorazione dei vetrini sopra un lavandino. Utilizzando una pipetta di trasferimento monouso, coprire l'intera superficie del film di gel con la macchia blu Trian, incubare a temperatura ambiente per uno o due minuti.

Rimuovere la macchia in eccesso inclinando il cursore per consentire alla macchia di defluire nel lavandino, se necessario. Il vetrino può essere risciacquato mediante un leggero inondazione con acqua sterile utilizzando una pipetta di trasferimento monouso. Dopo che il vetrino è stato asciugato, visualizzare il vetrino utilizzando uno stereomicroscopio per garantire una colorazione corretta.

Il vetrino colorato può essere conservato a temperatura ambiente in una scatola di vetrini coperta. Iniziare questa procedura posizionando il numero appropriato di provette PCR da 0,2 millilitri in un rack ed etichettando le provette in modo appropriato. Preparare un volume appropriato di miscela di amplificazione STR per il numero desiderato di campioni.

Vortex e master miscelare bene e centrifugare brevemente in una mini centrifuga percorso PI. 3,5 microlitri di amplificazione. Mescolare in ogni provetta da 0,2 millilitri tappare leggermente ogni provetta.

Posiziona un pezzo di nastro biadesivo direttamente su un blocco di vetro. Questo verrà utilizzato per tenere in posizione la provetta da 0,2 millilitri durante la raccolta del campione. Posiziona un altro pezzo di nastro biadesivo su un vetrino da microscopio in vetro pulito.

Quindi posizionare un pezzo di nastro ondulato solubile in acqua sopra il nastro biadesivo. Fissare il nastro in posizione applicando pressione lungo la lunghezza del nastro. Lo strato bianco superiore protettivo può quindi essere rimosso.

Quindi posizionare il primo tubo da 0,2 millilitri sul nastro biadesivo Sul blocco di vetro. Mettere da parte questa provetta fino a quando il campione non viene raccolto. Posizionare il vetrino del nastro del soldato d'onda solubile in acqua sotto il microscopio durante la visualizzazione a basso ingrandimento.

Usa la punta di un ago per linguette per raschiare delicatamente la superficie del nastro in modo da raccogliere la piccola quantità o la palla di adesivo all'estremità dell'ago. La dimensione della palla di adesivo dipenderà dal numero di particelle biologiche da raccogliere con attenzione. Togliete le lingue.

Posizionare l'ago con l'adesivo da sotto il microscopio senza disturbare la punta dell'ago. Se necessario, posizionare l'ago in una rastrelliera. L'aspetto più critico della procedura è la raccolta e il trasferimento delle particelle biologiche.

Per garantire il successo, le tecniche devono essere praticate fino a quando l'analista non è esperto. Posizionare un campione di pellicola gel precedentemente preparato sul tavolino del microscopio utilizzando un blocco di vetro per sostenere il vetrino. Regolare la messa a fuoco e l'ingrandimento fino a quando le particelle biologiche possono essere facilmente visualizzate.

Identificare le particelle bio che verranno raccolte. Recupera l'ago di tungsteno con la sfera adesiva e posiziona l'ago sulla superficie della pellicola di gel dove si trovano le particelle biologiche di interesse. Premere la punta dell'ago verso il basso in modo che sia a contatto con la bioparticella.

Sollevare l'ago per assicurarsi che la bioparticella sia stata raccolta. Ripetere questo processo fino a quando non è stato raccolto il numero desiderato di particelle biologiche. Posizionare una provetta PCR da 0,2 millilitri preparata sul tavolino del microscopio.

Regolare l'ingrandimento in modo che la parte inferiore del tubo contenente il mix di amplificazione sia a fuoco. Durante la visione attraverso il microscopio, inserire con cautela l'ago di tungsteno nella provetta PCR da 0,2 millilitri fino a quando la punta dell'ago non si trova nella miscela di amplificazione. Tenere l'ago nella miscela di amplificazione fino a quando l'adesivo non si dissolve e si osserva il rilascio di particelle biologiche nella soluzione.

Rimuovere l'ago. Posizionare il tubo da 0,2 millilitri in posizione verticale e tapparlo senza stringere. Pulire l'ago di tungsteno con un batuffolo imbevuto di alcol pre-inumidito e ripetere questa procedura di raccolta per ulteriori campioni.

Per iniziare il protocollo di amplificazione avanzato per la profilazione STR autosomica delle particelle biologiche raccolte, aggiungere 1,5 microlitri di tampone di lisi a ciascuna provetta da 0,2 millilitri contenente la miscela di amplificazione e le particelle biologiche chiudono ermeticamente i coperchi delle provette. Posizionare i campioni nel termociclatore e amplificare i campioni utilizzando le condizioni cicliche descritte nel testo del protocollo Al termine dell'amplificazione. Conservare i prodotti di amplificazione a quattro gradi Celsius fino al momento del rilevamento mediante elettroforesi capillare.

Non vengono mostrate immagini rappresentative di singole particelle biologiche in un campione di colletto di camicia. Le particelle bio raccolte vengono cerchiate. I cerchi rossi indicano che un profilo è stato recuperato.

È inclusa la percentuale di recupero dell'allile. I cerchi neri indicano che un profilo non è stato recuperato. Allo stesso modo, queste immagini sono di particelle bio raggruppate in un campione di colletto di camicia, mostrato qui è il profilo STR ottenuto da uno dei singoli campioni di particelle bio dal colletto della camicia.

La sua precisione è stata determinata dal confronto con un profilo di riferimento. I numeri degli alleli sono designati sotto ogni picco in ogni locus. L'asse x rappresenta la dimensione del frammento e l'asse Y rappresenta l'intensità del segnale.

Questo profilo è di alta qualità con altezze di picco tra i locus ragionevolmente bilanciate e nessuna caduta allelica. Il prossimo profilo è un profilo STR completo ottenuto da uno dei campioni di particelle bio raggruppate dal colletto della camicia. Infine, questa figura mostra un esempio di profilazione del DNA non riuscita di una singola bioparticella con un recupero dell'allele del 3%.

Questo metodo dovrebbe promuovere il recupero di profili di DNA da un'unica fonte dagli aggressori nei casi di aggressione fisica. Non ci è sfuggito che questo metodo elimina anche alcuni dei problemi associati all'interpretazione e alla deconvoluzione dei profili di DNA misti.