Name: Elettrofilate nanofibre Ponteggi con gradazioni Organizzazione Fiber (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Scopri la fabbricazione di ponteggi nanofibrosi con organizzazione graduata delle fibre mediante elettrofilatura. Questo metodo utilizza policaprolattone per regolare morfologia e orientamento cellulare in applicazioni biomediche e ingegneria tissutale.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dai fondi di avvio della University of Nebraska Medical Center e National Institute of Health (codice di autorizzazione 1R15 AR063901-01).

1. Preparazione della soluzione <ol><li> Preparare una soluzione di poli (ε-caprolattone) (PCL) (M w = 80,000 g / mol) ad una concentrazione approssimativa di 100 mg / ml. Sciogliere PCL in una miscela di diclorometano (DCM) e N, N-dimethlyformamide (DMF) con un rapporto di 4: 1 (v / v) con una concentrazione del 10% (w / v). </li><li> Porre la soluzione in un tubo di vetro da 20 ml per la miscelazione. Mettere tubo di vetro in ultrasuoni per 30 minuti, o fino a quando la soluzione è trasparente. </li></ol> 2. Apparecchiatura Preparazione <ol><li> Aggiungere la soluzione PCL preparata in una siringa da 5 ml con un ago senza punta 21 gauge collegato. </li><li> Inserire pompa a siringa in posizione electrospinning verticale di figura 1. </li><li> Utilizzare un collettore in acciaio inox-gap con uno spazio aperto di 2 cm x 5 cm per il substrato di fibre allineate. Posizionare il collettore 12 centimetri dalla punta dell&#39;ago. </li><li> Collegare la corrente continua (DC) ad alta tensione di alimentazione alago e terra il collettore. Assicurarsi che il collettore è individualmente a terra senza contatto per le altre apparecchiature di laboratorio. </li></ol> 3. Electrospinning <ol><li> Set pompa a siringa a 1.50 ml / h, fino a quando le goccioline che formano sulla punta dell&#39;ago vengono immediatamente sostituiti quando viene rimosso. Quindi, impostare la portata di 0,50 ml / h. </li><li> Girare l&#39;operatore tensione di 12 kV. </li><li> Electrospin fino a quando le fibre uniaxially allineate coprire completamente il gap sul collettore. </li><li> Applicare la colla ai bordi di una piccola lastra di vetro e trasferire le fibre dal collettore gap alla lastra di vetro. Posizionare la lastra di vetro nella parte superiore di un pezzo di foglio di alluminio che ha la stessa dimensione della lastra di vetro ed è messo a terra. </li><li> Posizionare il secondo collettore siringa secondo la figura 3. </li><li> Fissare la maschera di plastica per la seconda pompa siringa e posizione it 2 mm sopra il collettore. </li><li> Aggiungi cumarina 6 a 1% (w / w) per il PCL soluzione se nanoencapsulation è desired- e mescolare fino a quando la soluzione è trasparente. </li><li> Caricare il PCL o PCL / cumarina 6 soluzione in un ago 5 ml con un ottuso ago 21 gauge. Impostare pompa verticale a 0,50 ml / hr e orizzontale per tirare 9 ml / hr o ad una velocità di circa 1 mm / min. </li><li> Electrospin finché la maschera è spostato quasi completamente fuori dal collettore, ma con la zona di bordo ancora sotto la maschera. </li></ol> 4. Fiber Caratterizzazione <ol><li> I campioni con nastro adesivo conduttivo biadesivo al perno metallico e il cappotto con platino per 40 sec con una verniciatura polverizzazione a 40 mA. <ol><li> Esaminare fibre attraverso microscopio elettronico a scansione (SEM) secondo i nostri studi precedenti 17,18. </li><li> Raccogliere immagini ad una tensione di accelerazione di 15 kV. </li></ol></li><li> Eseguire l&#39;analisi rapida di Fourier (FFT) su un campione di fibra separato per misurare l&#39;allineamento fibra. Le informazioni dettagliate su allineamento delle fibre di misura da FFT può riferirsi to studi precedenti 19,20. </li></ol> 5. Cellule staminali Seeding. <ol><li> Sterilizzare i campioni di fibre immergendola in una soluzione di etanolo al 70% per 2 ore. Quindi lavare le fibre con acqua distillata per rimuovere eventuali contaminanti. </li><li> Ottenere ADSCs umane e cellule di coltura in una beuta da 25 cm 2 a 37 ° C in atmosfera di 95% aria / 5% CO 2. Modificare il terreno di coltura cellulare a giorni 10. </li><li> Trypsinize cellule e contare il numero di cellule. Specificamente, rimuovere tutto terreno di coltura dal pallone di coltura cellulare e lavare le cellule con tampone fosfato