Macchie di sangue essiccato - preparazione ed elaborazione per l'uso in test immunologici e tecniche molecolari

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire un protocollo standardizzato per la preparazione e l'elaborazione di macchie di sangue essiccato da utilizzare successivamente nei saggi immunologici e nelle tecniche molecolari. Ciò si ottiene prelevando prima il sangue capillare e trasferendolo in una scheda filtrante. Il secondo passo consiste nell'asciugare le macchie di sangue durante la notte e ottenere punzoni di sei millimetri dai cerchi della scheda filtrante.

Successivamente, l'ian di sangue essiccato dai punzoni si ottiene mediante immersione in tampone su uno shaker per un minimo di quattro ore. Gli EIT emolitici vengono quindi liberati dai detriti mediante centrifugazione. Il passo finale consiste nell'analizzare gli EIT eliminati per i marcatori sierologici e molecolari delle infezioni con i virus dell'epatite B, dell'epatite C e dell'immunodeficienza umana mediante saggi immunologici e tecniche molecolari disponibili in commercio.

L'idea di utilizzare l'appezzamento raccolto su una carta filtrante fatta di cellulare è nata un secolo fa. Tuttavia, le persone che utilizzano questo metodo per la prima volta avranno spesso difficoltà anche oggi perché l'intera fase pre-analitica, che comprende la preparazione e l'elaborazione di macchie di sangue essiccato per l'analisi finale, non è stata standardizzata per quasi tutte le applicazioni del test delle macchie di sangue essiccato. Alla luce di queste premesse, suggeriamo un protocollo completo e standardizzato passo-passo per la preparazione e il trattamento di macchie di sangue essiccato da utilizzare successivamente nelle tecniche di immunodosaggio e molecolari.

La dimostrazione visiva di questa metodologia sembra essere cruciale in quanto diversi passaggi come il prelievo di sangue capillare. È corretto. Il trasferimento alle schede filtro o la preparazione di punzoni appropriati dalla folla non sono facili da imparare e, di conseguenza, le persone che utilizzano la tecnica per la prima volta trarranno senza dubbio beneficio dalla rappresentazione visiva.

Il sangue capillare verrà prelevato dal dito di Nico da un tecnico del nostro laboratorio che dimostrerà la procedura di lavorazione. Le macchie di sangue ottenute saranno effettuate dal tecnico ko, che lavora già da molti anni nel nostro laboratorio di diagnostica biologica molecolare per la puntura della pelle. Per prima cosa indossa un paio di guanti di gomma in lattice usa e getta.

Prima della puntura della pelle, il paziente deve scaldare le mani. Il dito viene massaggiato notevolmente per arricchire il flusso sanguigno verso il sito di puntura superiore. Quindi pulire la pelle del lato Palmer della punta, della falange distale del terzo o quarto dito della mano che non scrive con un disinfettante adatto, perforare la pelle con una lancetta di sicurezza monouso.

Le dita devono essere tenute in una posizione tale che la gravità faciliti la raccolta del sangue sulla punta del dito. Pulisci la prima goccia di sangue con una garza perché potrebbe contenere liquidi tissutali in eccesso. Dopo aver massaggiato nuovamente il dito per aumentare il flusso sanguigno nel sito di puntura, trasferire la goccia successiva su uno dei cerchi di una carta filtrante senza toccare la superficie direttamente con la punta del dito.

Lascia che la prossima grande goccia di sangue capillare si formi sulla punta del dito e raccoglila nel cerchio successivo. Continuare questa procedura fino a quando tutti i cerchi necessari non vengono riempiti o il flusso sanguigno si interrompe durante la raccolta. Lasciare che il sangue venga assorbito nella consistenza del filtro solo da forze capillari.

Non schiacciare o mungere eccessivamente il dito se il flusso sanguigno non è sufficiente a riempire tutti i cerchi richiesti della scheda del filtro. Se il flusso sanguigno si interrompe, posizionare una benda sulla punta del dito, eseguire una seconda puntura cutanea su un altro dito se è necessario più sangue per l'esame per asciugare le macchie di sangue, mettere le schede filtranti su un tovagliolo di carta pulito in un armadietto di sicurezza per rischi biologici e lasciarle asciugare, preferibilmente durante la notte a temperatura ambiente. In assenza di qualsiasi fonte esterna di calore, quando il processo di essiccazione è completo, le macchie di sangue hanno un colore brunastro uniformemente scuro e non sono più visibili aree rosse per la conservazione.

Metti la carta da filtro in un unico sacchetto con cerniera impermeabile ai gas contenente una o due bustine di essiccante per proteggere i campioni dall'umidità. Trasferisci questo sacchetto in un congelatore con una temperatura di meno 20 gradi Celsius o inferiore il prima possibile. Se i congelatori non sono disponibili in condizioni di campo, la conservazione a meno quattro gradi Celsius o anche a temperatura ambiente è possibile per un massimo di 14 giorni.

