Name: Sistemica infezione batterica e immunitario Difesa fenotipi in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Impara a indurre infezioni batteriche sistemiche in Drosophila melanogaster e a misurare la risposta immunitaria dell'ospite. Questo metodo consente di quantificare il carico batterico e l'espressione dei geni dei peptidi antimicrobici.

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Vorremmo ringraziare l'intero laboratorio Lazzaro, e in particolare Susan Rottschaefer, per il loro aiuto sia nella revisione che nel test di questi protocolli. Questo è il prodotto della loro esperienza cumulativa. Il lavoro nel laboratorio Lazzaro è supportato da sovvenzioni R01 AI083932 e R01 AI064950 dal National Institutes of Health degli Stati Uniti.

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Nessuno degli autori ha interessi in competizione o in conflitto.

La procedura qui descritta produce infezione qualità rigoroso e alto di Drosophila melanogaster. Gli esempi illustrati concentrati principalmente sulla infezione da Providencia rettgeri ed E. coli, ma il protocollo è altamente adattabile e può essere applicato alle infezioni con diversi batteri su una gamma di condizioni di allevamento host e manutenzione. I dettagli di un approccio sperimentale ottimale dipenderà batterio utilizzato per l&#39;infezione, il genotipo dell&#39;ospite, e le condizioni sperimentali generali. E &#39;fortemente raccomandato di test pilota eventuali nuove condizioni sperimentali prima di avviare i progetti più ambiziosi. Un buon punto di partenza è quello di testare tre dosi di infezione in un range di 100 volte. Altamente patogeni virulenti sono spesso meglio introdotti a dosi infettive molto bassi, dell&#39;ordine di 10 - 100 cellule batteriche per mosca. Gli agenti patogeni più moderati possono essere iniettati in dosi più elevate di circa 1.000 batteri per fly, e non gli agenti patogeni possono essere iniettati in dosi fino a 10.000 batteri per volare. Spesso è istruttivo definire le cinetiche di infezioni nuovi tracciando carico patogeno, la mortalità host e l&#39;attività del sistema immunitario su una serie temporale longitudinale. Poiché la misura del carico patogeno e l&#39;espressione genica ospitante sono prove distruttive, è necessario per infettare le mosche distinti fin dall&#39;inizio dell&#39;esperimento per ogni punto di tempo che deve essere misurato. Al momento di decidere se utilizzare puntura di spillo o iniezione a base microcapillare-, è importante notare che ci sono vantaggi e limitazioni di ogni approccio. Iniezione capillare presenta un volume di liquido nella mosca, che sia modestamente aumenta la pressione turgore e introduce sali o altre molecole che sono sospesi o disciolti nel veicolo. Iniezione capillare richiede anche l&#39;accesso ad un impianto di iniezione o l&#39;acquisto delle attrezzature necessarie. Pinprick Septic non richiede attrezzature speciali e introducesupporti trascurabili nel volo, ed è in genere più efficace per infettare un gran numero di mosche. Tuttavia, le infezioni puntura di spillo non consentono il controllo preciso dosaggio infezione che può essere raggiunto con iniezione capillare. Il presente protocollo focalizzata su un apparato di iniezione che regola meccanicamente volume di iniezione, ma ci sono anche sistemi di iniezione a base di impulsi discreti di aria pressurizzata. 20,21 Questi sono in genere più costosi dei apparecchiatura descritta qui e richiedono la calibrazione dell&#39;impulso aria per ciascun aghi per garantire volumi di iniezione coerenti. Vi è un ampio dibattito, ma pochissimi dati su come le mosche diventano sistemica infettati con i batteri in natura. Alcuni ricercatori ipotizzano che la maggior parte delle infezioni naturali si verificano quando Drosophila ingerire batteri patogeni e batteri sono successivamente in grado di sfuggire l&#39;intestino per stabilire una infezione sistemica. Tuttavia, ci sono molto few batteri noti per essere in grado di attraversare l&#39;intestino di D. melanogaster, e quelli che hanno questa capacità sono altamente letale per le mosche 22,23. Una teoria alternativa è che vola regolarmente subire lesioni cuticolari attraverso fuga dai tentativi di predazione falliti o attacco di acari ectoparassiti. Questa ipotesi è supportata dalla raccolta frequente di selvaggio D. melanogaster recanti macchie melanizzazione che sono indicativi delle ferite guarite (osservazioni non pubblicate). Gli acari sono stati indicati per la trasmissione di infezioni batteriche in Drosophila 24 e le ferite lasciate da acari possono essere secondariamente infettato da batteri nelle api 25. Tuttavia, la frequenza naturale di infezione acari-driven o altrimenti opportunistica di D. melanogaster attraverso violazioni cuticola non è noto. Il protocollo qui descritto consente l&#39;introduzione di batteri direttamente nella emolinfa attraverso l&#39;iniezione quantitativa che bypassa le barriere epiteliali o Immu comportamentalicomunitario. Metodi per alimentare i batteri patogeni a D. melanogaster sono stati descritti in Vodovar et al. 22 e Nehme et al. 23. Molti batteri entomopatogeni rappresentano poco o nessun rischio per la salute umana, consentendo ai ricercatori di lavorare con loro in modo confortevole. Inoltre, molto pochi i batteri hanno la capacità di infettare Drosophila in contatto senza intervento sperimentale, per cui il rischio di diffusione &quot;epidemica&quot; di infezione batterica attraverso un laboratorio di via superfici contaminate o fuggiti mosche è generalmente molto basso. Tuttavia, è opportuno garantire che adeguate misure di contenimento sono in atto per evitare che le mosche infette di fuggire e per riconquistare qualsiasi mosche sfuggito. Il laboratorio deve essere attrezzato ad un livello di sicurezza biologica commisurata a quella dei patogeni in uso, e migliori pratiche standard in microbiologia deve essere impiegato. Il infecti sperimentaleil metodo qui descritto permette di infezioni di Drosophila melanogaster, con qualsiasi dosaggio di qualsiasi batterio arbitrario. Una volta che l&#39;infezione è stata stabilita, è semplice per misurare la cinetica di proliferazione batterica o di liquidazione, per monitorare la mortalità di accoglienza, e di saggiare l&#39;induzione del sistema immunitario dell&#39;ospite. Mosche infetti possono essere facilmente sottoposti ad altri test fenotipici, compresi i test di funzioni fisiologiche che possono modellare o essere modellati dal infezione. Le procedure descritte sono poco costosi, richiedono relativamente poco attrezzature specializzate, e sono facilmente apprese, che li rende suscettibili per l&#39;utilizzo in diversi progetti attraverso una larghezza di laboratori di ricerca e di insegnamento.

