Derivazione di Cardiomyocytes altamente purificato da cellule staminali umane pluripotenti indotte utilizzando piccoli Differenziazione Molecola-modulato e successiva glucosio Starvation

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere una popolazione purificata di cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. Innanzitutto, le cellule staminali pluripotenti indotte umane vengono coltivate in un monostrato cellulare fino a raggiungere una confluenza di circa l'85%. Viene quindi aggiunto un composto a piccole molecole che attiva la via di segnalazione cellulare Wnt e le cellule vengono incubate per due giorni per indurre la formazione del mesoderma.

Successivamente, viene aggiunto alle cellule un composto di piccole molecole che inibisce la via di segnalazione cellulare Wnt al fine di indirizzarne la differenziazione verso il mesoderma cardiaco. Le cellule vengono quindi incubate per altri due giorni. Al giorno sette, i cardiomiociti differenziati iniziano a contrarsi; la popolazione eterogenea di cellule differenziate viene quindi incubata in un mezzo di coltura cellulare a basso contenuto di glucosio per purificare in modo selettivo i cardiomiociti.

Infine, le cellule vengono ispezionate visivamente al microscopio ottico e analizzate mediante citometria a flusso per confermare la produzione di una popolazione altamente purificata di cardiomiociti contrattili. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri protocolli di differenziazione dei cardiomiociti che utilizzano molecole di piccole dimensioni è che prevede un ulteriore passaggio di deprivazione del glucosio. Questo ci permette di purificare i cardiomiociti, che sono in grado di utilizzare fonti di energia cellulare diverse dal glucosio.

I non cardiomiociti possono essere eliminati selettivamente da questa popolazione eterogenea di cellule differenziate. I cardiomiociti possono quindi essere utilizzati per scopi successivi, come la modellizzazione di malattie in vitro o la scoperta ad alto rendimento di farmaci. Saggi Preparare per questo esperimento piastre a sei pozzetti rivestite con soluzione di matrice extracellulare o ECMS e scongelare una provetta di cellule staminali pluripotenti indotte umane congelate, o HI PSCs, come descritto nel testo allegato.

Dopo la centrifugazione e la risospensione, sospendere le cellule scongelate in E otto con inibitore della ROCK. Quindi trasferire il contenuto della provetta in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti pre-ricoperta con ECMS. Collocare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Dopo 24 ore, le cellule si saranno attaccate. Sostituire il mezzo con mezzo E otto senza inibitore di rock. Continuare a coltivare le cellule e sostituire il mezzo E otto ogni giorno.

Quando le HI PSC raggiungono una confluenza del 75-80%, è il momento di passarle. Aspirare rapidamente il mezzo di coltura. Lavare le pozzette con un millilitro di PBS sterile a temperatura ambiente ed aspirare il PBS.

Quindi aggiungere 500 microlitri di EDTA 0,5 millimolare o un’altra soluzione di distacco cellulare. Incubare per uno a sette minuti a temperatura ambiente, monitorando al microscopio il distacco cellulare quando si osserva l’arrotolamento o l’ispessimento visibile delle colonie ai margini; quindi aspirare la soluzione di distacco cellulare. Aggiungere poi un millilitro di mezzo E eight integrato con inibitore rock 10 micromolare, utilizzando una pipetta P 1000 per aspirare e dispensare ripetutamente in alto e in basso, al fine di staccare completamente le colonie di H-I-P-S-C dalla piastra, formando da cinque a dieci aggregati cellulari.

Quindi trasferire la sospensione in una provetta conica da 15 millilitri per disperdere ulteriormente le cellule grandi. Agglomerati, pipettare su e giù fino a quando si formano agglomerati più piccoli, come mostrato qui. Successivamente, diluire le cellule da uno a dodici aggiungendo 11 millilitri di mezzo E otto con inibitore rock alla sospensione cellulare da un millilitro.

Successivamente, aspirare l'ECMS dalle piastre pre-codificate. Aggiungere due millilitri di cellule risospese in ogni pozzetto, circa 100.000 cellule per pozzetto di una piastra a sei pozzetti è l'obiettivo ideale; cercare di distribuire le cellule in modo uniforme all'interno del pozzetto per evitare l'aggregazione delle cellule al centro. Posizionare la piastra nell'incubatore per 24 ore.

Il giorno successivo, sostituire il mezzo con E otto che non contiene l'inibitore rock. Cambiare il mezzo ogni 24 ore fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza dell'80%. In genere, le cellule sono pronte per un nuovo passaggio entro tre-sei giorni dopo la dissociazione con EDTA o una soluzione di distacco one Xcel; seminare circa 100.000 cellule staminali pluripotenti umane su piastre di coltura a sei pozzetti rivestite con ECM per la differenziazione.

Seguire gli stessi passaggi utilizzati per le PSC di tipo HI quando le cellule raggiungono una confluenza dell'85%, quindi passare al mezzo R-P-M-I-B 27 senza insulina, ma con sei micromolar del inibitore GSK tre beta. CHIR 9 9 0 2 1. Incubare le cellule per 48 ore e ogni giorno esaminarle al microscopio.

Potrebbero essere osservate quantità significative di morte cellulare dopo 24 ore di trattamento con CHIR. Questo fenomeno è normale e comunemente riscontrato dopo due giorni di trattamento. Le HIPS aumentano di dimensioni e numero e continuano a differenziarsi verso un destino mesodermico.