Perforare un punto con un dispositivo monouso da sei millimetri da ciascun cerchio imbevuto di sangue del trasferimento di carta filtrante di grado 9 0 3, tutti i punti di sangue essiccato perforati da un singolo paziente a un pozzetto dei 12. Riempire il pozzetto con soluzione salina tamponata con fosfato contenente lo 0,05% di intersezione 20 e lo 0,08% di azoturo di sodio. Ripetere questi passaggi per ottenere una seconda serie di EIT a macchie di sangue essiccato al fine di eseguire analisi molecolari.

Quindi mettere la piastra di coltura cellulare su un agitatore da laboratorio e lasciare che le macchie di sangue essiccate dal punch eluiscano delicatamente per un minimo di quattro ore o preferibilmente durante la notte. Il giorno successivo, le macchie sono quasi prive di sangue e si sono formati surnatanti emolitici. Trasferire questi EIT in provette da microcentrifuga, quindi sottoporle a centrifugazione per due minuti a 10, 500 volte G per liberarle.

I surnatanti di tutti i detriti che si erano formati durante le EIT centrifugate Elluciane sono ora pronti per essere utilizzati per le analisi previste. La prima serie di EIT viene trasferita in coppette per i test sierologici. La seconda serie viene trasferita in microprovette per l'analisi PCR.

Esaminare gli EIT per i marcatori del virus dell'epatite B, del virus dell'epatite C e dell'infezione da HIV utilizzando i test disponibili in commercio e seguire attentamente le istruzioni del rispettivo produttore. Infine, i risultati dei test sierologici sull'analizzatore completamente automatizzato vengono visualizzati sullo schermo del sistema. L'efficacia del protocollo suggerito per la preparazione e il trattamento di macchie di sangue essiccato è stata valutata per la prima volta analizzando 1.762 coppie di macchie di sangue essiccato di siero accoppiato rispetto alle determinazioni dell'antigene di superficie del virus dell'epatite B.

Il protocollo di analisi è stato modificato perché con un valore di cutoff di 0,05 unità internazionali per millilitro, il 56,2% degli EIT era reattivo rispetto ai risultati ottenuti da Sarah. Ciò corrispondeva a un tasso di falsi positivi del 14,7% nei test antigenici di superficie del virus dell'epatite B. L'analisi delle caratteristiche operative del ricevitore dei dati ha indicato che un aumento della soglia a 0,15 unità internazionali per millilitro comporterebbe una separazione ideale dei positivi all'antigene di superficie del virus dell'epatite B dai negativi all'antigene di superficie del virus dell'epatite B quando si esaminano le coppie di macchie di sangue essiccato nel siero per la presenza dell'antigene di superficie del virus dell'epatite B, Sono stati ottenuti solo due discrepanti.

I due Sarah falsamente negativi provenivano da pazienti in trattamento antivirale. La determinazione qualitativa di H-B-V-D-N-A mediante PCR in tempo reale da EIT di sangue intero ha prodotto una sensibilità del 93%Pertanto, sette campioni con basse concentrazioni sieriche di H-B-V-D-N-A non sono stati rilevati. Solo quattro risultati anti-HCV falsamente negativi sono stati determinati da EIT a macchie di sangue essiccato.

I rispettivi C sono stati molto probabilmente prelevati da pazienti le cui infezioni erano state risolte da tempo. La sensibilità analitica del 100% per le determinazioni H-C-V-R-N-A da EIT spot di sangue essiccato ha indicato l'eccellente sensibilità dell'approccio di amplificazione mediata dalla trascrizione isotermica, che è stato utilizzato per l'amplificazione H-C-V-R-N-A. Anche la rilevazione di anticorpi anti HIV nelle EIT a macchie di sangue essiccato con un sistema completamente automatizzato ha portato a una sensibilità analitica del 100%Questo video mostra che oggi è possibile rilevare in modo affidabile marcatori sierologici e molecolari delle infezioni da epatite B, epatite C e HIV in tutte le macchie di sangue strette, anche quando viene utilizzato un volume di eluizione relativamente elevato e vengono modificate i protocolli di saggio stabiliti per le indagini su siero o plasma non è cambiato in modo considerevole.

Tuttavia, i risultati comunicati hanno anche confermato i limiti intrinseci della tecnica delle macchie di sangue essiccate. In alcuni casi. Il protocollo delineato è stato anche testato in condizioni di campo su 534 consumatori attivi di droghe nelle città tedesche di Berlino ed Essen durante la fase pilota dei farmaci in studio e delle malattie infettive croniche.

I risultati ottenuti hanno portato a una piccola modifica dell'algoritmo di test per la fase principale dello studio del farmaco in altre sei grandi città tedesche.