La mosca della frutta Drosophila melanogaster è uno degli organismi modello premier per lo studio della funzione e l&#39;evoluzione di difesa immunitaria. Drosophila sono poco costosi e facili da dietro, sono altamente suscettibili di manipolazione sperimentale, e sono supportato da una vasta comunità scientifica che si è sviluppato un ampio serie di strumenti di ricerca. Molti aspetti dell&#39;immunità innata sono conservate tra insetti e mammiferi, tra cui trasduzione del segnale mediata da recettori Toll-like e NF-kB fattori di trascrizione della famiglia, di segnalazione JAK / STAT, e le risposte via di JNK. 1,2 La funzione di questi geni e vie can essere interrogato in D. melanogaster con mutazioni o RNAi abbattimenti che le attività di aumentare o diminuire pathway. 3 - 6 Inoltre, Drosophila può essere usato per studiare le conseguenze fisiologiche della infezione e la malattia, anche nel contesto della teoria evoluzionistica storia di vita 7.- 9 Tutti questi studi, tuttavia, dipendono dalla capacità di infettare in modo affidabile le mosche sperimentali in condizioni di trattamento definite. La procedura qui descritta presenta un quadro metodologico per la consegna di infezioni batteriche resistenti e ripetibili di Drosophila melanogaster e successivamente misurare infezione gravità e quantificare la risposta immunitaria. Drosophila può essere naturalmente e sperimentalmente infettato da una grande varietà di parassiti e patogeni, tra cui batteri, funghi, virus, nematodi e vespe parassitoidi. Il protocollo attuale è focalizzata sulla fornitura di un&#39;infezione batterica sistemica. Molti batteri differenti possono essere utilizzati per infettare le mosche, e la scelta dello sperimentatore dovrebbero essere basati sulle precise questioni scientifiche essere chiesto. Ad esempio, isolati clinici umani possono essere impiegati per studiare i meccanismi di virulenza batterica 10, o ecologicamente pertinenti isolati possono essere preferite lad per lo studio evolutivo. 11 Alcuni batteri sono patogeni competenti di D. melanogaster, proliferando su infezioni e che causa la malattia di accoglienza o la morte. Altri batteri sono effettivamente gestiti dal sistema immunitario ospite e cancellati entro pochi giorni. In questa dimostrazione, Providencia rettgeri sarà utilizzato come un agente patogeno proliferativa che può causare la mortalità ospitante e persiste in hosts sopravvissuti. Escherichia coli viene utilizzata come non patogeno che viene eliminato dal sistema immunitario dell&#39;ospite. Infezione sarà stabilito dalla introduzione di batteri direttamente nella cavità del corpo della mosca. Questo approccio bypassa barriere epiteliali e comportamenti protettivi, consentendo indagini di infezione sistemica indipendentemente dal modo naturale della trasmissione. Ci sono due metodi principali per stabilire sperimentalmente infezione sistemica. Nel primo, un nanoinjector e capillare di vetro tirato aghi sono usati per iniettare un numero preciso dibatteri nel volo. Questo metodo ha il vantaggio di consentire una vasta gamma dinamica di dosi infettive e di essere quantitativamente altamente ripetibili. Il secondo approccio è quello di fornire l&#39;infezione con una puntura di spillo settico. Questo approccio ha il vantaggio di essere rapida e non richiede attrezzature speciali. Una volta che le infezioni sono stabiliti, diventa possibile misurare il carico sistemico patogeno, la mortalità host e l&#39;attività inducibile sistema immunitario. Naturalmente, qualsiasi numero di fenotipi supplementari potrebbe concepibilmente essere misurata in infetto D. melanogaster, anche post-infezione fecondità 12, la capacità di apprendimento 13, stato metabolico 14, o per qualsiasi altra caratteristica che si possa immaginare.