salino (PBS) due volte. Poi aggiungere 1 m l di una soluzione 0,25% tripsina-EDTA (pre-caldo in bagno d&#39;acqua a 37 ° C) per coprire il monostrato cellulare e incubare la beuta nell&#39;incubatrice coltura cellulare per 2-3 minuti. Aggiungere 4 ml terreno di coltura e lavare tutte le cellule dalla superficie pipettando il mezzo su tutta la superficie. Centrifugare la sospensione cellulare e ri-disperse esimoe pellet di cellule nel mezzo di coltura. Contare le celle tramite emocitometro. Seed circa 1 × 10 4 celle al patibolo nanofibre collocato in un piatto -Cultura 35 millimetri e incubare per 3 e 7 giorni. </li><li> Cellule macchia con fluoresceina diacetato (5 mg / ml in acetone) (FDA) allora l&#39;immagine dei campioni utilizzando un microscopio a fluorescenza. In particolare, aggiungere 100 ml di soluzione FDA al piatto cultura e incubare per 30 min. Lavare le cellule con PBS per tre volte prima di imaging fluorescente. Analizzare l&#39;orientamento delle cellule da un programma personalizzato mat-lab in base alle nostre precedenti studi 10. </li></ol>

<ol><li>Xie, J., Li, X., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+electrospun+nanofibers+to+work+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">Putting electrospun nanofibers to work for biomedical research.</a> Macromol. Rapid Commun. 29 (22), 1775-1792 (2008).</li>
<li>Genin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+grading+of+mineral+and+collagen+in+the+attachment+of+tendon+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Functional grading of mineral and collagen in the attachment of tendon to bone.</a> Biophys. J. 97 (4), 976-985 (2009).</li>
<li>Thomopoulos, S., Marquez, J. P., Weinberger, B., Birman, V., Genin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fiber+orientation+at+the+tendon+to+bone+insertion+and+its+influence+on+stress+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Collagen fiber orientation at the tendon to bone insertion and its influence on stress concentrations.</a> J. Biomech. 39 (10), 1842-1851 (2006).</li>
<li>Thomopoulos, S., Williams, G. R., Gimbel, J. A., Favata, M., Soslowsky, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+biomechanical%2C+structural%2C+and+compositional+properties+along+the+tendon+to+bone+insertion+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Variation of biomechanical, structural, and compositional properties along the tendon to bone insertion site.</a> J. Orthop. Res. 21 (3), 413-419 (2003).</li>
<li>Thomopoulos, S., Genin, G. M., Galatz, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+morphogenesis+of+the+tendon-to-bone+insertion+-+What+development+can+teach+us+about+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Musculoskelet+Neuronal+Interact%22%5BJournal%5D)">The development and morphogenesis of the tendon-to-bone insertion - What development can teach us about healing.</a> Musculoskelet Neuronal Interact. 10 (1), 35-45 (2010).</li>
<li>Li, X., Xie, J., Lipner, J., Yuan, X., Thomopoulos, S., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofiber+scaffolds+with+gradations+in+mineral+content+for+mimicking+the+tendon-to-bone+insertion+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site.</a> Nano Lett. 9 (7), 2763-2768 (2009).</li>
<li>Kunzler, T. P., Huwiler, C., Drobek, T., Vörös, J., Spencer, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+study+of+osteoblast+response+to+nanotopography+by+means+of+nanoparticle-density+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Systematic study of osteoblast response to nanotopography by means of nanoparticle-density gradients.</a> Biomaterials. 28 (33), 5000-5006 (2007).</li>
<li>Huwiler, C., Kunzler, T. P., Textor, M., Vörös, J., Spencer, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalizable+nanomorphology+gradients+via+colloidal+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Functionalizable nanomorphology gradients via colloidal self-assembly.</a> Langmuir. 23 (11), 5929-5935 (2007).</li>
<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Aligned-to-random%27+nanofiber+scaffolds+for+mimicking+the+structure+of+the+tendon-to-bone+insertion+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">'Aligned-to-random' nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site.</a> Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).</li>
