Sistemica infezione batterica e immunitario Difesa fenotipi in

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di somministrare infezioni batteriche robuste e ripetibili a drosophila, melanogaster, quindi di misurare successivamente la gravità dell'infezione e quantificare la risposta immunitaria dell'ospite. Ciò si ottiene somministrando prima l'infezione batterica nei moscerini utilizzando un nano iniettore. La post-mortalità può essere monitorata dopo l'infezione nel tempo e la carica batterica sistemica può essere determinata in qualsiasi momento omogeneizzando i moscerini infetti e misurando il numero di batteri presenti.

La difesa immunitaria dell'ospite può anche essere quantificata misurando il livello di espressione dei geni peptidici antibatterici, in ultima analisi la quantificazione e la caratterizzazione dell'infezione batterica. Nella drosofila, il melanogaster può essere utilizzato per testare come i fattori genetici e ambientali alterano la competenza immunitaria della mosca. Questo metodo può essere utilizzato per affrontare questioni chiave nel campo dell'immunità degli insetti, come ad esempio il modo in cui i fattori genetici e ambientali dell'ospite influenzano la capacità immunitaria o il modo in cui i batteri distinti variano nella loro cinetica di infezione, Sebbene stiamo utilizzando questo metodo per misurare la difesa immunitaria della drosophila melanogaster contro l'infezione batterica, può anche essere applicato ad altri insetti e può fare uso di altri tipi di agenti patogeni come virus o funghi.

Un problema comune che le persone riscontrano quando imparano per la prima volta questo metodo è che possono causare troppe lesioni alle mosche, il che può comportare una mortalità eccessivamente elevata, anche nei controlli. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per imparare a fare l'infezione con il minimo danno alla mosca. Poiché la nostra specie ospite oph melanogaster è così piccola, l'infezione deve essere eseguita al microscopio, il che si aggiunge alla complessità iniziale della tecnica.

Tuttavia, crediamo che una piccola dimostrazione della tecnica la renderà accessibile anche agli scienziati che hanno solo un'esperienza limitata con le mosche. Per iniziare l'esperimento, selezionare una singola colonia da una piastra madre precedentemente preparata e inoculare un pallone di terreno sterile. Far crescere i batteri durante la notte a 37 gradi Celsius fino alla fase stazionaria.

Una volta che la coltura ha raggiunto la fase stazionaria, pellettare delicatamente le cellule da 600 microlitri di coltura in una centrifuga da tavolo per tre minuti a 5.000 volte. G, quindi scarta Rena e Resus. Sospendi i batteri in 1000 microlitri di soluzione salina sterile tamponata con fosfato o PBS.

Successivamente, diluire le cellule risospese in PBS sterile per ottenere l'assorbanza desiderata di 600 nanometri e utilizzare questa sospensione per infettare le mosche bugie. Preparare un ago di vetro tirando un capillare di vetro silicato preso in prestito e utilizzare una pinza per rompere la punta dell'ago per creare un'apertura di 50 micrometri di diametro. Quindi posizionare l'O-ring a soffitto e il distanziatore bianco con la grande fossetta rivolta verso l'esterno sullo stantuffo metallico dell'iniettore.

Riempire l'ago di vetro con olio minerale utilizzando una siringa con ago calibro 30. Quindi posizionare l'ago di vetro riempito attraverso la pinza e posizionare l'O-ring più grande attorno alla sua base a un millimetro dall'estremità smussata dell'ago. Far scorrere l'ago sullo stantuffo di metallo e avvitare delicatamente la pinza finché non è fissa.

Espellere l'olio minerale dall'iniettore, lasciando un piccolo volume di olio nell'ago per fungere da barriera tra l'iniettore e la sospensione batterica. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria all'interno dell'olio minerale, della sospensione batterica o tra i due liquidi. Quindi impostare l'iniettore sul volume desiderato per l'iniezione.

Inserire con cautela la punta dell'ago capillare in un tubo di PBS sterile e premere il pulsante di riempimento sull'iniettore per riempire l'ago dell'iniettore e generare controlli di ferita. Iniettare mosche anestetizzate con PBS sterile nell'addome anteriore sulla superficie laterale ventrale, posizionare le mosche iniettate in fiale fresche con nuovi terreni e adagiare le fiale su un lato per evitare che le mosche si attacchino al cibo prima che si riprendano dall'anestesia. Quindi, espellere il terreno sterile rimanente dall'iniettore e riempire lo stesso ago con la sospensione batterica.

Ripetere la procedura e iniettare nei moscerini la sospensione batterica. In alternativa, l'infezione può essere trasmessa da una puntura di spillo settica. Per preparare il perno infettante, fondere l'estremità di un puntale per micropipette da 200 microlitri e inserire uno spillo da 0,15 millimetri nella plastica fusa.