<table><tbody><tr><td>Incubator</td><td>Powers Scientific, Inc</td><td>DROS52SD</td><td></td></tr><tr><td>Paintbrush</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Flypads</td><td>FlyStuff</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD FG50</td><td></td></tr><tr><td>Mix di allevamento di Drosophila&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bottiglie a fondo quadrato da 6 once, polipropilene</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Nosterile Extra Large Cotton Balls</td><td>Fisher marca</td><td>22-456-882</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Fiale in polistirene</td><td>VWR international</td><td>89092-720</td><td></td></tr><tr><td>Nosterile Batuffoli</td> <td>di cotone grandiFisher marca</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>Pallone da 2 L</td><td>VWR international</td><td>89000-370</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri con coperchi trasparenti, colmo rialzato; 100 x 15 mm;</td><td>VWR international</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Anello di inoculazione</td><td>VWR international</td><td>80094-488</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Rainin Clasic in varie dimensioni 0,1 &; da l a 2 &micro; l, 2 &micro; da l a 20 &micro; l, 20 &micro; l fino a 200 &micro; l, 100 &micro; l fino a 1.000 &micro; l</td><td>Rainin</td><td>PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per micropipette (misure assortite)</td><td>VWR international</td><td>30128-376 53503-810 16466-008</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth Base, Miller</td><td>Difco</td><td>241420</td><td></td></tr><tr><td>Provette per coltura monouso in vetro borosilicato</td><td>VWR international</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>S-500 Orbital Agitatore</td><td>VWR international</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>VWR international</td><td>37001-300</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 10X</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro SmartSpec 3000</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette semimicrovolume</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore capillare verticale</td><td>Ago Kopf Estrattore</td><td></td><td></td>per pipette</tr><tr><td>3,5 '' Capillari in vetro di ricambio per Nanojet II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale, bianco, leggero</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>6358-10</td><td></td></tr><tr><td>Minutein perni Strumenti per</td><td>la scienza fine</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml&nbsp; Provette per microcentrifuga; Sigillo Rito</td><td>USA Scientific Inc.</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Pestello motorizzato; Agitatore da laboratorio Talboys</td><td>Troemner</td><td>103</td><td></td></tr><tr><td>Talboys Omogeneizzatore ad alta produttività</td><td>OPS Diagnostics</td><td>930145</td><td></td></tr><tr><td>5/32 '' Sfere di macinazione</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 156-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>Scientific indurstries inc.</td>Pipettatore multicanale <td>G560</td><td></td></tr><tr><td>(10 &mu; l - 300 &mu; l)</td><td>Sartorius</td><td>730360</td><td></td></tr><tr><td>WASP2 Whitley Automated Spiral Plater</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProtoCOL contatore automatizzato di colonie / contatore di piastre / lettore di piastre&nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>provette qPCR; Strisce a basso profilo da 0,2 ml per 8 provette</td><td>Bio-Rad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>tappi qPCR; Strisce ottiche piatte a 8 cappucci</td><td>Bio-Rad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNasi senza RNasi</td><td>Promega</td><td>m610a</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Trascrittasi inversa</td><td>Promega</td><td>m170b</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Promega</td><td></td><td>U1240</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; SsoAdvanced SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5260</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Sistema di rilevamento PCR in tempo reale</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5200</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della ribonucleasi RNasina</td><td>Promega</td><td>N2115</td><td></td></tr></tbody></table>