<li>Xie, J., Ma, B., Michael, P. L., Shuler, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+nanofiber+scaffolds+with+gradations+in+fiber+organization+and+their+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Fabrication of nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and their potential applications.</a> Macromol. Biosci. 12 (10), 1336-1341 (2012).</li>
<li>James, R., Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Balian, G., Chhabra, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon+tissue+engineering%3A+adipose-derived+stem+cell+and+GDF-5+mediated+regeneration+using+electrospun+matrix+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Mater%22%5BJournal%5D)">Tendon tissue engineering: adipose-derived stem cell and GDF-5 mediated regeneration using electrospun matrix systems.</a> Biomed. Mater. 6 (2), 025011(2011).</li>
<li>Bodle, J. C., Hanson, A. D., Loboa, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+in+functional+bone+tissue+engineering%3A+lessons+from+bone+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells in functional bone tissue engineering: lessons from bone mechanobiology.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 195-211 (2011).</li>
<li>Lee, J. H., Rhie, J. W., Oh, D. Y., Ahn, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+human+adipose+tissue-derived+stromal+cells+%28hASCs%29+in+a+porous+three-dimensional+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stromal cells (hASCs) in a porous three-dimensional scaffold.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 370 (3), 456-460 (2008).</li>
<li>Tapp, H., Hanley, E. N., Patt, J. C., Gruber, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+characterization+and+current+application+in+orthopaedic+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: characterization and current application in orthopaedic tissue repair.</a> Exp. Biol. Med. 234 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Gimble, J. M., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+adult+stem+cells%3A+isolation%2C+characterization%2C+and+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential.</a> Cytotherapy. 5 (5), 362-369 (2003).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).</li>
<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiation+of+embryonic+stem+cells+seeded+on+electrospun+nanofibers+into+neural+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The differentiation of embryonic stem cells seeded on electrospun nanofibers into neural lineages.</a> Biomaterials. 30 (3), 354-362 (2009).</li>
<li>Xie, J., MacEwan, M. R., Li, X., Sakiyama-Elbert, S. E., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+on+nanofiber+scaffolds+with+different+orders%2C+structures%2C+and+surface+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth on nanofiber scaffolds with different orders, structures, and surface properties.</a> ACS Nano. 3 (5), 1151-1159 (2009).</li>
<li>Ayres, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+anisotropy+in+electrospun+tissue+engineering+scaffolds%3A+analysis+of+fiber+alignment+by+the+fast+Fourier+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modulation of anisotropy in electrospun tissue engineering scaffolds: analysis of fiber alignment by the fast Fourier transform.</a> Biomaterials. 27 (32), 5524-5534 (2006).</li>
<li>Ayres, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+fiber+alignment+in+electrospun+scaffolds%3A+a+user%E2%80%99s+guide+to+the+2D+fast+Fourier+transform+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.+Poly.+Ed%22%5BJournal%5D)">Measuring fiber alignment in electrospun scaffolds: a user’s guide to the 2D fast Fourier transform approach.</a> J. Biomater. Sci. Poly. Ed. 19 (5), 603-621 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La parte più critica del protocollo è la generazione dello scaffold del gradiente. È imperativo che la maschera che copre il collettore si muova a una velocità costante in modo che vi sia un cambiamento graduale all'interno dell'impalcatura di fibre. Anche la corretta preparazione della soluzione PCL è importante per garantire il successo dell'elettrofilatura. Si consiglia di controllare la morfologia delle fibre prima dell'elettrofilatura, soprattutto dopo l'incapsulamento della cumarina-6, che potrebbe richiedere una t...