Sostituire il mezzo di coltura contenente CHIR con mezzo R-P-M-I-B 27 contenente insulina e incubare fino al terzo giorno. Al terzo giorno, cambiare il mezzo con R-P-M-I-B 27 senza insulina, aggiungere l'inibitore Wind IWR-1 alla concentrazione di cinque micromolar e incubare le cellule per 48 ore.

Al quinto giorno, esaminare le cellule al microscopio. Le cellule mesodermiche dovrebbero essere indirizzate verso la linea cardiaca e iniziare ad aggregarsi formando strutture caratteristiche simili a rami. Cambiare il mezzo con R-P-M-I-B 27 senza insulina e incubare le cellule per 48 ore.

Al settimo giorno. Sostituire il mezzo con R-P-M-I-B 27 contenente insulina ogni tre giorni a partire da allora; tra l'ottavo e il decimo giorno sostituire con lo stesso mezzo. Dopo 10 giorni di differenziazione, si osserverà il battito spontaneo dei cardiomiociti.

Oltre il 50% delle aree cellulari presenta battito. Tuttavia, le lamelle cellulari contrattili possono essere intercalate con cellule non cardiomiocitarie; al decimo giorno, le strutture ramificate saranno molto evidenti. I cardiomiociti completamente differenziati non prolifereranno oltre questo punto.

Al giorno 10. Dopo la differenziazione, sostituire il mezzo in ogni pozzetto della piastra a sei pozzetti con due millilitri di mezzo a basso contenuto di glucosio e mantenere le cellule in questo mezzo per tre giorni fino al giorno 13. Al giorno 13, riportare le cellule nel mezzo R-P-M-I-B 27 con insulina o, in alternativa, nel mezzo per la rigonfiamento delle cellule, che facilita la dissociazione dei non cardiomiociti durante la carenza di glucosio.

Aspirare il mezzo e lavare una volta con PBS. Aggiungere 500 microlitri di enzima di dissociazione cellulare e incubare le cellule per cinque minuti. Dopo cinque minuti di trattamento enzimatico, utilizzare una pipetta P1000 per disperdere manualmente i cardiomiociti in una sospensione monocellulare, pipettando su e giù fino a 30 volte; dopo la dissociazione delle cellule, trasferirle in un tubo conico da 15 millilitri.

Riempire con cinque millilitri di mezzo R-P-M-I-B 27 con insulina per diluire l'enzima di dissociazione cellulare; centrifugare per quattro minuti a 200 G. Dopo la centrifugazione, aspirare e scartare il soprannatante. Successivamente, risospendere le cellule in due millilitri di mezzo R-P-M-I-B 27 e seminare su una nuova piastra a sei pozzetti rivestita con ECMS. Tipicamente, la sopravvivenza cellulare aumenta con la confluenza, per una sopravvivenza cellulare ottimale.

Risospendere 2 milioni di cellule per pozzetto in una piastra a sei pozzetti per le cellule non ripiastrellate. Al quattordicesimo giorno, cambiare il mezzo tornando a due millilitri di mezzo a basso contenuto di glucosio per un secondo ciclo di coltura di privazione di glucosio. Le cellule rimangono in questo stato a basso contenuto di glucosio per altri tre giorni.

La maggior parte dei non cardiomiociti morirà il diciassettesimo giorno. Cambiare il mezzo con due millilitri di R-P-M-I-B 27 con insulina. Le cellule rimanenti saranno altamente purificate. Cardiomiociti.

Queste cellule possono essere utilizzate per l'analisi dell'espressione genica, lo screening di farmaci, l'analisi metabolica e vari altri saggi successivi per esaminare la purezza dei cardiomiociti dopo la differenziazione e la purificazione mediante il metodo della privazione di glucosio. Le cellule sono state caratterizzate mediante colorazione immunoistochimica per il marcatore dei cardiomiociti, la troponina cardiaca T (cTnT). La microscopia a fluorescenza di una popolazione non purificata di cellule differenziate ha rivelato che, sebbene molte cellule fossero positive per cTnT (mostrate in verde), numerose cellule non esprimevano cTnT, suggerendo la presenza di non cardiomiociti al giorno 13. Al contrario, dopo tre giorni di privazione di glucosio iniziata al giorno 10, quasi tutte le cellule erano positive per cTnT al giorno 13, indicando una purificazione efficace dei cardiomiociti a seguito della privazione di glucosio.

Questi dati sono stati ulteriormente confermati mediante analisi di citometria a flusso. Come indicato in rosso, circa il 50% delle cellule che non hanno subito la privazione di glucosio erano positive per NT due, mentre il 90% delle cellule sottoposte a privazione di glucosio erano positive per NT due.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come differenziare cellule staminali pluripotenti indotte umane in popolazioni altamente purificate di cardiomiociti. Queste cellule purificate possono essere prodotte in modo ad alto rendimento per una varietà di applicazioni in vitro successive. Quando si coltivano cellule staminali pluripotenti, ricordare che non devono essere lasciate crescere fino alla confluenza completa prima dell'induzione differenziativa.

Alcune linee di cellule staminali si differenziano meglio quando la confluenza iniziale delle cellule staminali pluripotenti è inferiore all'85%. Infine, alcune linee di cellule staminali potrebbero rispondere in modo più rapido o severo al passaggio di privazione di glucosio. Monitorare sempre questi parametri prima di lavorare con nuove linee di cellule staminali.