sistemica infezione batterica e immunitario difesa fenotipi in<em&gt; drosophila melanogaster</em

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

La mosca della frutta Drosophila melanogaster è uno degli organismi modello premier per lo studio della funzione e l&#39;evoluzione di difesa immunitaria. Molti aspetti dell&#39;immunità innata sono conservate tra insetti e mammiferi, e dato che Drosophila può essere facilmente manipolato geneticamente e sperimentalmente, sono potenti per studiare la funzione del sistema immunitario e le conseguenze fisiologiche della malattia. La procedura permette dimostrato qui infezione di mosche dall&#39;introduzione di batteri direttamente nella cavità del corpo, bypassando barriere epiteliali e forme più passivi di difesa e consentendo attenzione alla infezione sistemica. Il procedimento comprende i protocolli per i tassi di mortalità misurazione ospitante, carico patogeno sistemica, e il grado di induzione del sistema immunitario dell&#39;ospite. Questa procedura infezione è poco costoso, robusto e quantitativamente ripetibile, e può essere usato in studi di genetica funzionale, storia di vita evolutiva e fisiologia.

Questa sezione illustra i risultati ottenibili dopo l&#39;infezione batterica di Drosophila melanogaster. La Figura 1 mostra quella dose infezione varia con la densità ottica della sospensione batterica utilizzato per l&#39;iniezione, e che la dose erogata può essere attendibilmente stimato omogeneizzazione e placcatura vola immediatamente dopo l&#39;iniezione . Come illustrato in figura 2, diversi agenti patogeni possono causare diversi livelli di mortalità host (figura 2A) e mortalità ospitante può essere dose-dipendente (Figura 2B). È importante sottolineare che questo protocollo consente diversi tipi di infezioni da raggiungere: Providencia rettgeri può causare un&#39;infezione cronica, subletale che persiste per 20 giorni o più (Figura 3A). Tuttavia, altri batteri come Escerichia coli saranno per lo più cancellati dalla mosca ospitante entro sei ore dopo l&#39;infezione (Figura 3B). Induzione di sys immunitarioTEM può essere stimata attraverso l&#39;isolamento di RNA e la successiva qRT-PCR dei trascritti peptidi antibatterici (Figura 4A e B). Analogamente ma meno quantitativamente, mosche esprimendo GFP sotto il controllo del peptide antimicrobico promotori genici può essere utilizzato per visualizzare l&#39;induzione del sistema immunitario (Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig1.jpg" /> . Figura 1: Determinazione Infectious Dose mosche sono stati iniettati con 50 nl di sospensioni batteriche che coprono una gamma di densità ottiche (,0001-,05). Le mosche erano immediatamente omogeneizzati e piastrate per determinare il numero di batteri introdotto dalla iniezione. Carica batterica iniziale è strettamente correlato con OD iniziale iniettato (r 2 = 0,96) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2:. La sopravvivenza dopo iniezione con batteri patogeni cinque a sette maschi vecchi giorni sono stati iniettati con 50 nl di una sospensione di batteri o supporti sterili e monitorato per la sopravvivenza. (A) mosche wild type sono stati iniettati con circa 5.000 batteri di una delle tre specie diverse. Il tasso di mortalità di accoglienza dipende in larga misura dalla specie batterica usati per l&#39;infezione. (B) mosche wild type sono stati iniettati con tre diverse dosi di Enterococcous faecalis - 50, 500 e 5.000 