Nanofibre sono un&#39;utilità popolare per ingegneria tissutale a causa della loro capacità di mimare la matrice extracellulare nella sua struttura e dimensione relativa 1. Tuttavia, alcune interfacce tessuto nativo, come il sito tendine-osso, contengono fibre collagene, che presentano una struttura organizzativa variabile che aumenta in allineamento verso il tendine e diminuisce al sito osseo 2-5. Così, per la rigenerazione tissutale efficace è necessario per fabbricare un ponteggio che potrebbe efficacemente imitare questo gradiente strutturale. In precedenza, vi è stata una ricerca condotta sui cambiamenti graduali nella composizione delle fibre, in particolare, il contenuto di minerali 6. Tuttavia, ricreando la componente strutturale dei tessuti connettivi rimane in gran parte inesplorato. Uno studio precedente esaminato gradienti morfologiche studiando l&#39;effetto della silice superficie densità di particelle sulla proliferazione degli osteoblasti ratto cranica e trovato un inverrapporto tra la densità se particella di silice e la proliferazione cellulare 7. Ma i cambiamenti morfologici che mediate proliferazione cellulare in lavori precedenti erano per lo più relativi alla rugosità superficiale manca la capacità di mimare fibra cambiamenti organizzativi 7,8. Uno studio recente ha tentato di realizzare un ponteggio che imitava gli orientamenti fibre collagene unici utilizzando un nuovo collettore per electrospinning 9. Anche se questo studio è riuscito a produrre un ponteggio con fibre sia allineate e casuale, non è riuscito a imitare i graduali cambiamenti esposti nei tessuti nativi. Inoltre, nella produzione di componenti separati, con un cambiamento immediato dal allineato all&#39;orientamento casuale, le proprietà biomeccaniche di questa impalcatura è diminuito in modo significativo. Nessun lavoro precedente è stato in grado di produrre applicabili ponteggi nanofibre con continui gradazioni orientamenti fibra di allineato e casuali. Il nostro recente studio ha dimostrato con successo la ricreazione di ponteggi nanofibrecon gradazioni nell&#39;organizzazione fibra che può potenzialmente mimare l&#39;organizzazione collagene nativo all&#39;inserimento di 10 tendine-osso. Questo lavoro si propone di presentare i protocolli utilizzati per la produzione di scaffold nanofibre con una struttura molto simile a quella di organizzazione fibre nell&#39;interfaccia nativa tendine-osso tessuti. Strutture nanofibre gradiente sono potenzialmente di vasta portata applicazioni attraverso una varietà di campi. Ci siamo concentrati sulle applicazioni per l&#39;ingegneria tissutale del sito di tendine-osso combinando le nostre impalcature con le cellule staminali derivate da tessuto adiposo (ADSCs) che sono già utilizzate per la rigenerazione dei tessuti su vari substrati 11-14. Inoltre, ADSCs sono molto simili in natura per le cellule staminali del midollo osseo in termini di multipotenza e la loro risorsa è abbondante che può essere raccolto mediante una semplice procedura di liposuzione 15,16. Semina queste cellule per ponteggi nanofibre sfumati aumenta ulteriormente la loro tiscitare applicazioni ingegneristiche consentendo la distribuzione controllata delle cellule che possono potenzialmente differenziarsi in vari tessuti. Oltre a seminare le cellule staminali, nanofibre possono essere incapsulati con molecole di segnalazione per la regolazione della risposta cellulare. Accoppiamento nanoencapsulation con il gradiente organizzativa di tali ponteggi consente lo studio del comportamento cellulare o possibili disegni implantari e rivestimenti. Incapsulamento di molecole funzionali come proteina morfogenetica 2 (BMP2), che ha dimostrato di indurre la differenziazione degli osteoblasti 15,16, potrebbe migliorare ulteriormente le applicazioni di ingegneria tissutale di questi ponteggi 10.