Lasciare solidificare la plastica in modo che il perno sia tenuto in posizione con 0,5 centimetri di perno che si estende dalla plastica, anestetizzare le mosche con anidride carbonica e pungere le mosche nella placca pleurica sternale del torace con l'ago, evitando i siti di attacco delle ali e delle zampe. Rimuovere le mosche dal perno delle minuzie usando una pinza morbida. Assicurati di immergere il perno nella sospensione batterica tra la puntura di ogni mosca.

Metti le mosche pungenti in una fiala fresca con un nuovo mezzo di coltura per mosche che appoggia la fiala su un lato fino a quando tutte le mosche non si sono riprese dall'anestesia. Posizionare un sottoinsieme di mosche infette in singole provette da microcentrifuga su ghiaccio. Aggiungi 250 microlitri di PBS a ciascun tubo e usa un pestello per omogeneizzare le mosche.

Quindi impiattare l'omogeneizzato su un aerato LB utilizzando un piatto a spirale. In alternativa, per placcare l'omogeneizzato mediante diluizione seriale. Trasferire ogni omogeneizzato di mosca nella prima fila di un 96.

Preparare a pozzetti e riempire ogni pozzetto delle file rimanenti con 90 microlitri di PBS utilizzando una pipetta multicanale. Prelevare 10 microlitri dalla prima fila contenente omogeneizzato di mosca ed erogare l'omogeneizzato nella seconda fila. Versalo su e giù almeno 10 volte per mescolare accuratamente l'omogeneizzato.

Quindi prelevare 10 microlitri di omogeneizzato e trasferirlo nella fila successiva. Ripetere questa procedura utilizzando le righe rimanenti a partire dalla riga inferiore. Utilizzare la pipetta multicanale per prelevare 10 microlitri da ciascun pozzetto e depositarli su una piastra LB.

Assicurarsi che i campioni vengano erogati come punti discreti che non si tocchino tra loro. Ripetere questo passaggio fino a quando tutti i pozzetti sono stati campionati da ogni fila, erogandoli in ordine decrescente di diluizione sulla piastra LB. Qualunque sia il metodo di placcatura utilizzato, fare attenzione a non far crescere eccessivamente le piastre in modo che le colonie rimangano piccole e discrete.

Rimuovere la piastra dall'incubatrice. Una volta che i batteri sperimentali hanno sviluppato colonie visibili, ma prima delle colonie della drosofila, il microbiota intestinale diventa visibile circa 24 ore dopo per le piastre a spirale. Conta le colonie che crescono utilizzando un contatore di colonie automatizzato in grado di stimare la carica batterica per millilitro di omogenato in base al numero e alla posizione delle colonie sulla piastra.

Per le piastre spot, contare manualmente le colonie per ogni mosca da qualsiasi diluizione contenga da 30 a 300 colonie e calcolare il numero di batteri per millilitro di omogeneizzato originale. Ai moscerini sono stati iniettati 50 nanolitri di sospensioni batteriche che coprono una gamma di densità ottiche e immediatamente omogeneizzati e la dose di infezione è stata placcata varia con la densità ottica della sospensione batterica utilizzata per l'iniezione. Le cariche batteriche iniziali sono fortemente correlate con l'OD iniziale iniettato.

Questo protocollo consente l'osservazione di diversi tipi di infezioni. I moscerini sono stati infettati da providencia rei, che può causare un'infezione cronica subletale che persiste per 20 giorni o più. Le mosche infette da coli elimineranno l'infezione entro sei ore. Post-infezione.

L'induzione del sistema immunitario può essere stimata attraverso l'isolamento dell'RNA e il successivo trascritto Q rtpcr del peptide antibatterico analogamente, ma meno quantitativamente i moscerini esprimono GFP sotto il controllo del peptide antimicrobico. I promotori genici possono essere utilizzati per visualizzare l'induzione del sistema immunitario Una volta padroneggiato. Questa tecnica può consentire l'infezione di centinaia di mosche all'ora.

Qualsiasi numero di fenotipi potrebbe plausibilmente essere misurato nei moscerini dopo che sono stati infettati, inclusa la capacità di apprendimento del fity, lo stato metabolico o praticamente qualsiasi altro tratto che possa essere immaginato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trasmettere infezioni batteriche robuste e ripetibili a Drosophila, melanogaster e come misurare successivamente la gravità dell'infezione e quantificare la risposta immunitaria dell'ospite. Non dimenticare che alcuni batteri possono comportare rischi per la salute umana.

Assicurati che vengano seguite le corrette procedure di biosicurezza e che siano in atto adeguate misure di contenimento per impedire la fuga delle mosche infette. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.