batteri per volare. Le mosche muoiono più rapidamente quando infettati con dosi superiori infettive (C) Un mutante del sistema immunitario e la sua wild-type linea di controllo isogenico sono stati iniettati con circa 500 Burkholderia cepacia. Un confronto Log-Rank coppie dimostra che la wild-type fly sopravvive l&#39;infezione significativamente migliore rispetto al mutante (χ 2 = 59,02, df = 1, p &lt;0,0001). Figura 3:. Carica batterica dopo iniezione mosche sono state iniettate con circa il (A) 5000 P. rettgeri (B) 3.400 E. coli. Carica batterica è stata determinata immediatamente dopo l&#39;iniezione e in vari punti temporali successivi. Ciascun punto di dati rappresenta la carica batterica di una mosca. E. coli è rapidamente eliminato da host sfidato mentre P. rettgeri persiste per il resto della vita dell&#39;ospite ,. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig4.jpg" /> Figura 4: Induzione immunitario genica dopo l&#39;iniezione. (A) Le mosche sono stati iniettati con 50 nl di P. rettgeri o PBS sterile sia nel torace, o sono stati lasciati non manipolata a parte CO <sub&gt; 2 anestesia. Sei ore dopo l&#39;infezione, le mosche sono stati raccolti per l&#39;isolamento di RNA e espressione del Diptericin Un gene è stato determinato utilizzando qRT-PCR. (A) I livelli di espressione sono rappresentati graficamente come rapporto tra Diptericin Una trascrizione di rp49 trascrizione e scalato in modo tale che il controllo CO 2 è definito come aventi un livello di espressione di 1. Le barre rappresentano la media e l&#39;errore standard di rapporti da ciascuna condizione (n = 4). Livelli (B) di espressione vengono rappresentati graficamente come ΔΔCT 2 con il valore medio C T da CO 2 aesthesia linea di controllo utilizzati come condizione uninduced standard. Le barre rappresentano l&#39;errore medio e standard ΔΔC T da ciascuna condizione (n = 4). Mentre non vi è alcuna differenza di induzione trascrizione causa al sito di iniezione, il confronto di pannelli A e B mostra come il metodo ΔΔC T può potenzialmente sovrastimare i livelli di induzione. (C) Vola esprimono GFP sotto il controllo del Diptericin Un promotore sono stati iniettati con 50 nl di P. rettgeri (OD = 0,1) e poi ripreso sette giorni più tardi. Il pannello GFP mostra l&#39;espressione di GFP nel corpo grasso addominale di mosche infette, indicando l&#39;attivazione della Diptericin Un promotore in linea con infezione da batteri, ma non controlli multimediali a iniezione. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Gene </td><td> Avanti </td><td> Reverse </td></tr><tr><td> rp49 (chiamato anche rpL32) </td><td> 5 &#39;AGGCCCAAGATCGTGAAGAA 3&#39; </td><td> 5 &#39;GACGCACTCTGTTGTCGATACC 3&#39; </td></tr><tr><td> Diptericin A </td><td> 5 &#39;GCGGCGATGGTTTTGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;CGCTGGTCCACACCTTCTG 3&#39; </td></tr><tr><td> Drosomycin </td><td> 5 &#39;CTGCCTGTCCGGAAGATACAA 3 &#39; </td><td> 5 &#39;TCCCTCCTCCTTGCACACA 3&#39; </td></tr><tr><td> Defensin </td><td> 5 &#39;GAGGATCATGTCCTGGTGCAT 3&#39; </td><td> 5 &#39;TCGCTTCTGGCGGCTATG 3&#39; </td></tr><tr><td> Attacin A </td><td> 5 &#39;CGTTTGGATCTGACCAAGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;AAAGTTCCGCCAGGTGTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Metchnikowan </td><td> 5 &#39;AACTTAATCTTGGAGCGATTTTTCTG 3&#39; </td><td> 5 &#39;ACGGCCTCGTATCGAAAATG 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Primer per qRT-PCR.