<table><tbody><tr><td>Policaprolattone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440744</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimettaliformammide</td><td>Fisher Chemical</td><td>D-119-1</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Fisher Chemical</td><td>AC61093-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cumarina 6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>546283</td><td></td></tr><tr><td>Cellule staminali derivate dal adiposo</td><td>Tecnologie di ingegneria cellulare</td><td>HMSC. AD-100</td><td></td></tr><tr><td>Fetale Siero Bovino Tecnologie</td> di <td>Vita</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina Diacetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-Modificato Eagle's</td><td>Medium Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>s25120a</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Invitrogen</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>vetrini VWR</td><td>international, LLC</td><td>101412-842</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-831-200</td><td>Siringa singola</td></tr><tr><td>Pulitore ad ultrasuoni</td> Alimentatore CC <td></td><td></td> ad alta tensione Branson 1510 <td></td></tr><tr><td></td><td>Gamma High Voltage Research</td><td>ES30</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione</td><td>FEI</td><td>Nova 2300</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager 2</td><td></td></tr></tbody></table>

elettrofilate nanofibre ponteggi con gradazioni organizzazione fiber

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

L'obiettivo di questo protocollo è quello di riportare un metodo semplice per generare scaffold di nanofibre con gradazioni nell'organizzazione delle fibre e testare le loro possibili applicazioni nel controllo della morfologia/orientamento cellulare. L'organizzazione delle nanofibre è controllata con un nuovo apparato di fabbricazione che consente la graduale diminuzione dell'organizzazione delle fibre in un'impalcatura. La modifica dell'allineamento delle fibre si ottiene diminuendo il tempo di deposizione di fibre elettrofilate casuali su un tappetino di fibre allineate uniassialmente. Coprendo il collettore con una barriera/maschera mobile, lungo lo stesso asse della deposizione delle fibre, la struttura organizzativa è facilmente controllabile. Per scopi di ingegneria tissutale, le cellule staminali di derivazione adiposa possono essere seminate in questi scaffold. Le cellule staminali subiscono cambiamenti morfologici a causa della loro posizione nella variegata struttura organizzativa e possono potenzialmente differenziarsi in diversi tipi di cellule a seconda della loro posizione. Inoltre, l'organizzazione graduale delle fibre migliora la biomimetica degli scaffold in nanofibra in modo che assomiglino più da vicino agli orientamenti naturali delle nanofibre di collagene nel sito di inserimento tendine-osso rispetto agli scaffold tradizionali. Attraverso la nanoincapsulazione, le fibre graduate offrono anche la possibilità di costruire gradienti chimici negli scaffold delle fibre, e quindi di rafforzare ulteriormente le loro potenziali applicazioni nello screening rapido dell'interazione cellula-materiale e della rigenerazione dei tessuti interfacciali. Questa tecnica consente la produzione di scaffold a gradiente continuo, ma può anche potenzialmente produrre fibre in passaggi discreti controllando il movimento della barriera/maschera in movimento in modo discreto.

Usando questo protocollo, si è formata una stuoia in fibra con pendenza organizzativa. La figura 3 mostra le immagini SEM scattate in varie posizioni sul patibolo nanofibre. Qualitativamente, si può determinare che esiste una progressione da fibre uniaxially allineate a 0 mm (Figura 3A) ad una fibra assortimento casuale a 6 mm (Figura 3D). La FFT dà un valore quantitativo per l&#39;allineamento delle fibre, specifiche sui processi quantitativi sono dettagliate qui ...

Qui, vi presentiamo un protocollo per fabbricare scaffold elettrofilate nanofibre con organizzazione sfumati di fibre e di esplorare le loro applicazioni nella regolazione della morfologia delle cellule / orientamento. Gradienti per quanto riguarda le proprietà fisiche e chimiche dei ponteggi nanofibre offrono un&#39;ampia varietà di applicazioni in campo biomedico.