Drosophila melanogaster è un eccezionale organismo modello per lo studio del sistema immunitario innato e delle conseguenze fisiologiche di infezioni e malattie. Questo protocollo descrive come somministrare infezioni batteriche robuste e quantitativamente ripetibili a D. melanogaster e come misurare successivamente la gravità dell'infezione e quantificare la risposta immunitaria dell'ospite.

Sistemica infezione batterica e immunitario Difesa fenotipi in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di somministrare infezioni batteriche robuste e ripetibili a drosophila, melanogaster, quindi di misurare successivamente la gravità dell'infezione e quantificare la risposta immunitaria dell'ospite. Ciò si ottiene somministrando prima l'infezione batterica nei moscerini utilizzando un nano iniettore. La post-mortalità può essere monitorata dopo l'infezione nel tempo e la carica batterica sistemica può essere determinata in qualsiasi momento omogeneizzando i moscerini infetti e misurando il numero di batteri presenti.La difesa immunitaria dell'ospite può anche essere quantificata misurando il livello di espressione dei geni peptidici antibatterici, in ultima analisi la quantificazione e la caratterizzazione dell'infezione batterica. Nella drosofila, il melanogaster può essere utilizzato per testare come i fattori genetici e ambientali alterano la competenza immunitaria della mosca. Questo metodo può essere utilizzato per affrontare questioni chiave nel campo dell'immunità degli insetti, come ad esempio il modo in cui i fattori genetici e ambientali dell'ospite influenzano la capacità immunitaria o il modo in cui i batteri distinti variano nella loro cinetica di infezione, Sebbene stiamo utilizzando questo metodo per misurare la difesa immunitaria della drosophila melanogaster contro l'infezione batterica, può anche essere applicato ad altri insetti e può fare uso di altri tipi di agenti patogeni come virus o funghi.Un problema comune che le persone riscontrano quando imparano per la prima volta questo metodo è che possono causare troppe lesioni alle mosche, il che può comportare una mortalità eccessivamente elevata, anche nei controlli. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per imparare a fare l'infezione con il minimo danno alla mosca. Poiché la nostra specie ospite oph melanogaster è così piccola, l'infezione deve essere eseguita al microscopio, il che si aggiunge alla complessità iniziale della tecnica.Tuttavia, crediamo che una piccola dimostrazione della tecnica la renderà accessibile anche agli scienziati che hanno solo un'esperienza limitata con le mosche. Per iniziare l'esperimento, selezionare una singola colonia da una piastra madre precedentemente preparata e inoculare un pallone di terreno sterile. Far crescere i batteri durante la notte a 37 gradi Celsius fino alla fase stazionaria.Una volta che la coltura ha raggiunto la fase stazionaria, pellettare delicatamente le cellule da 600 microlitri di coltura in una centrifuga da tavolo per tre minuti a 5.000 volte. G, quindi scarta Rena e Resus. Sospendi i batteri in 1000 microlitri di soluzione salina sterile tamponata con fosfato o PBS.Successivamente, diluire le cellule risospese in PBS sterile per ottenere l'assorbanza desiderata di 600 nanometri e utilizzare questa sospensione per infettare le mosche bugie. Preparare un ago di vetro tirando un capillare di vetro silicato preso in prestito e utilizzare una pinza per rompere la punta dell'ago per creare un'apertura di 50 micrometri di diametro. Quindi posizionare l'O-ring a soffitto e il distanziatore bianco con la grande fossetta rivolta verso l'esterno sullo stantuffo metallico dell'iniettore.Riempire l'ago di vetro con olio minerale utilizzando una siringa con ago calibro 30. Quindi posizionare l'ago di vetro riempito attraverso la pinza e posizionare l'O-ring più grande attorno alla sua base a un millimetro dall'estremità smussata dell'ago. Far scorrere l'ago sullo stantuffo di metallo e avvitare delicatamente la pinza finché non è fissa.Espellere l'olio minerale dall'iniettore, lasciando un piccolo volume di olio nell'ago per fungere da barriera tra l'iniettore e la sospensione batterica. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria all'interno dell'olio minerale, della sospensione batterica o tra i due liquidi. Quindi impostare l'iniettore sul volume desiderato per l'iniezione.Inserire con cautela la punta dell'ago capillare in un tubo di PBS sterile e premere il pulsante di riempimento sull'iniettore per riempire l'ago dell'iniettore e generare controlli di ferita. Iniettare mosche anestetizzate con PBS sterile nell'addome anteriore sulla superficie laterale ventrale, posizionare le mosche iniettate in fiale fresche con nuovi terreni e adagiare le fiale su un lato per evitare che le mosche si attacchino al cibo prima che si riprendano dall'anestesia. Quindi, espellere il terreno sterile rimanente dall'iniettore e riempire lo stesso ago con la sospensione batterica.Ripetere la procedura e iniettare nei moscerini la sospensione batterica. In alternativa, l'infezione può essere trasmessa da una puntura di spillo settica. Per preparare il perno infettante, fondere l'estremità di un puntale per micropipette da 200 microlitri e inserire uno spillo da 0,15 millimetri nella plastica fusa.Lasciare solidificare la plastica in modo che il perno sia tenuto in posizione con 0,5 centimetri di perno che si estende dalla plastica, anestetizzare le mosche con anidride carbonica e pungere le mosche nella placca pleurica sternale del torace con l'ago, evitando i siti di attacco delle ali e delle zampe. Rimuovere le mosche dal perno delle minuzie usando una pinza morbida. Assicurati di immergere il perno nella sospensione batterica tra la puntura di ogni mosca.Metti le mosche pungenti in una fiala fresca con un nuovo mezzo di coltura per mosche che appoggia la fiala su un lato fino a quando tutte le mosche non si sono riprese dall'anestesia. Posizionare un sottoinsieme di mosche infette in singole provette da microcentrifuga su ghiaccio. Aggiungi 250 microlitri di PBS a ciascun tubo e usa un pestello per omogeneizzare le mosche.Quindi impiattare l'omogeneizzato su un aerato LB utilizzando un piatto a spirale. In alternativa, per placcare l'omogeneizzato mediante diluizione seriale. Trasferire ogni omogeneizzato di mosca nella prima fila di un 96.Preparare a pozzetti e riempire ogni pozzetto delle file rimanenti con 90 microlitri di PBS utilizzando una pipetta multicanale. Prelevare 10 microlitri dalla prima fila contenente omogeneizzato di mosca ed erogare l'omogeneizzato nella seconda fila. Versalo su e giù almeno 10 volte per mescolare accuratamente l'omogeneizzato.Quindi prelevare 10 microlitri di omogeneizzato e trasferirlo nella fila successiva. Ripetere questa procedura utilizzando le righe rimanenti a partire dalla riga inferiore. Utilizzare la pipetta multicanale per prelevare 10 microlitri da ciascun pozzetto e depositarli su una piastra LB.Assicurarsi che i campioni vengano erogati come punti discreti che non si tocchino tra loro. Ripetere questo passaggio fino a quando tutti i pozzetti sono stati campionati da ogni fila, erogandoli in ordine decrescente di diluizione sulla piastra LB. Qualunque sia il metodo di placcatura utilizzato, fare attenzione a non far crescere eccessivamente le piastre in modo che le colonie rimangano piccole e discrete.Rimuovere la piastra dall'incubatrice. Una volta che i batteri sperimentali hanno sviluppato colonie visibili, ma prima delle colonie della drosofila, il microbiota intestinale diventa visibile circa 24 ore dopo per le piastre a spirale. Conta le colonie che crescono utilizzando un contatore di colonie automatizzato in grado di stimare la carica batterica per millilitro di omogenato in base al numero e alla posizione delle colonie sulla piastra.Per le piastre spot, contare manualmente le colonie per ogni mosca da qualsiasi diluizione contenga da 30 a 300 colonie e calcolare il numero di batteri per millilitro di omogeneizzato originale. Ai moscerini sono stati iniettati 50 nanolitri di sospensioni batteriche che coprono una gamma di densità ottiche e immediatamente omogeneizzati e la dose di infezione è stata placcata varia con la densità ottica della sospensione batterica utilizzata per l'iniezione. Le cariche batteriche iniziali sono fortemente correlate con l'OD iniziale iniettato.Questo protocollo consente l'osservazione di diversi tipi di infezioni. I moscerini sono stati infettati da providencia rei, che può causare un'infezione cronica subletale che persiste per 20 giorni o più. Le mosche infette da coli elimineranno l'infezione entro sei ore. Post-infezione.L'induzione del sistema immunitario può essere stimata attraverso l'isolamento dell'RNA e il successivo trascritto Q rtpcr del peptide antibatterico analogamente, ma meno quantitativamente i moscerini esprimono GFP sotto il controllo del peptide antimicrobico. I promotori genici possono essere utilizzati per visualizzare l'induzione del sistema immunitario Una volta padroneggiato. Questa tecnica può consentire l'infezione di centinaia di mosche all'ora.Qualsiasi numero di fenotipi potrebbe plausibilmente essere misurato nei moscerini dopo che sono stati infettati, inclusa la capacità di apprendimento del fity, lo stato metabolico o praticamente qualsiasi altro tratto che possa essere immaginato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trasmettere infezioni batteriche robuste e ripetibili a Drosophila, melanogaster e come misurare successivamente la gravità dell'infezione e quantificare la risposta immunitaria dell'ospite. Non dimenticare che alcuni batteri possono comportare rischi per la salute umana.Assicurati che vengano seguite le corrette procedure di biosicurezza e che siano in atto adeguate misure di contenimento per impedire la fuga delle mosche infette. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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Questo video dimostra la nano-iniezione di sospensione batterica nella cavità del corpo della mosca, con conseguente moltiplicazione batterica e infezione. La risposta immunitaria della mosca elimina alcuni batteri, mentre altri sfuggono all'autorizzazione immunitaria e sopravvivono all'interno dell'ospite causando un'infezione.