Elettrofilate nanofibre Ponteggi con gradazioni Organizzazione Fiber

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Questa tecnica di fabbricazione consente la produzione di impalcature in nanofibre con un gradiente nell'organizzazione delle fibre. Un'organizzazione graduata offre un'utilità aumentata delle impalcature in nanofibre nel campo biomedico. L'elettrofilatura offre la capacità di produrre impalcature in fibre su scala nanometrica con ampie superfici. La fabbricazione avviene combinando un polimero con un solvente volatile, quindi spostando tale soluzione a velocità costante attraverso una siringa con un'elevata tensione applicata che carica la soluzione e allunga il polimero man mano che viene rilasciato dalla punta dell'ago. Il risultato è una fibra polimerica su scala nanometrica, asciutta, che può essere raccolta in diversi modi per varie applicazioni. In questo protocollo, abbiamo prodotto un polimero di policaprolattone su un collettore a gap per formare un substrato di fibre allineate parallelamente.Successivamente abbiamo utilizzato una maschera in movimento graduale per coprire questo substrato mentre venivano depositate fibre casuali di PCL. Ciao, mi chiamo Carl Kalala. Del laboratorio del Dott. Xing.Siamo del Dipartimento di Scienze Farmaceutiche e del programma Holland di Medicina Rigenerativa presso il Centro Medico dell'Università del Nebraska. Oggi illustreremo il protocollo per la fabbricazione di un impalcatura di nanofibre con un gradiente organizzativo. Inoltre, mostreremo le applicazioni biomediche di queste impalcature mediante nano-incapsulamento e semina di cellule staminali.Prima di tutto, assicurarsi di indossare l'equipaggiamento di sicurezza adeguato quando si maneggiano sostanze chimiche potenzialmente pericolose. Il primo passaggio di questo procedimento consiste nel preparare una soluzione di policaprolattone o PCL a una concentrazione approssimativa di 100 milligrammi per millilitro. Sciogliere il policaprolattone in una miscela di diclorometano e dimetilformammide in un rapporto di quattro a uno in volume su volume per ciascun solvente, ottenendo una concentrazione complessiva del 10% peso in volume per la miscela della soluzione, fino a quando la soluzione diventa traslucida e omogenea con una viscosità appropriata.Aggiungere la soluzione di PCL in una siringa da cinque millilitri con un ago ottuso da 21 gauge. Posizionare una singola pompa per siringa in una posizione verticale per la elettrofilatura, con il collettore direttamente al di sotto della pompa per siringa a massa. Assicurarsi che il collettore sia collegato individualmente a massa senza contatto con altri apparecchi di laboratorio.Per un efficiente deposito delle fibre, impostare la pompa a siringa su una portata relativamente elevata per preparare l'ago all'elettrofilatura. Far funzionare la pompa fino a quando le gocce che si formano alla punta dell'ago vengono immediatamente sostituite. Una volta rimossa, per l'elettrofilatura, impostare la pompa a 0,5 millilitri all'ora.Regolare l'operatore di tensione a 12 chilovolt. Attenzione, poiché questa alta tensione può essere molto pericolosa: evitare qualsiasi vicinanza. Con la punta dell'ago, utilizziamo un'estensione non conduttiva per gestire eventuali ostruzioni o fibre estranee che potrebbero verificarsi sulla punta dell'ago o sul collettore.Le fibre dovrebbero iniziare ad apparire lungo il gap sul collettore. Continuare l'elettrofilatura fino a quando non si è formata una matrice di fibre relativamente spessa. Lungo il gap sul collettore, applicare colla ai bordi di una piccola piastra di vetro.Le dimensioni della piastra dovrebbero essere leggermente inferiori rispetto al collettore con le fibre allineate, in modo che lo scaffold venga efficacemente rimosso. Rimuovere eventuali fibre in eccesso che potrebbero essersi accumulate sulla parte anteriore del collettore. Quindi posizionare il collettore sul vetro in modo che la matrice di fibre entri in contatto completo con la piastra.Pressare leggermente il supporto per assicurare che le fibre siano a diretto contatto con la colla. Lasciare il supporto a riposo fino a quando la colla non sarà completamente asciutta. Una volta asciutta la colla, tagliare con cura lungo i bordi incollati del supporto, in modo che una sezione del materassino allineato rimanga immobilizzata sulla piastra di vetro.Il risultato dovrebbe apparire simile a questo, con lo scaffold in fibra immobilizzato su tre lati per la deposizione secondaria. Se si desidera un'incapsulazione chimica, aggiungere Kumar e sei. Aggiungere una concentrazione dello 1% in peso al peso alla soluzione di PCL. Mescolare fino a quando la soluzione risulti omogenea e presenti un colore verde fluorescente per la preparazione del gradiente.Posizionare la seconda pompa per siringa perpendicolarmente alla prima pompa e al collettore. Fissare una maschera di plastica alla seconda pompa per siringa e posizionarla approssimativamente a due millimetri sopra il collettore. Preparare l'ago utilizzando un'elevata velocità di flusso.Quando le fibre iniziano a depositarsi sopra il collettore, impostare la pompa per siringa orizzontale in modo da aspirare a nove millilitri all'ora o a una velocità di avanzamento approssimativa di un millimetro al minuto. Procedendo con l'esperimento, dovrebbero rendersi visibili sempre più fibre casuali sullo scaffold allineato. Coloranti come Kumar e sei migliorano notevolmente questa rappresentazione del gradiente visivo.Man mano che la deposizione delle fibre procede, le nanofibre inizieranno a depositarsi al di fuori dell'intervallo desiderato del collettore. Rimuovere queste fibre utilizzando un'asta non conduttiva in modo che non interferiscano con la formazione elettrostatica del telaio di fibre finché la maschera non si sarà spostata quasi completamente dal collettore. Assicurarsi di lasciare una piccola quantità del telaio di fibre allineate sotto la maschera.Lo scaffold finito deve presentare parti costitutive distinte, allineate e casuali, visualizzate qui con il deposito casuale in verde e le fibre allineate in bianco. Una transizione graduale da un'organizzazione casuale a un allineamento unidirezionale delle fibre deve essere evidente nella zona intermedia dello scaffold. Eseguire una coltura cellulare standard con cellule staminali derivate da un depose. Quindi seminare le cellule sugli scaffold fibrosi e incubare a 37 gradi Celsius per due ore.Dopo due ore di incubazione, aggiungere ulteriore coltura cellulare sui supporti fibrosi finché non sono sufficientemente ricoperti dal mezzo. Quindi incubare due campioni a 37 gradi Celsius rispettivamente per tre e sette giorni. Queste sono immagini al microscopio elettronico a scansione acquisite a incrementi di due millimetri.Sul supporto. È presente una chiara progressione da fibre allineate a fibre casuali sul supporto. I modelli di trasferimento rapido a quattro anni confermano questa progressione, poiché il modello a zero millimetri indica un allineamento, mentre il modello a sei millimetri indica un'orientazione casuale derivante dalla coltura di cellule staminali.Sono state acquisite due serie di immagini al microscopio fluorescente. Entrambe indicano diverse orientazioni cellulari, mediate dalla posizione delle cellule adese. Sullo scaffold di tipo alliance.Il 70% delle cellule si trova entro 20 gradi rispetto all'asse di fabbricazione, rispetto al solo 20% delle cellule nella porzione casuale dell'impalcatura. La formazione di un gradiente chimico mediante nano-incapsulamento viene esaminata attraverso immagini al microscopio fluorescente. Il grafico dell'intensità fluorescente mostra un incremento lineare, indicativo di un cambiamento graduale della concentrazione chimica attraverso l'impalcatura.Prodotti chimici come la proteina morfogenetica dell'osso due possono essere incapsulati in questo modo per promuovere la differenziazione osteoblastica nell'ingegneria tissutale. Il nostro obiettivo finale è sviluppare un costrutto tissutale che combini una classe unica di impalcature con gradazioni doppie nell'organizzazione strutturale e nel contenuto minerale. Questa combinazione può ricreare completamente il sito di inserzione nativo tra tendine e osso. L'inclusione di un'inoculazione di cellule staminali derivate da D post dovrebbe consentire una riparazione migliorata delle lesioni della cuffia dei rotatori.Oggi abbiamo presentato il protocollo per la produzione di un impalcatura in nanofibre con un gradiente nella struttura organizzativa e ne abbiamo spiegato le potenziali applicazioni biomediche. La parte più critica di questo protocollo è il deposito secondario casuale sull'impalcatura allineata, necessario per creare il gradiente strutturale durante la preparazione del gradiente; osservare attentamente la punta dell'ago e il collettore, rimuovendo eventuali goccioloni sulla punta dell'ago o fibre estranee sul collettore, al fine di garantire un'impalcatura uniforme.

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