Infettare le mosche con una sospensione batterica utilizzando un nanoiniettore

Questo video mostra una tecnica per infettare la Drosophila introducendo un batterio patogeno direttamente nella loro cavità corporea. Questo metodo aggira le barriere epiteliali e altri meccanismi di difesa passiva, consentendo l'induzione di un'infezione sistemica. Dopo l'infezione, la risposta immunitaria risultante viene valutata monitorando la mortalità delle mosche ed eseguendo saggi a valle.

Una tecnica settica per introdurre un'infezione batterica sistemica nei moscerini

In questo video, dimostriamo una tecnica per misurare la carica batterica di E. coli dopo aver iniettato E. coli nel torace di Drosophila melanogaster.

Misurazione della carica batterica di E. coli in Drosophila melanogaster a seguito di infezione da E. coli

Un metodo per l'allevamento di Drosophila melanogaster in condizioni axeniche e gnotobiotic è presentato. Fly embrioni vengono dechorionated in ipoclorito di sodio, trasferiti asetticamente alla dieta sterili, e allevati in contenitori chiusi. Inoculando dieta ed embrioni con i batteri porta ad associazioni gnotobiotic, e la presenza di batteri è confermata dalla placcatura di tutto il corpo omogenati Drosophila.

Allevamento la mosca della frutta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sotto axeniche e Gnotobiotic Condizioni

Questo metodo viene illustrato come visualizzare l'invasione del patogeno nelle cellule di insetto con modelli tridimensionali (3D). Emociti da larve di Drosophila sono stati infettati con agenti patogeni virali o batterici, ex vivo o in vivo. Emociti infetti erano quindi fissi e macchiati per l'imaging con un microscopio confocale e la successiva ricostruzione cellulare 3D.

Estrazione di emociti da larve di Drosophila melanogaster per infezione microbica e l'analisi

Questo protocollo descrive metodi per esporre oralmente e di infettare il moscerino della frutta Drosophila melanogaster con batteri patogeni e per misurare il numero di batteri infettivi capannone dopo l'infezione dell'intestino. Descriviamo ulteriormente l'effetto di mutanti immuni sulla sopravvivenza vola dopo l'infezione batterica orale.

Infezione batterica orale e spargimento in Drosophila melanogaster

Questo protocollo descrive un test di fagocitosi in vivo in adulto Drosophila melanogaster quantificare fagocita riconoscimento e liquidazione delle infezioni microbiche.

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Le mosche adulte Drosophila melanogaster sono state ampiamente utilizzate come organismi modello per studiare i meccanismi molecolari alla base delle risposte immunitarie innate antimicrobiche dell'ospite e delle strategie di infezione microbica. Per promuovere lo stadio larvale di D. melanogaster come sistema modello aggiuntivo o alternativo, viene descritta una tecnica di iniezione larvale.

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